基于3 种载体蛋白的莱克多巴胺抗原的合成与检测

为制备高效莱克多巴胺(Ractopamine,RAC)抗体,将人工合成的RAC-琥珀酸酯半抗原与3种载体蛋白(BSA、OVA和KLH)偶联合成人工抗原,采用紫外光谱扫描、测定偶联比和ESI-MS进行鉴定;通过免疫小鼠获得抗血清,采用ELISA比较其效价,对3种人工抗原的免疫原性进行评定,结果显示3种抗血清效价为4000~32000,表明合成的3种人工抗原都具有免疫原性,其中以KLH为载体蛋白的抗原的免疫效果较好,可用于制备高效RAC抗体。     

头孢氨苄人工抗原的合成及多克隆抗体的制备

为合成头孢氨苄(Cefalexin,CEX)的人工抗原,制备特异性的CEX多克隆抗体。采用戊二醛法合成头孢氨苄全抗原CEX-BSA、CEX-OVA,紫外分光光度计(ultraviolet spectrophotometry,UV)、SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)鉴定,用CEX-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定多抗血清效价,阻断ELISA鉴定其敏感性、特异性。结果显示,紫外扫描测得CEX-BSA、CEX-OVA中CEX和BSA、OVA的分子结合比分别为21.7∶1和14.6∶1;SDS-PAGE结果表明,BSA的泳动速度大于CEX-BSA,说明CEX-BSA的分子质量大于BSA,进一步说明CEX与BSA偶联成功;2号小鼠抗血清的效价最高,对CEX的IC50为769.588μg/L,与头孢拉定的交叉反应率为1.283%,与其他药物无交叉反应。说明通过系列ELISA鉴定,获得高价、敏感、特异的多克隆抗体。     

培氟沙星人工抗原的合成与鉴定

【目的】制备培氟沙星(Pefloxacin,PEF)完全抗原,并对其免疫学特性进行鉴定。【方法】以培氟沙星与牛血清白蛋白(BSA)为材料,用碳二亚胺(EDC)法制备培氟沙星-牛血清白蛋白完全抗原(PEF-BSA),变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及紫外扫描(UV)检测其免疫学特性;利用PEF-BSA免疫BALB/c小鼠,无菌条件下收集血清,用间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价。并用同样的方法制备和鉴定培氟沙星-鸡卵清白蛋白完全抗原(PEF-OVA)。【结果】培氟沙星与牛血清白蛋白及鸡卵清白蛋白偶联成功,PEF-BSA偶联比为8∶1,PEF-OVA偶联比为6∶1。间接ELISA测得多抗血清效价均达到4 000以上,得到了较好的免疫效果。【结论】成功得到了培氟沙星完全抗原,该抗原具有较强的特异性及良好的敏感性。     

沙丁胺醇免疫原的合成与鉴定

将沙丁胺醇(SAL)经过琥珀酸单酯化后,采用混合酸酐法与载体蛋白偶联,用紫外扫描(UV)和变性凝胶电泳(SDS-PAGE)方法检验偶联效果,推算分子结合比;制备全抗原后免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定多抗血清效价,阻断ELISA鉴定其敏感性。UV和SDS-PAGE分析结果表明,成功制备了BSA-HS-SAL,SAL-HS与BSA的分子结合比为11∶1;ELISA结果表明,获得了高效价、敏感的SAL多克隆抗体,为SAL残留免疫学检测方法的建立奠定了基础。     

碳二亚胺法制备阿莫西林人工抗原及其鉴定

合成、鉴定了阿莫西林(amoxicillin,AMO)人工抗原,并通过动物免疫法生产了亲和力高、特异性好的鼠源AMO多克隆抗血清。采用碳二亚胺(EDC)法将AMO分别与载体蛋白BSA和OVA偶联,合成完全免疫抗原AMO-BSA和检测抗原AMO-OVA,经紫外分光光度法和SDS-PAGE以及动物免疫进行鉴定。结果表明,偶联后的紫外吸收峰与BSA和AMO相比都发生了一定的位移,AMO-BSA在276nm处出现最大吸收峰,BSA的泳动速度大于AMO-BSA。免疫后获得的3只小鼠多抗血清,通过间接竞争ELISA测定,效价可达1×10-4以上,1号小鼠半数抑制浓度(IC50)为573.75ng/mL,敏感性较好。AMO完全人工抗原的合成以及鼠源多克隆抗体血清的制备,为AMO单克隆抗体的制备奠定了基础。     

培氟沙星人工抗原的合成与鉴定

试验采用碳二亚胺(EDC)法将培氟沙星(PEFX)与载体蛋白进行偶联,用于制备免疫抗原PEFX-BSA与包被抗原PEFX-OVA,通过紫外扫描和SDS-PAGE对人工抗原进行鉴定,免疫原免疫Balb/c小鼠,获得抗体。试验结果表明,间接ELISA方法检测小鼠血清抗体效价达到1∶6 400。为进一步制备抗PEFX单克隆抗体提供了良好的免疫原。     

呋喃唑酮代谢物人工抗原的制备与鉴定

制备了呋喃唑酮代谢物3-氨基-2-■唑烷酮(AOZ)的人工抗原,再采用重氮法将AOZ衍生物2-NP-AOZ与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,制备免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA,通过SDS-PAGE、MALDI-TOF-MS分析其偶联效果。以2-NP-AOZ-BSA皮下注射免疫SPF级BALB/c小鼠,分别于3次免疫和5次免疫后制备血清,以间接ELISA检测血清中2-NP-AOZ抗体效价,间接竞争ELISA检测血清敏感性,鉴定其免疫原性。发现2-NP-AOZ分别与BSA和OVA偶联成功,获得免疫原2-NP-AOZ-BSA和包被原2-NP-AOZ-OVA;MALDI-TOF-MS分析测得偶联率分别为7.1∶1、3.8∶1;BCA试剂盒检测2-NP-AOZ-BSA、2-NP-AOZ-OVA的浓度分别为4.9、5.2 mg/mL。间接ELISA检测3次免疫后小鼠血清抗体效价均达1∶16 000及以上,5次免疫后血清抗体效价均达1∶32 000及以上;半数抑制浓度(IC₅₀)为34.43 ng/mL,人工抗原2-NP-...     

林可霉素人工抗原的合成与鉴定

拟合成并鉴定林可霉素( Lincomycin,LIN)人工抗原,通过动物免疫生产亲和力高、特异性好的鼠源LIN多克隆抗血清.采用高碘酸钠法将林可霉素与牛血清白蛋白(BSA)及鸡卵清蛋白(OVA)分别偶联,合成免疫原LIN-BSA和包被原LIN-OVA,并采用紫外分光光度法(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定.结果表明,半抗原LIN和载体蛋白偶联成功.动物免疫试验(免疫BALB/c纯系小鼠)结果显示,3只小鼠效价均达1∶3 000,且2号小鼠多抗血清抗LIN的半数抑制质量浓度IC50为3.85 μg/L,与莫能菌素的交叉反应率为6.19％,与其他药物无交叉反应.表明成功获得高效价、特异性好、亲和力高的鼠源抗LIN多抗血清.     

百菌清人工抗原的合成及多克隆抗血清的制备

将百菌清(CTN)进行化学修饰后引入羟基活性基团,合成具有半抗原结构特征的百菌清衍生物(CTN-OH);采用N,N-羰基二咪唑法(CDI)将CTN-OH与牛血清白蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联合成人工免疫抗原CTN-BSA和包被抗原CTN-OVA,用紫外分光光度法(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定;通过动物免疫试验获得鼠源多抗血清,并使用间接ELISA和阻断ELISA的方法对多抗血清进行鉴定。结果表明,半抗原CTN-OH与载体蛋白偶联成功;受免3只小鼠的效价均达1∶12 800,且2号小鼠对CTN的IC50为93.593μg/L,成功获得高效价、高敏感性、特异性强的鼠源多克隆抗血清,为CTN单克隆抗体制备及快速检测方法的建立奠定基础。     

诺氟沙星人工抗原的合成

采用碳二亚胺(EDC)法将诺氟沙星(NFLX)分别与载体蛋白BSA和OVA进行偶联。用于制备免疫抗原NFLX-BSA和包被抗原NFLX-OVA。通过对产物进行紫外扫描和SDS-PAGE,证明半抗原与载体偶联成功。以免疫原NFLX-BSA免疫BALB/C小鼠45 d后,通过间接ELISA方法检测效价达1:32 000。这一结果为进一步制备抗NFLX单克隆抗体提供了良好的免疫原。     

苯乙醇胺A人工抗原的制备与鉴定

为合成苯乙醇胺A人工抗原,并制备出鼠源苯乙醇胺A多抗血清,采用琥珀酸酐法改造苯乙醇胺A,应用活化脂法(DCC)和碳二亚胺法(EDC)与载体蛋白相连,合成人工免疫原苯乙醇胺A-BSA和检测原苯乙醇胺A-OVA,并用紫外扫描光谱法、凝胶电泳法(SDS-PAGE)和酶联免疫吸附法(ELISA)鉴定偶联结果.结果显示,在紫外扫描光谱下,合成的免疫原在276 nm处出现最大吸收峰;SDS-PAGE电泳发现,免疫原出现明显的拖尾现象;按10 μg/只的剂量免疫小鼠,共免疫4次,每次间隔3周,最后1次免疫10 d后,断尾采血,经测定,得到的多抗血清的效价均达到1 ∶ 10 000,且1号小鼠多抗血清的敏感性最好,半数抑制浓度(IC50)为536.8 ng/mL,与其他药物的交叉反应率均小于0.5％,具有很好的特异性.成功合成了苯乙醇胺A人工抗原,并得到了敏感性高、特异性好的多抗血清.     

红景天苷人工抗原的合成与鉴定

合成红景天苷人工抗原,为进一步建立免疫学分析方法提供依据,采用高碘酸钠氧化法分别将红景天苷(Salidroside)、牛血清蛋白(BSA)与卵白蛋白(OVA)人工偶联成免疫抗原(SAL-BSA)和包被抗原(SAL-OVA),并利用紫外光谱法、SDS-PAGE法鉴定。用制备的人工免疫抗原免疫小鼠,用间接酶联免疫法测定抗体效价。结果成功制备了SAL-BSA、SAL-OVA两种抗原,SAL-BSA偶联比可达到7∶1,在免疫后的小鼠血清中检出了抗红景天苷的抗体,效价为1∶4 000。成功合成红景天苷人工抗原,为下一步单克隆抗体的制备及建立相应的免疫学分析方法奠定了基础。     

司帕沙星人工抗原合成及鼠源多克隆抗血清的制备

为合成并鉴定司帕沙星（Sparfloxacin, SPFX）人工抗原,制备出相应的鼠源多克隆抗体。采用DCC法将半抗原SPFX与载体蛋白牛血清白蛋白(BSA)及卵清蛋白(OVA)偶联制备免疫原SPFX-BSA和包被原SPFX-OVA,采用UV和SDS-PAGE鉴定与分析;用小鼠进行免疫,采用间接ELISA测定多抗血清效价、阻断ELISA鉴定其抑制。结果表明,SPFX与BSA偶联后,波峰右移,并且SDS-PAGE电泳中BSA的泳动速度大于SPFX-BSA,初步说明SPFX与BSA偶联成功;6只小鼠血清效价均达到1×10⁴以上,且3号小鼠多抗血清敏感性最好,半数抑制质量浓度（IC₅₀） 为237.36 μg/L。通过系列鉴定,成功制备出司帕沙星免疫原和包被原,获得高效价、特异性好、亲和力较高的鼠源抗SPFX多克隆抗体血清。     

沙拉沙星完全抗原的合成及多克隆抗血清制备

为了制备沙拉沙星(SARA)多克隆抗血清,采用碳二亚胺(EDC)法将SARA分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联,制备了免疫原SARA-BSA、包被原SARA-OVA。经SDS-PAGE电泳与紫外扫描初步判定偶联成功,然后用免疫原SARA-BSA分别按20、50μg/只的剂量免疫BALB/c小鼠,共免疫3次,每次间隔3周,于最后1次免疫10d后断尾采血,制备多克隆抗血清。采用间接ELISA方法测定多克隆抗血清效价,间接竞争ELISA方法测定其敏感性和特异性。结果显示,制备多克隆抗血清效价均达1∶10 000以上,IC50为623.5ng/mL,且与其他药物交叉反应率低,具有较好的特异性。     

伏马菌素B_1人工抗原的鉴定及抗体的制备

采用戊二醛(GA)一步法将半抗原伏马菌素B1(FB1)分别与鸡卵清蛋白(OVA)、牛血清白蛋白(BSA)偶联,制备2种具有免疫原性的FB1人工抗原FB1-OVA和FB1-BSA。分别采用凝胶电泳法、紫外光谱法(UV)、红外光谱法(IR)、基质辅助激光分析电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)4种方法鉴定人工抗原偶联效果并测定偶联比。将FB1-BSA作为免疫抗原免疫BALB/c小鼠,FB1-OVA作为固相包被抗原,采用间接酶联免疫吸附法(i-ELISA)测定小鼠抗血清滴度。结果表明:4种方法均鉴定FB1人工抗原合成成功。凝胶电泳法测定FB1-OVA和FB1-BSA相对分子质量分别约为50 000和75 000。MALDI-TOF-MS测定FB1-OVA和FB1-BSA相对分子质量分别为48 009.212和74 355.301,并精确计算FB1-OVA和FB1-BSA偶联比分别为5∶1和10∶1。FB1-BSA免疫后小鼠的抗血清效价为1∶1.25×105,并具有较高灵敏度。     

喹乙醇人工抗原的合成与鉴定

采用琥珀酸酐法合成喹乙醇半琥珀酸酯(OLA-HS),以质谱法对其进行鉴定;活化酯法合成全抗原OLA-BSA、OLA-OVA,以紫外(UV)和凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定之;用OLA-BSA免疫BALB/c小鼠,间接ELISA测定多抗血清效价,阻断ELISA鉴定其敏感性、特异性。紫外扫描测得OLA-BSA、OLA-OVA中OLA-HS和BSA、OVA的分子结合比分别为17.1∶1和12.4∶1;3号小鼠抗血清的效价最高,对OLA的IC50为58.923 ng/mL,与卡巴氧的交叉反应率为1.841%,与其他药物无交叉反应。通过系列ELISA鉴定,获得高价、敏感、特异的多克隆抗体(pAb),为OLA残留免疫学检测方法的建立奠定基础。     

己烯雌酚人工抗原的合成及抗血清的制备

由己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)经过一系列化学反应,合成含有1个羟基活性基团的半抗原己烯雌酚-单羧基丙基醚(DES-MCPE);应用活泼酯法,使DES-MCPE与牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)偶联,合成人工免疫抗原DES-BSA和包被抗原DES-OVA,采用紫外分光光度法(UV)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定,初步判定偶联成功。用DES-BSA以60μg/只的剂量免疫3只BALB/c小鼠,4次免疫后,采集血清,使用间接ELISA和间接竞争ELISA分别测定抗血清的效价与抑制,3只小鼠的效价均可达到1×104以上,其中2号小鼠的半抑制率(IC50)为18.221μg/L,表明已获得灵敏、特异、高效价的抗血清。     

兔抗2,4-D多克隆抗体的制备

采用水溶性碳化二亚胺法(EDC),将2,4-D与牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)共价偶联,分别合成免疫原2,4-D-BSA和包被原2,4-D-OVA,经紫外分光光度计扫描鉴定。用合成的免疫抗原免疫新西兰大白兔,并用合成的包被原进行ELISA试验对抗血清进行定性定量测定,结果表明,获得的抗血清效价达1.6×105。用所制备的抗血清建立间接竞争ELISA方法。优化了ELISA的工作条件,方阵测定确定了包被抗原最佳浓度(5μg/mL),抗血清最佳稀释度(1∶50 000),并建立了ELISA标准工作曲线。工作曲线表明在50~2 000ng/mL浓度范围内呈良好的线性关系,该法检测底限为50 ng/mL。     

培氟沙星抗体的制备

为了制备培氟沙星(PFLX)抗体,采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯(NHS)法将培氟沙星分别与牛血清白蛋白(BSA)、卵清白蛋白(OVA)偶联,制备免疫抗原PFLX-BSA和检测抗原PFLX-OVA,用PFLX-BSA免疫小鼠以获得高效价的抗体。结果显示,免疫抗原PFLX-BSA紫外光谱具有药物和蛋白的叠加特性,其最大吸收峰在277.5nm处,说明载体蛋白BSA与PFLX成功偶联,可用于动物免疫。检测抗原PFLX-OVA最大吸收峰在275nm处,说明载体蛋白OVA与PFLX成功偶联,可用作检测抗原进行包被。间接ELISA检测结果表明,所得小鼠抗血清效价较高,均达1∶32 000以上,说明有特异性抗体产生。该研究成功制备了抗培氟沙星抗体,也进一步证明药物偶联成功。     

盐酸金霉素人工抗原的合成及鼠源多抗血清的制备

采用碳二亚胺法将金霉素(chlortetracyline,CTC)偶联到载体蛋白BSA(牛血清白蛋白)和OVA(鸡卵清蛋白)上,形成免疫原BSA-CTC与包被原OVA-CTC。通过紫外分光光度法和聚丙烯酰胺凝胶电泳法进行抗原鉴定,用间接ELISA测定多抗血清(pAb)效价,阻断ELISA鉴定其敏感性。结果表明,在UV下出现了明显特征峰,BSA-CTC的峰与BSA、CTC相比均发生改变,表明半抗原与载体成功偶联。共免疫了5只小鼠,pAb效价均达到1×10-3,其中3号小鼠多抗血清抑制效价最低,IC50(半数抑制质量浓度)为71.47ng/mL。由此得出,获得了高效价、强特异的盐酸金霉素多抗血清,为盐酸金霉素单抗的制备奠定了基础。