大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(Gm VTE3)的克隆及对转基因烟草种子中生育酚组成的影响

【目的】克隆大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因(GmVTE3),研究其在烟草中过量表达对转基因烟草种子中生育酚(维生素E)组分的影响。【方法】利用EST拼接和RT-PCR技术,从大豆中分离了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(VTE3)的全长cDNA序列,通过烟草转化研究过量表达VTE3对转基因植株维生素E组分的影响。【结果】GmVTE3全长1026bp,编码342个氨基酸,与其它物种的VTE3氨基酸同源性很高,在烟草中过量表达该基因使烟草种子中γ-生育酚与δ-生育酚的比值最高增加2倍。【结论】首次克隆了大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶基因GmVTE3,它能够催化烟草植株中2-甲基-6-植基-1,4-苯醌(MPBQ)的甲基化,从而改变烟草种子中生育酚的组成成分。说明可以利用克隆的GmVTE3来改变植物种子中生育酚的组成和提高α-生育酚的含量。     

野猪、家猪及其杂种猪ACSL4基因部分内含子的克隆和多态性分析

克隆猪ACSL4基因的内含子3和5,寻找其SNP位点。通过酚-氯仿法从野猪、家猪及其杂种猪的耳组织中提取基因组DNA。根据GenBank网站的猪ACSL4基因cDNA全序列设计两对引物进行PCR扩增,利用PCR-SSCP对获得的序列进行了多态性分析。对猪基因组进行PCR扩增,对获得的内含子3(232 bp)和内含子5(241 bp)序列进行克隆和测序,结果表明,基因片段分别是包含部分外显子3、4,完整的内含子3序列和部分外显子5、6,完整的内含子5序列,与人的该基因分别有72.87%和78.62%的同源性。多态性分析发现,该基因的两个内含子较为保守,未检测到多态位点。该研究为深入探讨该基因与肉质性状的关系以及丰富猪的种质资料库和分子育种提供了理论依据。     

苦荞C4H基因的cDNA克隆及生物信息学分析

[目的]为了解植物苯丙烷类代谢途径中关键酶——肉桂酸-4-羟基化酶基因结构特征及系统进化,拟克隆苦荞肉桂酸-4-羟基化酶(Cinnamate-4-hydroxylase,C4H)基因并进行生物信息学分析。[方法 ]本研究通过RT-PCR技术,克隆2个苦荞C4H基因cDNA和DNA序列,并通过生物信息学分析其基因结构及蛋白理化性质,最大似然树法构建系统进化树。[结果]2个基因cDNA序列长度分别为1 812bp和1 476bp,各编码504和491个氨基酸残基。其DNA序列分别为2 774bp和2 364bp,均包含3个外显子和2个内含子,第1个外显子和2个内含子序列长度存在明显差异。蛋白分子量分别为58.002kDa和56.401kDa,等电点分别为9.18和9.09。2个基因编码氨基酸与苦荞肉桂酸-4-羟基化酶同源性分别为99%和86%,故暂且命名为FtC4H1和FtC4H2。FtC4H1和FtC4H2与其他物种直系同源蛋白聚为两类,FtC4H1和FtC4H2与莴苣和丹参同源蛋白亲缘关系较近,氨基酸序列同源性分别为88%和84%。[结论]本研究通过对苦荞2个C4H基因的核酸、氨基酸序列、蛋白结构及系统进化树进行分析,为后续苯丙烷代谢途径及荞麦基因挖掘利用提供理论基础。     

花生栽野杂交后代抗病基因类似物的克隆与分析

【目的】在花生野生种、栽培种及栽野杂交后代中,克隆抗病基因类似物(Resistance gene analog,RGA)相关基因片段,为抗病基因的进一步分离、鉴定及利用奠定基础。【方法】以14个花生栽野杂交种和2个抗病花生亲本为材料,应用PCR方法扩增来自基因组DNA的抗病基因类似物序列,并分析其同源性。【结果】扩增出15条来自基因组DNA的抗病基因类似物序列,序列长度在500bp左右,由此推导出的15条氨基酸序列含有典型的NBS保守区的N端糖基化位点、蛋白激酶C磷酸化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点。15条花生RGA氨基酸序列间的同源性在73.2%~100.0%,与已发表的花生抗病基因类似物的相似性较高,达72.1%~100.0%;与已知的其他作物的抗病基因编码的氨基酸序列有34.1%~54.6%的同源性。【结论】分离到的15个花生抗病基因同源片段为抗病基因的部分序列。     

柑橘类植物GPAT基因片段克隆和SNP分析

甘油-3-磷酸酰基转移酶基因是与植物抗冷性强弱密切相关的基因。根据已报道的各种植物GPAT基因的氨基酸序列上前后两个保守区设计1对简并引物,采用RT-PCR技术,分别从琯溪蜜柚、马家柚、莽山野橘等8种柑橘类植物中克隆得到315bp的GPAT基因片段。使用DNA Star5.0软件对8个片段序列进行同源性比较,8个片段的核苷酸同源性高达97.8%,与其它植物GPAT基因核苷酸序列的同源性都在72.5%以上;经过氨基酸序列推导,每个GPAT基因片段分别编码105个氨基酸,8个片段的氨基酸同源性为95.2%,与其它植物GPAT基因的氨基酸序列同源性在68.9%以上。试验克隆所得8种柑橘类植物GPAT基因片段序列存在明显的单核苷酸变异,在14个核苷酸位点存在SNPs(single nucleotide polymorphisms),导致6个氨基酸位点发生变异,多态性频率为1SNP/22.5bp,核苷酸变异度为4.45%,氨基酸变异度为5.71%。采用NJ聚类法对克隆片段的核苷酸序列进行了遗传多样性分析。     

花生AhFAD2-2基因的克隆与表达分析

脂肪酸脱氢酶(FAD)能够调节膜脂中不饱和脂肪酸的水平来提高植物对不良环境的耐受性。本研究利用RT-PCR方法从花生中克隆到2个脂肪酸脱氢酶基因,命名为AhFAD2-2.1和AhFAD2-2.2。序列分析结果显示,2个基因的ORF区均为1 152 bp,编码383个氨基酸;c DNA水平上有12个碱基差异位点,其中只有483位和720位的碱基差异引起氨基酸的改变;它们的基因组序列大小分别为5 089 bp和5 090 bp,在5'UTR区分别存在一个3 821 bp和3 822 bp的内含子。qRT-PCR分析结果显示,这两个基因为组成型表达,其中在叶片中的表达量最高,花和根中次之,茎与种子中表达量最低。低温处理下,幼苗叶片中AhFAD2-2基因的表达量在0.5 h时迅速增加,至12 h达最高值,随后表达量逐渐下降,说明AhFAD2-2的表达响应低温胁迫诱导。本研究结果可为花生的抗寒性遗传改良提供理论依据。     

枇杷β-胡萝卜素羟化酶基因片段的克隆和序列分析

根据蔷薇科植物β-胡萝卜素羟化酶基因的保守区序列,设计1对PCR引物,以枇杷基因组DNA为模板,采用PCR方法扩增出长约450 bp的DNA片段,克隆人pMD-18T载体中,测得该基因片段长为440 bp,编码145个氨基酸,属于开放阅读框的一部分,不含内含子。在GenBank中进行同源性检索,结果该序列与苹果β-胡萝卜素羟化酶基因同源性为95%,证明它属于枇杷的β-胡萝卜素羟化酶基因。     

花生黄烷酮3-羟化酶基因AhF3H的克隆和表达分析

利用花生转录组测序结果和GenBank EST数据库,首次从花生中克隆了黄烷酮3-羟化酶基因,命名为AhF3H,GenBank登录号为KF312218。氨基酸序列分析表明,AhF3H与其他植物F3H有较高的同源性。进化树分析表明,AhF3H与大豆、野生大豆F3H的亲缘关系较近。在花生紫色种质材料及丰花1号中,AhF3H的相对表达水平同花青素含量呈正相关,表明AhF3H在花生花青素合成代谢过程中具有重要作用。     

普通枇杷和栎叶枇杷APETALA1同源基因的克隆和序列分析

分析植物花分生组织特征基因APETALA1(AP1)同源基因的保守区序列,设计特异引物;用PCR方法从枇杷栽培品种香钟11号和野生种栎叶枇杷基因组DNA中各扩增出1个350 bp左右的片段;将该片段分别克隆到pUCm-T载体.测序和序列分析结果表明获得了枇杷AP1同源基因的片段.该基因片段的序列在2个不同种的枇杷间差异较小,均含有2个内含子,特别是外显子部分只有1个碱基的差别;编码区共编码36个氨基酸,氨基酸序列也只有1个氨基酸的差异.其序列已经在GenBank中登记(登录号分别为AY549306和AY571786).同源性比较发现该基因片段与其他作物中已经报道的AP1同源基因的同源性大都在80%以上,特别是与同属于蔷薇科的苹果的同源性最高,达到91%(栽培种)和94%(野生种),推测它们具有相似的功能.     

菊芋凝集素基因组片段的PCR扩增及克隆

通过PCR扩增 ,获得了菊芋凝集素基因 (hta)的编码区基因组片段hta - g。DNA序列分析表明 ,PCR产物长 70 2bp ,包括 444bp的编码区序列 ,编码区被一个 2 5 8bp的内含子分成 2个长度分别为 2 1 0bp及 2 34bp外显子 ,内含子边界序列符合GT/AG规则。与htacD NA序列的比较分析表明 ,hta - g的编码区序列与htacDNA序列高度同源 ,同源性在 93%～98%。     

基于顺序GISH-FISH花生栽培种的染色体分析

【目的】针对花生染色体较小,染色体细胞学标记少,细胞遗传研究相对滞后,染色体分类识别困难的问题,建立能够准确区分栽培花生（Arachis hypogaea L.,2n=4x=40,AABB）A、B染色体组的新核型,提高染色体识别准确率,以揭示栽培花生和野生供体亲本的染色体对应关系,鉴定栽培种花生染色体结构变异体。【方法】以花生栽培种（Arachis hypogaea L.,2n=4x=40,AABB）的2个可能供体亲本即花生野生种Arachis duranensis（2n=2x=20,BB）和Arachis ipaënsis（2n=2x=20,AA）全基因组DNA及5S rDNA和45S rDNA为探针,利用顺序基因组荧光原位杂交（GISH）和多色荧光原位杂交（McFISH）技术（简称顺序GISH-FISH）结合DAPI染色,在准确区分花生栽培种A、B染色体组的基础上,对花生栽培品种Z5163及其供体亲本染色体进行分析,建立花生栽培种新核型,并利用该核型对其他栽培品种的染色体进行分析,以探讨该核型的应用潜力和栽培花生染色体组成特点。【结果】以A. ipaënsis和A.duranensis全基因组DNA为探针的GISH分析表明,以A. ipaënsis为探针在花生栽培种20条B组染色体上能够产生清晰稳定的杂交信号,在A组染色体上没有信号,而以A.duranensis为探针,只在18条A组染色体能产生信号,但1对A组的小染色体“A染色体”不易被区分,因此,以A. ipaënsis为探针可以准确区分花生栽培种A、B染色体组;综合5S rDNA和45S rDNA Mc-FISH和DAPI染色分析,发现花生栽培种A、B染色体组DAPI带纹、5S rDNA和45S rDNA的分布分别与A.duranensis和A. ipaënsis一致,此结果支持A.duranensis和A.ipaënsis是花生栽培种的供体亲本。DAPI染色结果显示,A. ipaënsis及花生栽培种的B组染色体均有14条染色体显示着丝粒带纹,明显多于前人报道,表明仅利用DAPI染色来区分花生栽培种A、B组染色体的方法具有局限性。综合DAPI染色、rDNA、A.duranensis和A. ipaënsis基因组探针进行顺序GISH-FISH分析,建立了可以准确识别花生栽培种A、B染色体组新核型。然后利用该核型对3个栽培种品种的染色体组成进行了分析,首次发现一个自发的花生染色体代换系MS B1（A1）,揭示了栽培花生染色体B1与A1之间存在部分同源关系。【结论】野生花生A. duranensis和A. ipaënsis分别与栽培花生A和B基因组染色体间具有很好的对应关系;研究建立的基于GISH-FISH和DAPI染色的栽培花生新核型,不但可以准确区分大部分A、B组染色体,而且还能识别栽培花生在多倍体化和人工进化过程中可能存在的自发的染色体变异,揭示A、B组染色体间的部分同源性。     

枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和tuf基因的序列同源性分析

 【目的】枣疯病是枣树上由植原体引起的一种毁灭性病害，遍布于中国华北、西北、华东、华南等25个省(市)的枣区，造成了巨大的经济损失。【方法】经PCR扩增，分别对中国陕西的彬县、阎良、武功、佳县、杨凌，河北沧州和山东德州7个枣区的枣疯病样品和杨凌4个酸枣丛枝病样品植原体16S rDNA基因保守序列和延伸因子tuf基因进行克隆和测序。【结果】获得枣疯病和酸枣丛枝病植原体的16S rDNA基因片段均为1 239 bp，tuf基因均为851 bp。通过序列同源性比较，结果表明中国陕西、河北、山东的枣疯病的病原一致，归属于植原体16S rⅤ-B组。由于枣疯病和酸枣丛枝病的植原体16S rDNA有5个碱基的差异，tuf基因的同源性为99.6%，推测为同一个种的不同寄主生物学型。【结论】首次报道了中国枣疯病和酸枣丛枝病植原体16S rDNA和延伸因子tuf基因的序列，确定了枣疯病和酸枣丛枝病植原体的分类地位，为研究枣疯病植原体的致病分子机理、遗传本质提供理论依据。     

基于RNA-seq数据的栽培种花生SSR位点鉴定和标记开发

【目的】鉴定花生RNA-seq数据中的SSR位点,明确转录组中SSR位点的分布和结构特点,开发与花生基因相关联的SSR标记,为花生重要功能基因的挖掘、等位变异研究和分子标记辅助育种奠定基础。【方法】根据栽培种花生全生育期中22种不同类型的组织RNA-Seq数据,使用MISA软件分析SSR位点分布及特征,采用Primer 3设计基因关联的SSR引物,并利用电子PCR软件对引物的质量进行检测,随机合成38对引物,进行多态性检测。【结果】从52 280条转录本中共鉴定19 143个SSR位点,分布于14 084条转录本,发生频率为26.94%。重复单元类型为单核苷酸—五核苷酸,以单核苷酸和三核苷酸为重复单元的SSR位点数最多,分别占位点总数的39.24%和38.40%。各重复单元优势基序类型分别为A/T、AG/CT、AAG/CTT、AAAG/CTTT和AACAC/GTGTT,占所在重复单元中的比例分别为97.62%、72.01%、30.96%、24.59%和16.67%。重复单元的重复次数为5—47次,单个SSR位点的长度的分布范围为10—47 bp,基序长度主要集中在10—14 bp;复合SSR位点的长度范围为21—249 bp,以31—40 bp为主。鉴定的SSR位点中共有13 477个SSR位点可以进行引物设计,其中5 020条转录本序列对应到特定的基因,共包含5 859个可进行引物设计的SSR位点,这些SSR位点在A基因组和B基因组共20条染色体上不均匀分布,其中B03染色体上SSR位点最多,为484个。对特定基因SSR引物进行电子PCR检测,在A.duranensis、A.ipaensis、A.hypogaea基因组中有效扩增位点分别为4 468、4 929和10 188个,有效引物数分别为3 968（67.74%）、4 232（72.25%）和5 174（88.33%）对,在A. hypogaea基因组中,SSR引物扩增位点主要以2个位点为主,其中,有1 477对引物单位点扩增。根据SSR引物扩增位点在栽培种花生基因组中的位置信息绘制了SSR位点的物理图谱。在38对SSR引物中,共有35对（92.1%）SSR引物可以扩增出清晰的条带,其中,有11对（28.9%）SSR引物在2个品种间扩增出差异条带。【结论】鉴定了13 477个可进行标记开发的SSR位点,开发、检测了5 859个基因相关SSR标记,在栽培种花生基因组中具有较高的扩增效率,并构建了基因相关SSR位点的物理图谱。     

ICRISAT花生微核心种质资源SSR标记遗传多样性分析

【目的】评价ICRISAT花生微核心种质资源的遗传多样性水平,揭示ICRISAT花生微核心种质资源遗传多样性,验证传统植物学分类的可靠程度,为充分发掘、利用ICRISAT花生微核心种质资源提供必要信息。【方法】采用27对花生SSR引物,对ICRISAT微核心花生种质168份材料(来自世界五大洲42个国家)进行遗传多样性分析;利用NTSYS-pcV2.0软件进行主成分分析(PCA)并绘制三维空间聚类图;利用Popgene V1.32估算种质群间的Nei78遗传距离等参数并进行UPGMA聚类分析,采用MEGA3.1绘制种质群间聚类图。【结果】27对SSR引物共扩增出115条多态性条带,每对引物平均扩增出4.2930个等位变异,其中有效等位变异数2.7931,有效等位变异所占比重为65.49%;PM137、16C6、14H6、8D9和7G02等引物最为有效,其Shannon’s信息指数均在1.5以上,等位变异数5个以上,有效变异数3.7个以上。在多粒型群体中,来源于南美洲和印度种质资源的遗传多样性较低,来源于南美洲和非洲种质资源的遗传多样性较高;在珍珠豆型群体中,来源于北美洲种质资源的遗传多样性较低,来源于南美洲和非洲种质资源的遗传多样性较高;在普通型群体中,来源于北美洲种质资源的遗传多样性较低,来源于南美洲、美国和非洲种质资源的遗传多样性较高。来自南美洲的花生种质资源具有较高的遗传多样性,与花生起源于南美洲的结论一致。PCA分析,发现栽培种花生种质资源由4个差异明显的基因源构成,"hypogaea"包括普通型种质资源,"vulgaris"包括珍珠豆型种质资源,"fastigiata1"包括多粒型种质资源,"fastigiata2"包括多粒型种质资源。植物学分类单位间的Nei78遗传距离介于16.336—23.607cM,UPGMA聚类方法将花生属植物学分类单位聚成5个组群,"组群1"对应"hypogaea"基因源,"组群2"对应"vulgaris"基因源,"组群3"对应"fastigiata1"、"fastigiata2"基因源之和,"组群4"和"组群5"分别代表秘鲁型和赤道型基因源,聚类结果支持4个基因源的划分。【结论】ICRISAT花生微核心种质资源具有丰富的遗传多样性,不同来源的变种群间存在明显的遗传差异,并分化成4个基因源,研究结果部分支持栽培种花生传统的植物学分类体系。为拓宽花生育成品种的遗传基础,应充分发掘ICRISAT微核心种质各基因源的遗传潜力。     

南疆扁桃品种自交不亲和S-Rnase基因型鉴定

[目的]鉴定南疆扁桃品种自交不亲和S-RNase基因型,可为科学合理地配置授粉品种提供依据,有效提高南疆扁桃的产量.[方法]以南疆10个扁桃品种的叶片为试材,利用蔷薇科通用引物PaConsⅡ-F+PaConsⅡ-R、EM - PC2consFD+ EM - PC3consRD对叶片基因组DNA进行S-RNase特异性扩增,将克隆测序结果在GenBank上进行同源性比对.[结果]显示10个扁桃品种均获得2条带,共20条带,包含16种不同的S基因核苷酸序列,其中4个为GenBank上登录的已知S -RNase基因序列,分别为S1(1 370 bp)、S12(2 479bp)、S14(740bp)、S52(1 626bp),12个为新的S-RNase基因序列,暂时分别命名为SA(780bp)、SB(530bp)、SC(1261 bp)、SD(432 bp)、SE(1266bp)、5F(270 bp)、SG(1263 bp)、SH(272 bp)、SI(690 bp)、SJ(1 523bp)、SK(755bp)、SL(1 486bp).[结论]鉴定出10个品种的S- RNase基因型.     

小麦TaGA20ox2基因的克隆及分析

 【目的】克隆小麦中的GA20-氧化酶基因并进行遗传定位,为深入研究小麦中的GA20-氧化酶基因作用机理奠定基础,同时为改良小麦的重要农艺性状提供理论依据。【方法】采用同源克隆结合BAC文库筛选的方法克隆基因,利用中国春缺失体以及国际作图群体对该基因进行遗传定位。【结果】从普通小麦中国春中分离得到TaGA20ox2的gDNA与cDNA序列,利用中国春缺失体材料将TaGA20ox2定位于3A、3B、3D染色体上,序列分析表明分别位于3A、3B、3D染色体上的TaGA20ox2-A1、TaGA20ox2-B1和TaGA20ox2-D1与水稻GA20ox2为直向同源基因,具有GA20ox2家族保守结构域;利用国际作图群体W7984×Opata85将位于3D上的基因TaGA20ox2-3定位于xfba330与xgwm664标记之间。【结论】分离获得小麦中分布于第三同源群的GA20ox2;分子标记结果结合QTL作图信息可以初步推测TaGA20ox2-3在小麦中可能是控制株高的基因。     

花生属植物起源、分类及花生栽培种祖先研究进展

了解花生属植物的起源、分类及栽培种花生的野生种祖先对利用野生种改良栽培种花生品种和扩大其遗传基础均具有重要意义。花生（Arachis hypogaea L．）是重要的油料作物和植物蛋白质来源,现已经鉴定出花生属植物有80个种,分属于9个区组;花生区组包括花生栽培种和其它30个野生种,花生栽培种与花生区组的野生种杂交亲和,与其它区组的野生种杂交不亲和。通过种间杂交、细胞学和分子标记等现代生物技术对花生属种间亲缘关系进行广泛深入的研究,目前比较一致认为A．duranensis和A．ipaensis最有可能是栽培种花生的野生种祖先。通过各种途径利用花生野生种质资源改良花生栽培种和进行种质创新是今后花生研究的重要方向之一。     

黄瓜中导入野生酸黄瓜外源DNA片段的分子验证

【目的】对栽培黄瓜(Cucumis sativus L.,2n=14)与野生酸黄瓜(Cucumis hystrix Chakr.,2n=24)经远缘杂交和多代回交、自交而来的渐渗系进行分子标记分析和表型鉴定,旨在为黄瓜导入酸黄瓜外源DNA片段提供相应依据。【方法】从分子标记分析、DNA序列比对和农艺性状表现上对各渐渗系和双亲进行研究。【结果】渐渗系与栽培黄瓜存在13.2%的遗传多态性,包括供体特异带、缺失带和产生的新带。利用RAPD引物D-11和SSR引物06632在渐渗系中分别扩增出约310bp和150bp的酸黄瓜特异带,序列分析表明其与酸黄瓜相应DNA片段的相似性分别为92.93%和96.48%,碱基差异分别为41个和9个,包括碱基转换、颠换和缺失。表型鉴定发现其呈现出酸黄瓜的遗传特性。【结论】野生酸黄瓜DNA已渐渗进入栽培黄瓜基因组,同时发生了少量不同类型的变异。     

河北省花生地方品种基于SSR标记的遗传多样性

 【目的】揭示河北省花生地方品种的遗传多样性,为花生育种提供理论依据。【方法】利用20对SSR引物对75个河北省不同植物类型花生地方品种遗传多样性进行分析。【结果】共检测到65个等位基因,每个位点的等位基因变幅为2～6个,平均3.25个;平均Shannon信息指数为0.5448,变幅为0.1680(7G02)～1.3617(PM15);平均Nei基因多样性指数为0.6458,变幅为0.3385(7G02)～0.9013(PM384);普通型花生地方品种的遗传多样性明显大于多粒型和珍珠豆型。采用类平均法对欧氏距离进行聚类,可以将各地方品种分为两大类,第Ⅰ类群为珍珠豆型和多粒型花生地方品种,第Ⅱ类群为普通型花生地方品种,品种间的亲缘关系与地理来源关系不大。【结论】SSR检测结果表明,河北省花生地方品种的多样性程度较高。