采用同位素稀释高效液相色谱-串联质谱法同时测定银杏叶中5种黄曲霉毒素的研究

建立了一种能够同时测定银杏叶中5种黄曲霉毒素(黄曲霉毒素B_1、黄曲霉毒素B_2、黄曲霉毒素G_1、黄曲霉毒素G_2及黄曲霉毒素M_1)的高效液相色谱-串联质谱定量分析方法。检测结果表明:5种黄曲霉毒素的检测限及定量限范围分别为0.15~0.80μg/kg和0.50~1.50μg/kg;线性范围在0.5~100.0 ng/mL时,R~2≥0.9990;高、中、低加标回收率分别为85.98%~95.21%、88.92%~98.15%和75.34%~87.09%,相对标准偏差≤13.55%。该方法具有检测速度快、灵敏度及回收率高等优点,能用于同时测定银杏叶中5种黄曲霉毒素的含量。     

饲料中黄曲霉毒素B1快速检测试剂盒的研制与应用

建立一种简单、快速、灵敏、准确的黄曲霉毒素B1的ELISA检测方法,并使其在饲料检验中广泛应用。在生产抗黄曲霉毒素B1单克隆抗体基础上,利用间接竞争ELISA方法,研制出饲料中黄曲霉毒素B1快速检测试剂盒。该试剂盒对黄曲霉毒素B1最低检出浓度为0.05 ng/mL,标准曲线的线性范围为0.05~2.00ng/mL;对3种饲料做3个加标水平添加回收率试验,回收率在79.5%~106.2%之间。     

利用PicoGreen作为检测探针建立基于核酸适配体识别的玉米赤霉烯酮快速检测方法

玉米赤霉烯酮(ZEN)是一种能对动物和人类产生毒性的真菌毒素。研发灵敏而准确的玉米赤霉烯酮快速检测技术对于保障食品动物安全至关重要。该研究以PicoGree荧光染料为检测探针,利用其仅与dsDNA结合后才发出荧光的特性(激发波长:480nm,发射波长:520nm),当ZEN不存在时,适配体能够与其互补链结合而形成dsDNA,导致荧光强度增强;当ZEN存在时,适配体与ZEN结合而不能形成dsDNA,导致荧光强度减弱。建立了一种基于核酸适配体识别的ZEN快速检测方法。灵敏度试验表明:该方法的最低检测限为0.1μg/L(0.1ppb),线性范围为0.1~1μg/L(0.1~1ppb)。检测时间可以控制在40min内。特异性试验结果表明:ZEN核酸适配体与桔青毒素(CTN)、赭曲霉毒素A(OTA)、黄曲霉毒素B_1(AFB_1)和伏马毒素B_1(FB_1)等真菌毒素不会出现交叉反应。本研究与传统的基于抗体识别的ELISA快检方法进行比较,Kappa值为0.805,表明二者一致性相当。由于核酸适配体价廉,检测时间短,因此本文开发的ZEN检测方法较常用的ELISA方法更具有推广和应用价值。     

荧光定量检测试纸检测饲料中黄曲霉毒素B_1

研究建立了饲料中黄曲霉毒素B_1荧光定量检测方法。饲料样品经70%甲醇溶液提取,过滤后,用0.01 mol·L~(-1) pH 7.4 PBS复溶,结果表明,黄曲霉毒素B_1在5～80μg·mL~(-1)浓度范围内线性关系良好,r~2=0.998。以配合饲料、浓缩饲料、预混料为添加基质,其回收率在80%～120%,检出限为5μg·mL~(-1)。结果显示,本方法灵敏度高,操作简单,结果准确,可满足饲料中黄曲霉毒素B1的分析检测。     

党参外源污染真菌的组成及其产毒特性

【目的】研究药材党参外源污染真菌的组成及分析产毒真菌。【方法】采用平板稀释法分离党参表面外源真菌、形态特征和序列分析方法对菌株进行鉴定及高效液相色谱-质谱联用技术对产毒真菌进行检测。【结果】党参药材外源污染以曲霉Aspergillus为主,青霉Penicillium次之;曲霉属中主要是以塔宾曲霉A. tubingensis和烟曲霉A. fumigatus为优势菌,青霉主要是以橘青霉P. citrinum为优势菌。分离的外源污染真菌中共筛选出3株产毒真菌,均鉴定为黄曲霉A. flavus。黄曲霉GXDC1-5产生黄曲霉毒素B1(AFB1),浓度为11.91 ng/m L;黄曲霉HBDC1-5中产生AFB1和AFB2,浓度分别为9.28和1.53 ng/m L;黄曲霉YNDC1-5产生AFB1、AFB2和AFG2,浓度分别为76.09、2.36和1.49 ng/m L。【结论】从党参的表面分离出了3株产黄曲霉毒素Aflatoxin的黄曲霉。     

基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A方法与酶联免疫法的对比研究

[目的]比较基于核酸适配体检测赭曲霉毒素A(OTA)方法与酶联免疫法。[方法]建立核酸适配体检测OTA标准曲线,进行样品加标回收率试验,并与酶联免疫法进行比较。[结果]核酸适配体法检测OTA在0.05～10.00 ng/mL具有较好的线性,饲料样品中添加OTA的回收率为92.0%～93.5%,与酶联免疫法相比,2种方法之间具有较好的一致性。[结论]该研究建立的基于核酸适配体检测OTA方法灵敏度高、准确度好,为研究饲料中OTA的快速检测方法奠定基础。     

高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定大米粉中黄曲霉B1含量

该研究建立了高效液相色谱-柱后光化学衍生法测定大米粉中黄曲霉毒素B_1含量的方法。色谱柱采用安捷伦C_(18)柱(150mm×4.6mm,5μm),以甲醇∶水=40∶60为流动相,采用荧光检测器测定大米粉中黄曲霉毒素B_1的含量。黄曲霉毒素B_1的线性范围为5~100ng/m L,检出限为1ng/m L,平均加标回收率为94.6%,相对标准偏差0.74%。该方法简单、快速、准确、重现性好,适用于大米粉中黄曲霉毒素B_1的定量分析。     

SYBR Green I 结合碳纳米管对金黄色葡萄球菌的快速检测

【目的】建立一种快速、准确检测金黄色葡萄球菌tst 基因的方法,为预防和控制金黄色葡萄球菌感染提供检测手段。【方法】采用一段特异识别金黄色葡萄球菌的DNA探针来识别基因组DNA,通过识别荧光染料SYBR Green I的信号来实现检测。通过对此方法的可行性、单壁碳纳米管最适浓度、目标链最适浓度、特异性等进行验证,建立产TSST-1金黄色葡萄球菌tst 基因的检测体系。【结果】在仅加入终浓度为1.07 nmol/L目标DNA的条件下,荧光值的恢复率达91%,荧光值的增强值为4.764。最适碳纳米管浓度为30 μg/mL,最适目标DNA浓度与探针DNA浓度相等,为1.07 nmol/L。特异性检测结果表明,该检测方法可以区分具有高相似性的序列（2-或12-nt的区别）。【结论】SYBR Green I结合碳纳米管适用于环境、食品及临床检验中对携带tst 基因的金黄色葡萄球菌的快速检测。     

安徽省养猪场饲料中黄曲霉毒素B1污染状况调查

[目的]了解安徽省养猪场所用饲料黄曲霉毒素B_1污染情况,保证养殖场的正常健康生产。[方法]于2017年5—11月对安徽省内不同规模的5家养猪场共采集饲料391组,其中小猪料134组,大猪料257组。用酶联免疫法测定黄曲霉毒素B_1含量。[结果]养猪场饲料黄曲霉毒素B_1污染情况较为普遍,污染率高达99.5%,饲料黄曲霉毒素B_1在饲料中的分布与季节也有一定相关,6—7月梅雨季节,黄曲霉毒素B_1超标情况最为严重。同时用料塔储存的饲料,比单纯用饲料库储存的饲料,其黄曲霉毒素B_1污染情况更加严重。[结论]该研究为企业正常健康生产和人类的动物性食品安全检测提供依据。     

SYBR Green I 结合碳纳米管对金黄色葡萄球菌的快速检测

【目的】建立一种快速、准确检测金黄色葡萄球菌tst 基因的方法,为预防和控制金黄色葡萄球菌感染提供检测手段。【方法】采用一段特异识别金黄色葡萄球菌的DNA探针来识别基因组DNA,通过识别荧光染料SYBR Green I的信号来实现检测。通过对此方法的可行性、单壁碳纳米管最适浓度、目标链最适浓度、特异性等进行验证,建立产TSST-1金黄色葡萄球菌tst 基因的检测体系。【结果】在仅加入终浓度为1.07 nmol/L目标DNA的条件下,荧光值的恢复率达91%,荧光值的增强值为4.764。最适碳纳米管浓度为30 μg/mL,最适目标DNA浓度与探针DNA浓度相等,为1.07 nmol/L。特异性检测结果表明,该检测方法可以区分具有高相似性的序列（2-或12-nt的区别）。【结论】SYBR Green I结合碳纳米管适用于环境、食品及临床检验中对携带tst 基因的金黄色葡萄球菌的快速检测。     

基于核酸适配体的纳米金淬灭罗丹明B荧光法检测氨苄青霉素

研究利用核酸适配体与氨苄青霉素的特异性结合效应以及纳米金对罗丹明B的荧光淬灭反应,通过改变反应体系荧光信号的强弱,从而实现氨苄青霉素的定量检测,建立了氨苄青霉素快速检测的新方法。最佳反应体系条件为适配体终浓度20nmol/L,盐溶液NaCl终浓度0.12mol/L,最优反应为温度30℃。在10mmol/L的3-吗啉丙磺酸(MOPS)缓冲溶液(pH 6.0)的条件下,该方法可检测氨苄青霉素的浓度范围是0.494~2 000nmol/L,其最低检测限为0.494nmol/L,远低于国际相关检测标准。该方法具有检测时效性强、成本低廉、操作简便、反应灵敏等优点,有着良好的推广应用潜能。     

农产品中黄曲霉毒素的时间分辨荧光免疫层析快速检测技术研究

【目的】黄曲霉毒素严重污染农产品,威胁人畜生命健康,是政府重视、社会关注的一大焦点问题,因此亟需研究建立黄曲霉毒素高灵敏高快速检测方法。目前已研制出高特异性高灵敏度黄曲霉毒素单克隆抗体,本研究旨在应用该抗体,建立黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析快速检测技术,为农产品质量监管、风险评估提供技术支持。【方法】本研究通过将黄曲霉毒素抗体与乳胶铕进行偶联标记,利用自主研制的黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析试纸条进行黄曲霉毒素检测,通过检测线T信号值与质控线C信号值的比值和标准溶液浓度的自然对数值实现定量。针对花生、稻米、植物油等不同农产品,研究建立样品粉碎均质提取一体化技术。对铕标记时间分辨荧光免疫层析检测技术进行方法学考核,以花生、稻米、植物油等为例,进行实际样品检测,并与HPLC法进行结果比对。【结果】在花生、稻米、植物油等农产品实际样品检测中,本研究建立的时间分辨荧光免疫层析检测技术检测黄曲霉毒素B₁得到检测限均为0.3 μg·kg^-1,线性范围分别为0.8-25、0.8-15和0.8-30 μg·kg^-1。上述3种农产品对应的标准曲线的线性方程分别为y=0.238x+0.654（R²=0.992）、y=0.321x+0.811（R²=0.990）和y=0.146x+0.173（R ²=0.993）,标准偏差分别为0.024、0.039和0.021。该方法的批内准确度和精密度添加回收试验结果表明,添加回收率在81.0%-113.0%,变异系数在7.2%-14.2%;批间准确度和精密度试验结果显示,添加回收率在75.8%-114.9%,变异系数在7.7%-15.3%。说明该检测技术批内、批间均具有良好的准确度和精密度。该方法与HPLC法检测结果相比,相对误差小于10%,说明黄曲霉毒素时间分辨荧光免疫层析技术与行业标准方法检测结果具有良好的一致性。【结论】时间分辨荧光免疫层析检测技术灵敏度高、线性范围宽,重复性和稳定性好,是一种适合中国国情的实用快速检测技术,具有广阔的应用前景。     

基于复合纳米材料和酶切信号放大电化学适体传感器检测沙门氏菌

【目的】沙门氏菌是食品中致病菌检测的一项重要指标。本研究拟构建一种实用性更强的用于沙门氏菌检测的新型电化学适配体传感器,以克服各种沙门氏菌传统检测方法的缺陷。【方法】通过混合还原氧化石墨烯(rGO)溶液与甲苯胺蓝(Tb)溶液制得Tb-rGO复合物,再将此复合物分散于纳米金(Au NPs)溶胶中得到Au NPs-Tb-rGO复合物。最后将Au NPs-Tb-rGO复合物与带有氨基的DNA链(S1)孵育得DNA-复合纳米材料(S1-Au NPs-Tb-rGO)。通过金硫键将沙门氏菌适配体互补链(S2)修饰在金电极表面,以己硫醇为封闭剂消除非特异性吸附后,滴涂沙门氏菌适配体(Apt)于电极表面,使Apt与S2杂交结合。将修饰好的电极浸入含有沙门氏菌与核酸外切酶I(Exo I)的混合液中,基于Exo I信号放大效应,利用适配体对沙门氏菌的特异性结合作用,循环带离适配体,再通过S1-Au NPs-Tb-rGO中的S1与S2杂交将S1-Au NPs-Tb-rGO负载到电极表面,监测电极表面的电化学信号,并对在菌液中的孵育时间、Exo I浓度和S1-Au NPs-Tb-rGO浓度进行优化,构建沙门氏菌电化学适配体传感器。使用该传感器,对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、单增李斯特菌和阪崎肠杆菌进行检测,以确定沙门氏菌电化学适配体的特异性;对6×10~2—6×10~6 cfu/mL的沙门氏菌进行检测,以确定沙门氏菌电化学适配体传感器的敏感性;对羊奶样品进行检测,以确定沙门氏菌电化学适配体传感器的实用性。【结果】所建立的沙门氏菌电化学适配体传感器在菌液中的最佳孵育时间为1 h,Exo I的最适浓度为0.6 U·μL~(-1),S1-Au NPs-Tb-rGO的最适浓度为200 nmol·L~(-1)。在进行沙门氏菌的检测时,沙门氏菌与Apt特异结合,S1-Au NPs-Tb-rGO复合纳米材料被结合到电极表面使其线性伏安曲线氧化峰升高。特异性试验结果表明,所建立的方法仅对沙门氏菌的检测有电信号响应,而对非目标菌无响应。敏感性试验结果表明,所构建的沙门氏菌电化学适配体传感器,具有很高的敏感性,对沙门氏菌检测的敏感性达200 cfu/mL。使用建立的沙门氏菌电化学适配体传感器对羊奶中的沙门氏菌含量进行测定,加标回收率在91.6%—106.3%,结果令人满意。【结论】所建立的沙门氏菌电化学适配体传感器具有操作简便、检测范围宽、检出限低和成本低廉等优点,有望应用于食品工业中沙门氏菌的现场快速定量检测。     

黄曲霉毒素B_1单克隆抗体修饰金电极检测饲料中的黄曲霉毒素B_1

[目的]建立使用黄曲霉毒素B1单克隆抗体修饰金电极测定饲料中黄曲霉毒素B1的新方法。[方法]试验采用电化学方法优化检测条件,建立标准曲线并对样品进行检测。[结果]试验得出,黄曲霉毒素B1单克隆抗体修饰金电极检测饲料中黄曲霉毒素B1的最优条件为:电极修饰条件为4℃、8 h,磷酸盐缓冲溶液的pH为7.4。该检测方法对黄曲霉毒素B1的线性检测范围为1.427～150.000ng/ml,加标回收率在94.44%～101.36%。[结论]使用该免疫电化学方法,检出限较低,可以用于饲料中黄曲霉毒素的检测。     

QuEChERS-高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱同时测定饲料中17种霉菌毒素

建立同时检测饲料中黄曲霉毒素(B_1、B_2、G_1、G_2)、赭曲霉毒素A、T-2毒素、HT-2毒素、橘青霉素、蛇形菌素、疣孢青霉原、新茄镰孢菌醇、O-甲基杂色曲霉素、杂色曲霉素、青霉酸、环匹阿尼酸、伏马菌素(B1、B2)等17种霉菌毒素的QuEChERS(quick、easy、cheap、effective、rugged、safe,简称QuEChERS)-高效液相色谱-四级杆飞行时间质谱(high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry,简称HPLC-Q-TOF/MS)检测方法。待测样品经乙腈水溶液(含1%甲酸)提取,采用QuEChERS方法净化后,以0.1%甲酸水溶液和乙腈为流动相,经ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×100 mm,1.7μm)分离,结合建立的17种霉菌毒素的标准谱图库,在多反应监测模式进行分析,采用外标法定量。该方法在1.0~200.0μg/L范围内呈线性,相关系数均大于0.990,检出限在0.5~3.0μg/kg之间,定量下限在1.0~10.0μg/kg之间。该方法简便、准确、灵敏、有效,可适用于饲料中17种霉菌毒素的残留检测。     

基于适配体的金黄色葡萄球菌流式细胞术检测方法

本研究以金黄色葡萄球菌为对象,旨在建立一种基于荧光标记核酸适配体的流式细胞术检测方法。通过优化流式细胞仪检测参数、适配体用量及折叠方式,观察适配体针对不同方式处理细菌的识别效果建立检测方法,并对该方法的特异性和灵敏性进行了验证。结果显示:不经高温变性处理的适配体检测结果最佳,适配体最佳使用浓度为250 nmol/L,对活菌识别效果最强。本实验建立的基于适配体的流式细胞术检测方法特异性强、过程简单,40 min于混合细菌中特异性检测、鉴别靶细菌,为金黄色葡萄球菌的检测提供了一种有效方法。     

黄曲霉毒素B1降解菌株的筛选及鉴定

【目的】筛选能降解黄曲霉毒素B1（AFB1）的细菌,以期在该毒素的生物脱毒中得到应用。【方法】以香豆素为惟一碳源和能源进行AFB1降解菌株的初筛,之后将初筛的10株菌分别降解浓度为100μg•kg-1的AFB1。【结果】筛选出的NMO-3菌株降解AFB1能力达85.7%,显著高于其它菌株（P＜0.01）。从形态、生理生化反应以及16S rDNA序列比对等方面分析,最终确定NMO-3菌株为嗜麦芽窄食单胞菌（Stenotrophomonas sp.）。【结论】利用香豆素作为惟一碳源和能源筛选出了黄曲霉毒素降解菌株,后期试验证明活菌制剂在2.56×1010CFU/ml剂量以下不会引起急性毒性反应,用65%硫酸铵提取的蛋白（酶）具有AFB1降解能力。     

荆州周边地区猪场饲料真菌及霉菌毒素的检测

以湖北荆州周边地区3个猪场所使用的饲料为研究对象,采用吸水纸检测法对饲料中的真菌种类进行了调查,并采用真菌毒素ELISA试剂盒对饲料样品中黄曲霉毒素B_1、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素、T-2毒素、呕吐毒素和伏马毒素进行了检测,分析了饲料被污染的程度。结果表明,所检测的配合饲料、全价饲料、玉米和豆粕普遍受到了以上6种霉菌毒素的污染。饲料样品中玉米赤霉烯酮和赭曲霉毒素的检出率高达100%,黄曲霉毒素B_1和T-2毒素的检出率平均在80%以上。     

噬菌体展示纳米抗体模拟黄曲霉毒素抗原的活性表征

【目的】笔者实验室前期免疫并构建噬菌体展示纳米抗体库,应用此抗体库筛选、制备可以用作黄曲霉毒素无毒替代抗原的纳米抗体。本研究旨在探明已筛选出的噬菌体展示纳米抗体Phage 2-5用作黄曲霉毒素替代抗原的活性,为后续纳米抗体的合成以及黄曲霉毒素绿色免疫分析方法的建立奠定基础。【方法】前期,笔者实验室对羊驼免疫黄曲霉毒素抗原（AFB1-BSA）,经过5次免疫后,取血,提取RNA,反转录为cDNA,并采用PCR技术对抗体可变区VHH区域进行扩增,与载体pComb3X偶联,构建噬菌体展示纳米抗体库;经过吸附-洗脱的淘选过程筛选出能够与黄曲霉毒素竞争结合抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11的噬菌体展示纳米抗体Phage 2-5。本研究通过将抗黄曲霉毒素单克隆抗体1C11固定在酶标板上,以噬菌体展示纳米抗体Phage2-5作为竞争抗原,与反应体系中的游离黄曲霉毒素竞争结合抗体,构建酶联免疫分析（ELISA）体系,检测游离黄曲霉毒素含量,并分别对该方法的灵敏度、交叉反应率、缓冲液和样品基质对反应体系的影响进行测定。【结果】采用棋盘法确定了抗体最佳包被浓度为1.25 mg·mL-1,噬菌体最佳使用浓度为5´1011 pfu/mL。在最优条件下建立基于噬菌体展示纳米抗体Phage2-5的ELISA法,对黄曲霉毒素B1的IC50值为0.054 ng·mL-1,对黄曲霉毒素B2、G1、G2、M1的交叉反应率分别为38.6%、70.1%、14.5%、14.6%;反应最高耐受甲醇浓度为20%;当pH值为7.0时,反应灵敏度最高,升高或降低pH对反应灵敏度均有影响;盐离子浓度对反应灵敏度影响不大,反应体系在5´PBS的环境下仍能保持较高活性,但纯水溶液不利于反应的进行;因此,该反应的最佳反应缓冲液是pH值为7.0的0.01 mol·L-1 磷酸盐缓冲液（PBS）,花生、大米、玉米基质对反应体系无显著影响。【结论】噬菌体展示纳米抗体Phage2-5具备良好的模拟黄曲霉毒素抗原的生物活性,用作替代抗原建立的免疫分析方法灵敏度高、甲醇耐受能力强,并且样品基质效应不明显,具有进一步研制黄曲霉毒素模拟抗原的前景。     

北京地区被检饲料及饲料原料黄曲霉毒素污染情况的调查

【目的】了解目前北京市养殖场所用饲料原料和配合饲料受黄曲霉毒素的污染情况、检出频率和特点,为饲料生产和养殖企业提供数据参考。【方法】抽样采集北京市21个养殖场187份饲料样,采用免疫亲和柱-光化学衍生-高效液相色谱法测定黄曲霉毒素（B1、B2、G1和G2）的含量。【结果】玉米、麸皮、豆粕、DDGS、猪配合饲料和家禽配合饲料中黄曲霉毒素B1的检出率分别为50.0%、46.2%、33.3%、94.1%、67.1%和94.3%,平均含量分别为5.98、0.25、1.00、9.83、2.89和1.06 µg•kg-1,超标率分别为6.2%、0.0%、0.0%、5.9%、6.6%和0.0%。【结论】各类饲料不同程度地受到黄曲霉毒素污染,其中AFB1污染程度较严重;部分配合饲料、玉米和DDGS的AFB1平均含量较高,超标率也较高。