牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法，以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因，克隆至pGEM—T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21（DE3），在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定，gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21（DE3）中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后，Western-blotting和ELISA分析结果表明，这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应，可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu/67株gD基因的克隆及在大肠杆菌中的表达

用PCR方法从感染牛疱疹病毒Ⅰ型Bartha Nu／67株的MDBK细胞中扩增gD基因，将之克隆到pGEM-T Easy载体。根据对gD基因的结构分析，设计合成3对引物，以获得的克隆质粒为模板，PCR扩增gD胞外域基因，将之分别亚克隆到pGEX-4T-2和pET-32a表达载体中构建成表达质粒pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ、pET—gDQB、pET—gDHB，利用上述质粒分别转化大肠杆菌BL21和BL21（DE3），IPTG诱导后SDS—PAGE检测，结果pGEX-4T—gDQ、pGEX-4T—gDQB、pGEX-4T—gDHB和pET—gDQ四个表达质粒出现表达且符合预期大小，Western blot表明表达产物均有抗原性。     

一种检测奶样中布鲁氏菌抗体免疫层析方法的建立

通过制备脂多糖(LPS)并将其作为检测抗原,建立了一种检测奶样中布鲁氏菌抗体的酶联免疫层析方法。通过对处理方法和反应条件的优化,制备出敏感性高、特异性强的布鲁氏菌抗体检测试纸条。该试纸条敏感性为98.0%,抗体滴度为1:2~1:8,特异性为96.0%,且与其他常见病原无交叉反应,批内、批间重复性良好。保存期加速试验显示,该试纸条在2~30℃下可保存12个月;符合率验证显示,该方法与标准奶样的符合率达94.9%。上述结果表明,该检测方法具有敏感性高、特异性强以及方便、快捷等优点,适用于现场大批量检测,因而可应用于奶牛场布鲁氏菌病的快速诊断。     

内蒙古地区牛传染性鼻气管炎血清学调查

牛传染性鼻气管炎(Infectious Bovine Rhinotracheitis,IBR)是由牛疱疹病毒Ⅰ型(Bovine Herpesvirus-1,BHV-Ⅰ)引起的家养和野生牛的一种急性、热性、接触性传染病。临床表现形式多样,但以呼吸道症状为主,伴有结膜炎、流产、乳腺炎,有时诱发小牛脑炎等。急性IBRV呼吸道感染还可继发细菌性肺炎。此     

甘草的微生物转化

用一株产β-葡糖醛酸酶的菌种HC-12对中药甘草进行液体发酵转化。通过对菌种复合诱变以及应用系统数值化及灵敏值系统调控技术优化了发酵工艺最佳工艺为：采用HPLC技术证明了菌种HC-12对甘草发酵转化作用。经过柱层析及HPLC及^1H NMR鉴定分离得到甘草次酸纯品。     

牛传染性鼻气管炎病几种检疫方法的比较

牛传染性鼻气管炎是由牛传染性鼻气管炎病毒引起的传染性疾病,该病对养牛业危害极大。本论文对牛传染性鼻气管炎的各种诊断方法进行了系统比较,以便对该病的检疫提供参考。     

非洲猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

非洲猪瘟病毒p54蛋白在病毒感染与增殖过程中起重要作用.根据p54基因的核苷酸序列,设计并合成引物和用6-carboxy-fluorescein (6-FAM) 和tetramethyl-6-carboxyrhodamine (TAMRA) 荧光素标记Taq Man双水解探针,以构建的含p54基因的pET-p54重组质粒作为阳性模板,建立了ASFV检测的荧光定量PCR方法(已申请专利,专利号200910067620.6).结果表明,所建立的方法与含p54基因的模板质粒数呈现很好的相关性(R2=0.991),可检测出低于15个拷贝/μL的样品,灵敏度和特异性高,可作为出入境检验检疫部门对非洲猪瘟病毒的快速检测方法.     

牛传染性鼻气管炎的检疫及防控

本论文对牛传染性鼻气管炎的病原学、流行病学、临床症状、发病机理、诊断及防控措施进行了综述,为我国牛传染性鼻气管炎的防控工作提供参考依据.     

建立A72细胞进行猪传染性胃肠炎血清中和试验的研究

引进了一株狗直肠瘤细胞系A72，将该细胞株进行培养传代，用于猪传染性胃肠炎中和试验研究，与用传统的猪肾细胞系PK15进行的猪传染性胃肠炎血清中和试验对比，用ELISA对这2株细胞的中和试验结果进行验证。结果表明，运用A72进行的病毒繁殖，其毒价明显高于PK15，A72在血清中和试验结果上优于PK15，且由TGEV导致A72发生的病理改变明显强于PK15，猪TGE血清中和试验与酶联免疫吸附检测结果试验的重复性较好。     

BVDV-1 E2蛋白抗原表位的串联表达及其多克隆抗体的制备

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）与猪瘟病毒（CSFV）的E2蛋白具有部分同源性，可导致血清学交叉反应。为准确检测BVDV，排除CSFV的干扰，以柔性氨基酸（GSGS）将BVDV-1 NADL株E2蛋白的5个特异性抗原表位（E1～5）串联（E1-E1-GSGS-E2-E2-GSGS-E3-E3-GSGS-E4-E4-GSGS-E5-E5，命名为5BE），构建原核表达载体pET-28a-5BE，诱导表达重组蛋白His-5BE；将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备多克隆抗体，并以间接ELISA和Western Blot方法检测多克隆抗体的效价及反应性。结果显示：体外表达获得的重组蛋白His-5BE大小为22 kD；经ELISA检测，制备的His-5BE多抗血清效价至少达到1:160 000；经Western Blot检测，制备的抗血清1:500稀释时具有良好的反应性。结果表明，本研究成功获得了BVDV 5BE重组蛋白及其多克隆抗体，为后续BVDV单克隆抗体制备及检测方法建立奠定了基础。