胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)在不同年龄公猪睾丸中的表达

采用免疫组化（immunohistochemistry）和半定量RT-PCR法研究了胶质细胞源性神经营养因子（Glial cellline-derivedneurotrophic factor,GDNF）在生后仔猪睾丸中的表达,探讨了GDNF在睾丸发育和精子发生中的作用.实验结果发现,在幼龄阶段（2～4周龄）,GDNF蛋白主要表达于间质细胞区,而在曲细精管内未见表达.从第2月龄开始,GDNF蛋白在曲细精管内的支持细胞胞浆出现阳性信号,呈较低水平表达.随着年龄的进一步增长,GDNF在睾丸曲细精管内的表达不断增强,到成年时GDNF蛋白表达水平达最高.RT-PCR结果显示,仔猪出生后2周,睾丸中即存在GDNFmRNA的表达,随着年龄的增加,GDNFmRNA水平持续升高,到2月龄和6、18月龄分别与出生2周时有显著性（P＜0.05）和极显著性（P＜0.01）差异,其中第6月龄达高峰.实验结果表明GDNF可能直接参与了出生后仔猪睾丸的发育,并在调节精子发生中起着重要的作用.     

β-氯氰菊酯通过氧化应激诱导睾丸支持细胞发生去分化

氯氰菊酯（cypermethrin,CYP）对于生殖系统具有损害作用,但对睾丸支持细胞的影响仍不清楚。本研究以β-氯氰菊酯（β-CYP）为实验药物,用维生素E（VE）作为抗氧化剂,以成年雄性小鼠（Musculus）为实验材料,通过灌喂方式给药,处理35d,免疫组化检测睾丸中增殖细胞核抗原（PCNA）、间隙连接蛋白43（CX43）的表达,并检测小鼠睾丸总抗氧化能力的变化。结果发现,β-CYP可明显增加睾丸支持细胞中PCNA的表达（P〈0.05）,减少CX43的表达,降低睾丸总抗氧化能力（P〈0.05）;加入VE后,睾丸支持细胞中PCNA的表达减少;CX43的表达量增加;睾丸总的抗氧化能力增强（P〈0.05）。结果表明,β-CYP能够通过氧化应激使支持细胞去分化,从而抑制精子的生成,造成精子生成能力下降。     

不同培养系统对鸡精原干细胞体外增殖作用的比较

本研究比较了层粘连蛋白(laminin)、纤维连接蛋白(fibronectin)、胶原蛋白(collagen)以及睾丸支持细胞(sertoli cell)4种不同培养系统对鸡(Gallus gallus)精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)体外增殖的作用效果。采用三酶两步消化法分离SSCs,细胞经明胶差速纯化后培养,将传至3代的SSCs重新接种于层粘连蛋白、纤维连接蛋白和胶原蛋白包被的培养皿中以及睾丸支持细胞制备的饲养层上,通过形态学、5-乙基-2'-脱氧尿嘧啶核苷(EDU)细胞增殖、qRT-PCR技术检测不同培养系统对鸡精原干细胞体外增殖的作用效果。结果表明,鸡SSCs的碱性磷酸酶(AKP)阳性克隆数在睾丸支持细胞组最高,达到每视野(32±3)个,层粘连蛋白组、纤维连接蛋白组和胶原蛋白组分别为(26±3)、(24±2)和(23±2)个,三组差异不显著(P0.05);EDU检测睾丸支持细胞组细胞增殖率为(92.82±2.15)%,显著高于三组基质蛋白组(P0.01);qRT-PCR结果显示,增殖标记基因原癌基因(myconcogene,c-myc)、Kruppel样因子4(kruppel-like factor 4,Klf4)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)在睾丸支持细胞组的表达量最高,其次为层粘连蛋白组,c-myc和Klf4在纤维连接蛋白组中的表达要高于胶原蛋白组,PCNA则相反。实验结果表明:三组基质蛋白及睾丸支持细胞都能够促进鸡SSCs的体外增殖,其中睾丸支持细胞作用最佳,其次为层粘连蛋白,纤维连接蛋白和胶原蛋白两者作用效果差异不显著。该结果为进一步优化鸡胚SSCs的体外培养体系,阐明生殖细胞增殖机制提供了实验基础和理论支撑。     

SOX9基因在绵羊不同组织中的表达及其在睾丸中的定位

SRY-盒包含蛋白9(sex determining region Y-box 9,SOX9)基因在哺乳动物个体发育中扮演重要角色,广泛存在于各种组织,但主要在睾丸组织表达,参与调控睾丸细胞的增殖与分化.本研究采用qRT-PCR方法检测了6月龄小尾寒羊(Ovis aries)体组织及其0、2、6、12和24月龄睾丸组织SOX9mRNA的表达规律,并运用Western blot、免疫组织化学技术对不同发育期睾丸SOX9蛋白进行表达与定位研究.结果显示,在体组织中SOX9 mRNA表达无组织特异性,但垂体表达量最高,下丘脑和睾丸次之,肌肉组织9背最长肌和股二头肌)几乎无表达;随着月龄的增加,SOX9 mRNA在睾丸中的表达量先降低后上升,其中6月龄睾丸表达量显著高于0和2月龄(P＜0.05),但显著低于12和24月龄(P＜0.05).SOX9蛋白表达趋势与mRNA基本一致,0、2和6月龄睾丸中表达较低,少量支持细胞和间质细胞呈免疫阳性反应;12和24月龄睾丸中表达较高且呈增加趋势,支持细胞、部分间质细胞、极少量初级精母细胞和次级精母细胞呈免疫阳性反应.研究结果表明,SOX9基因在绵羊不同体组织中广泛表达,在下丘脑-垂体-睾丸生殖轴中发挥重要作用,并与睾丸细胞的增殖及分化过程有密切的关系.     

HSP60对天祝白牦牛原代培养的支持细胞增殖的影响

HSP60对动物的睾丸发育、精子发生起着重要的调控作用。支持细胞是睾丸内唯一与生精细胞直接发生联系的体细胞,对精子发生、成熟等过程有直接影响。为研究HSP60对白牦牛睾丸支持细胞增殖的调控作用,本试验通过组合酶消化法分离培养白牦牛原代支持细胞,通过差速贴壁法和Tris-HCL低渗缓冲液进行纯化处理,运用免疫荧光染色和Feulgen染色鉴定细胞,经流式细胞仪检测得到96.2%高纯度支持细胞。构建HSP60过表达载体p IRES2-EGFP-HSP60,合成靶向siRNA沉默HSP60,瞬时转染支持细胞后,经qPCR检测发现过表达组HSP60 mRNA在24、48、72 h等时间点均上调,沉默组HSP60 mRNA在24、48、72 h等时间点均下调。MTS试验检测细胞的增殖情况,过表达HSP60组中的支持细胞增殖效率各时间点均显著高于空白对照组和空质粒组;沉默HSP60组中支持细胞的增值率各时间点均低于空白对照组和阴性对照组,但差异不显著。qPCR检测细胞增殖标志基因细胞周期蛋白D1(cyclin D1)和增殖细胞核抗原(PCNA),结果表明,过表达HSP60组的cyclin D1基因在48 h时的表达显著高于空白对照组和空质粒组,PCNA基因的表达在24、48、72 h时均显著高于空白对照组和空质粒组;沉默HSP60组cyclin D1基因和PCNA基因的表达在24、48、72 h时均低于空白对照组和阴性对照组,但差异不显著。综上,HSP60在白牦牛睾丸支持细胞增殖调控中的作用是正向调控。本试验结果为进一步研究HSP60对白牦牛睾丸发育和精子发生的影响奠定了理论基础。     

StAR蛋白在仔猪睾丸组织中的表达*

以1-5周龄的仔猪睾丸为研究对象，采用免疫组化法和放射免疫法(RIA)研究了类固醇合成快速调节蛋白(StAR protein)在仔猪睾丸的表达及StAR蛋白与血浆睾酮水平的关系。实验结果表明：在1～5周龄，StAR蛋白主要在仔猪睾丸的间质细胞中表达；其中1、3周龄StAR蛋白的表达水平较低；2、4周龄StAR蛋白的表达水平较高，5周龄StAR蛋白的表达水平低于2、4周龄，但比1、3周龄强。睾酮水平在第2、3周时最高，在其它时期较低。StAR的表达与睾酮水平的变化并不完全一致。     

仔猪睾丸组织块生精细胞体外培养及鉴定初报

目的：建立仔猪睾丸组织块生精细胞爬片体外培养模型。方法：应用溴脱氧核苷尿嘧啶(5＇-Bromo-2＇-deoxyuridine, BrdU)免疫荧光技术检测生精细胞体外增殖分化情况；采用HE染色鉴定体外培养生精细胞分化程度。结果：结果表明体外培养第3天支持细胞开始游出睾丸组织块并贴壁；体外培养第4～8天睾丸组织块周围可见生精细胞，但未见明显增殖分化情况；体外培养第9～20天可明显观察到生精细胞增殖分化，间桥连接(gap junction)的生精细胞集落呈葡萄串或串珠状，并有精子细胞形成。结论：本培养体系能够提供睾丸组织块生精细胞增殖分化所需要的条件，在没有添加睾酮的情况下能够使非精子细胞分化为精子细胞。     

小鼠精原细胞体外存活、增殖特性及冷冻保存研究

为研究小鼠精原细胞体外存活、增殖特性及其以单细胞或处于功能性结构中(曲细精管或完整睾丸)耐受冷冻-解冻程序的能力。本研究收集生后7d昆白系小鼠睾丸，一步酶法分离获得生精上皮单细胞悬液(主要含精原细胞和支持细胞)，分别接种于D-MEM、D-MEM/F12、KSOM（均含10%的FBS）后系统观察了精原细胞的存活和增殖情况；对生精上皮单细胞进行了-70℃冷冻保存和液氮冷冻保存，对曲细精管及完整睾丸进行了-70℃冷冻保存。结果显示，D-MEM和D-MEM/F12均能使小鼠精原细胞存活和增殖，精原细胞分别在培养的第1~9d或第1~8d 呈逐渐减少趋势，第9~13d或第8~12d呈增殖趋势，而第17d或第16d以后增殖减缓，KSOM只能使小鼠精原细胞短暂存活而不能使其增殖。精原细胞单独培养时增殖不明显而逐渐呈现出分化迹象。生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸-70℃短期(1wk和2wk)冷冻保存或单细胞悬液液氮短期(2wk)和中长期(1个月和3个月)冷冻保存后均可以获得较理想的细胞存活率(均大于85%)。     

培养的睾丸间质细胞对hCG刺激的反应性

本文介绍了用酶解法结合差速离心分离仔猪睾丸间质细胞,并研究其对促性腺激素的反应性。结果表明在0～50IUml内,睾酮的分泌量随着hCG剂量的增加而增加,在50IUml～100IUml内,加大hCG剂量并不能增强间质细胞的分泌功能。研究还发现随着培养时间的延长,间质细胞分泌睾酮的功能逐渐减低,培养1d和2d时对hCG(人绒毛膜促性腺激素)刺激的反应能力最强;随着培养时间的进一步延长,间质细胞的反应性下降,4d时与对照无明显差异(P>0.05)。间质细胞对首次刺激的反应敏感,当连续给予刺激时,睾酮的分泌受到抑制,在24h的分泌峰后不再出现分泌高峰。而首次刺激后间隔2d再刺激,间质细胞虽有反应,但反应较弱。     

小鼠精原细胞体外增殖与冷冻保存

利用一步酶法将7日龄昆白系小鼠睾丸分离获得生精上皮单细胞悬液(主要含精原细胞和支持细胞),分别接种于D-MEM、D-MEM/F12和KSOM后,系统研究其精原细胞的存活和增殖情况,并对生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸进行了-70℃冷冻保存,同时对生精上皮单细胞进行了液氮冷冻(-196℃)保存。结果表明,小鼠精原细胞在D-MEM和D-MEM/F12中均能存活并增殖,表现为在培养的第1～9天/1～8天呈逐渐减少趋势,第9～13天/8～12天呈增殖趋势,第17天/16天以后增殖减缓,而在KSOM中只短暂存活不能增殖。生精上皮单细胞、曲细精管及完整睾丸-70℃短期(1周和2周)冷冻保存及单细胞悬液液氮短期(2周)和中长期(1和3个月)冷冻保存后,均可获得较理想的细胞存活率(均大于85%)。     

NO对仔猪睾丸支持细胞微管的影响

为阐明一氧化氮（NO）对睾丸支持细胞（SC）的影响,并为深入探讨精子发生调节机制奠定基础,本试验通过体外培养的仔猪睾丸支持细胞研究NO对SC中微管结构的影响。试验利用硝普钠（SNP）作为NO的供体,通过细胞活性检测、免疫荧光、酶活检测、免疫印迹等方法检测NO对睾丸支持细胞微丝的影响。结果表明,低浓度NO能维持支持细胞正常的骨架和活力,而高浓度NO能提高SC内p38MAPK的活性,降低抗氧化酶的活性和破坏细胞内微管的结构和分布,甚至细胞的分泌功能。上述证明,SNP通过使睾丸支持细胞NO的水平升高从而降低细胞内抗氧化能力,并通过p38MAPK级联,使细胞中微管发生解聚化,破坏微管的结构,从而降低细胞的分泌功能。     

山羊胎儿睾丸细胞体外分离培养及雄性生殖系干细胞的生长行为

摘要：采用4种不同的处理方法消化山羊胎儿睾丸组织，其中0.1%的胶原酶Ⅰ处理15 min后， 用0.25%胰酶处理5 min，经3次洗涤，睾丸细胞分散较好。用不同的培养体系体外培养，结果显示：原代培养山羊胎儿睾丸细胞培养120 h左右，获得桑椹状雄性生殖系干细胞(mGSCs)集落和单层支持细胞，mGSCs集落呈半悬浮式隆突生长，mGSCs集落和支持细胞分区明显；传代培养显示，在小鼠成纤维细胞饲养层上， mGSCs集落和mGSC单细胞被同质化程度较显著，而含有支持细胞的mGSC单细胞和mGSCs集落被同质化程度较弱；传代mGSCs集落和支持细胞共培养体系中，mGSCs集落正常生长，而且集落中细胞间隙紧密，mGSCs分化较慢。     

采收时间对玫瑰茄萼片产量及营养成分的影响

为明确玫瑰茄最佳采收时间,以玫瑰茄种质M3和M5为试验材料,对不同采收时间玫瑰茄的萼片产量和原花青素、单宁等营养成分含量进行分析。结果表明,随着采收时间推迟,2份种质的萼片产量和营养成分含量均呈先增加后减少的趋势。M3的鲜果重、鲜萼片重均在开花后21 d达到最大值,分别为12.82 g和7.75 g,干萼片重在开花后28 d达到最大值,为0.98 g;M5的鲜果重在开花后21 d达到最大值,为6.97 g,鲜萼片重、干萼片重均在开花后28 d达到最大值,分别为3.90 g和0.47 g,以采收花萼为目的时,适宜采收期为开花后21~28 d。M3萼片的原花青素含量在开花后35 d时最高,达2 180.00 mg·kg^-1,M5在开花后21 d时最高,达573.50 mg·kg^-1,以提取原花青素为目的采收时,M3和M5的适宜采收期分别为开花后35 d和开花后21 d。M3的单宁含量在开花后28~35 d时最高,达2.30 g·kg^-1, M5在开花后42 d时最高,达1.38 g·kg^-1,以提取单宁为目的采收时,M3和M5的适宜采收期分别为开花后28~35 d和开花后42 d。综上,玫瑰茄的适宜采收时间为开花后一个月左右(28~35 d)。本研究可为玫瑰茄合理采收提供参考依据。     

空竹悬浮细胞系的建立

竹子悬浮细胞培养比较困难,本研究首次获得空竹悬浮细胞.以空竹种胚为材料诱导愈伤组织,建立稳定的悬浮细胞培养体系;通过固体培养法获得悬浮细胞来源的愈伤组织,可为竹类悬浮细胞系遗传转化或诱变后单克隆的筛选提供材料.空竹种胚在3/4MS+500mg/L脯氨酸+500mg/L谷氨酰胺+300mg/L胰蛋白胨+3.0mg/L 2...     

稗不同出苗时间和密度对机械直播水稻灌浆期根系特性的影响

为探讨机械直播稻田稗最佳防控时间,采用小区试验的方法,以人工除草处理为对照,研究稗不同出苗时间(水稻机械直播后0、7、14、21、28、35 d)和不同密度(1、3、5、7株·m^-2)对机械直播水稻根系特性以及产量的影响。结果表明,稗出苗时间和密度对水稻产量有不同的影响,稗草出苗时间越早或密度越大,水稻减产越多。当稗密度为1株·m^-2时,水稻机械直播后0~35 d出苗的稗均对水稻产量无影响;当稗密度为3、5、7株·m^-2时,在水稻机械直播后21 d内出苗的稗均随其密度增加而显著降低水稻产量,之后出苗的稗对水稻产量无明显影响。同时发现,产量显著降低后水稻的根系总根长、平均根系直径、根干重、根系总吸收面积、根系活跃吸收面积、根系氧化力和玉米素+玉米素核苷含量也均显著降低。上述水稻根系指标的降低可能是机械直播水稻与稗伴生后产量降低的重要原因。本研究为机械直播稻田稗草防控提供了理论依据。     

鸡分腐解过程腐殖质络合态铜的变化及其淋溶特征

Chicken manure was composted for 110 d to evaluate changes in organic carbon (C) and humic substance-complexed copper (HS-Cu) extracted with water, sodium hydroxide (NaOH), and sodium pyrophosphate and sodium hydroxide mixture (Na₄P₂O₇-NaOH). The average HS-Cu content from the Na₄P₂O₇-NaOH extraction accounted for 46.8% of the total Cu in the compost, followed by those from the NaOH and water extractions, which accounted for 34.5% and 6% of the total Cu in the compost, respectively. NaOH-Na₄P₂O₇-extractable HS-Cu increased throughout the composting process. NaOH-extractable HS-Cu increased during the first 50 d of composting and then leveled off. Water-extractable HS-Cu enhanced during the first 21 d and then decreased. Water-extractable HS-Cu was not correlated to NaOH-or NaOH-Na₄P₂O₇-extractable organic C. The average amount of Cu leached from the compost was about 20% of the total Cu in the chicken manure and Cu leaching increased during the first 35 d of composting and then decreased. Leaching of Cu was significantly correlated to the concentrations of HS-Cu extracted with NaOH and water, but was not correlated to the concentration of HS-Cu extracted with NaOH-Na₄P₂O₇. Thus, NaOH-and water-extractable HS-Cu were relatively labile and NaOH-Na₄P₂O₇-extractable HS-Cu was relatively immobile. Composting process after rapid decomposition could result in low potential of Cu leaching because of formation of more NaOH-Na₄P₂O₇-extractable HS-Cu.     

适宜宰后成熟时间提高牦牛肉品质

为了研究宰后成熟时间对牦牛肉品质的影响,该研究采集牦牛背最长肌,真空包装后进行成熟排酸,成熟期间取样测定pH值、剪切力、持水能力、色度,并通过标准化和动力学模型分析研究其变化规律。结果发现,除了黄色度b*以外,其余品质指标均在21d的成熟过程中有显著变化(P0.05)。相比于7 d成熟,延长至21 d的长时间成熟可将牦牛肉剪切力显著地降低47%(P0.05),并将蒸煮损失和红色度a*分别显著地提高28%和32%(P0.05)。通过对比线性函数、指数函数、二次函数对牦牛肉品质变化的预测效果,结果发现二次函数预测模型与牦牛肉宰后品质变化具有相对最好的拟合度(决定系数R2范围为0.90~0.98),其中pH值、剪切力、加压损失、亮度L*值随时间的变化函数呈现出凸函数特征,而蒸煮损失和a*值则呈现出凹函数特征。结果表明,相比于牛肉品质宰后预测中常用的线性函数和指数函数而言,二次函数更适用于牦牛肉品质变化的预测,而将牦牛肉宰后成熟时间延长至21 d可有效降低牦牛肉剪切力。研究可为牦牛肉品质控制提供参考。     

Selenocystine induces S-phase arrest and apoptosis in human breast adenocarcinoma MCF-7 cells by modulating ERK and Akt phosphorylation

Selenocystine (SeC) is a nutritionally available selenoamino acid with selective anticancer effects on a number of human cancer cell lines. The present study shows that SeC inhibited the proliferation of human breast adenocarcinoma MCF-7 cells in a time- and dose-dependent manner, through the induction of cell cycle arrest and apoptotic cell death. SeC-induced S-phase arrest was associated with a marked decrease in the protein expression of cyclins A, D1, and D3 and cyclin-dependent kinases (CDKs) 4 and 6, with concomitant induction of p21waf1/Cip1, p27Kip1, and p53. Exposure of MCF-7 cells to SeC resulted in apoptosis as evidenced by caspase activation, PARP cleavage, and DNA fragmentation. SeC treatment also triggered the activation of JNK, p38 MAPK, ERK, and Akt. Inhibitors of ERK (U0126) and Akt (LY294002), but not JNK (SP600125) and p38 MAPK (SB203580), suppressed SeC-induced S-phase arrest and apoptosis in MCF-7 cells. The findings establish a mechanistic link between the PI3K/Akt pathway, MAPK pathway, and SeC-induced cell cycle arrest and apoptosis in MCF-7 cells.