濒危植物蒙古扁桃ISSR反应体系优化

为利用简单重复序列区间(inter simple sequence repeat,简称ISSR)技术研究蒙古扁桃资源遗传多样性评价和种质资源鉴定,利用正交试验法进行L_(16)(4~5)正交设计,从Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq聚合酶活性和模板DNA质量5种因素和4个浓度水平来优化蒙古扁桃ISSR-PCR反应体系。结果表明,最佳反应体系如下:在25μL反应体系中加入2.0 U Taq聚合酶,引物浓度0.80μmol/L,Mg~(2+)浓度2.0 mmol/L,dNTPs浓度0.25 mmol/L,模板DNA质量50 ng。对蒙古扁桃ISSR-PCR反应影响程度排序依次为Taq聚合酶活性引物浓度Mg~(2+)浓度dNTPs浓度模板DNA质量。     

新疆野核桃SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选

利用正交设计对新疆野核桃序列相关扩增多态性PCR(SRAP-PCR)反应体系中的5个因素(模板DNA、Mg2+、引物、d NTPs、Taq DNA聚合酶浓度)在5水平上进行优化,对比不同浓度模板DNA对扩增结果的影响,建立了新疆野核桃SRAP最佳反应体系。结果表明,优化的新疆野核桃SRAP-PCR最佳反应体系为:20μL的反应体系中,2.5μg/m L模板DNA、0.4μmol/L引物、2 mmol/L Mg~(2+)、0.2 mmol/L d NTPs、25 U/mL Taq酶U;最佳PCR扩增程序的退火温度为54℃。各因素扩增结果表明,Mg~(2+)浓度对扩增反应结果影响最大,d NTPs浓度影响最小。运用该体系对新疆野核桃样本进行了验证,表明该体系扩增稳定可靠。用该体系对100个SRAP引物组合进行筛选,筛选出15个扩增条带清晰且多态性丰富的引物组合,为新疆野核桃种质资源研究奠定了基础。     

正交设计优化辣椒SRAP-PCR反应体系及引物筛选

以辣椒基因组DNA为模板,采用L16(45)正交试验设计,对SRAP反应体系中的5种关键因素(Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA)进行优化,结果表明,辣椒SRAP-PCR最佳反应体系为:Taq DNA 聚合酶0.75 U、Mg2+ 0.6 mmol/L、dNTPs 0.2 mmol/L、引物0.8 μmol/L、模板DNA 50 ng,总体积为10 μL.运用该体系对辣椒3份种质材料进行验证,证明该体系稳定可靠,并从198个SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的35个引物组合.该体系的建立与多态性引物组合的筛选为SRAP标记技术在辣椒分子遗传学中的应用提供科学依据.     

小麦SRAP-PCR体系的正交设计优化（摘要）

[目的]优化小麦SRAP-PCR技术体系。[方法]以小麦丰优68为试材,利用正交设计L16（45）对小麦SRAP-PCR反应体系中的5因素（Taq聚合酶、Mg2＋、模板DNA、dNTPs、引物）在4个水平上进行优化试验。[结果]不同因素对小麦SRAP反应体系影响的大小顺序为：Mg2＋〉Taq聚合酶〉dNTPs〉模板DNA〉引物;优化的小麦SRAP-PCR体系为：在20μl反应体系中,包括10×PCR buffer2.0μl、Mg2＋2.0mmol/L、Taq聚合酶2.0U、dNTPs0.2mmol/L、模板DNA40ng、引物0.6μmol/L。[结论]该优化体系为小麦资源SRAP遗传分析奠定了技术基础。     

二次通用旋转组合设计优化辣椒SRAP-PCR反应体系

采用二次通用旋转组合设计,对辣椒SRAP反应体系中的Taq酶用量、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度和模板DNA用量等5个主要因素进行优化。结果表明,筛选出的辣椒最优SRAP-PCR反应体系为Taq聚合酶0.5 U,Mg2+2.3 mmol.L-1,dNTPs 0.2 mmol.L-1,引物0.8μmol.L-1,模板DNA 45 ng,总体积10μL。应用该体系对辣椒18份种质材料进行验证,结果证明该体系可靠稳定。因此,该试验的优化方法和优化体系适用于辣椒SRAP分子标记的研究。     

牡丹SRAP反应体系的建立及正交设计优化

采用L16(45)正交试验设计,对牡丹SRAP(sequence related amplified polymorphism,序列相关扩增多态性)反应体系中的Mg2+浓度、Taq聚合酶、dNTPs浓度、引物浓度、模板DNA浓度5因素4水平正交优化,建立了适合于牡丹基因组的SRAP-PCR优化扩增反应体系,Mg2+浓度为1.5 mmol/L,dNTPs为0.3 mmol/L,Taq酶1.5 U,引物为0.4μmol/L,模板DNA 1.0 ng/μL,总体积20.0μL。     

沙棘SRAP-PCR反应体系的优化及引物筛选

为建立适合沙棘(Hippophae rhamnoides L.)的SRAP-PCR反应体系,对影响SRAP-PCR的Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、模板DNA浓度进行了优化.优化后的反应体系为Mg2+3.0 mmol/L、Taq DNA聚合酶2U/25μL、引物0.8 μmol/L、dNTPs 0.25 mmol/L、模板DNA 30ng/25μL,反应总体系25 μL.利用此体系从30对引物组合中筛选出17对适合沙棘SRAP-PCR的引物,有助于沙棘的分子标记辅助育种研究.     

文昌锥SRAP-PCR体系优化及有效引物筛选

通过单因素试验和正交试验相结合,分析DNA、引物、dNTPs、Taq DNA聚合酶4种因素对文昌锥SRAP-PCR扩增结果的影响,优化建立文昌锥SRAP-PCR体系。结果表明:文昌锥基因组DNA浓度和dNTPs浓度过低或过高均扩增不出产物,而引物浓度和Taq酶用量的增加能提高扩增效率。在适宜浓度范围内,各个因素对文昌锥SRAP-PCR扩增影响大小依次为:引物=dNTPsTaq酶DNA;最优反应体系为:总体系为20μL时,DNA 20 ng,引物0.6μmol/L,dNTPs0.15 mmol/L和Taq酶4 U。经验证,该体系获得的扩增产物清晰、稳定;筛选获得45对有效性引物组合多态性好,可应用于SRAP分子标记技术在文昌锥资源研究。     

苦瓜SRAP反应体系的建立与优化

[目的]分子标记技术的快速发展为在DNA水平上估计苦瓜种质的遗传差异提供了更准确、更高效的方法。[方法]采用正交试验设计,对影响苦瓜SRAP反应体系的5种因素(Mg2+、dNTPs、引物、Taq聚合酶及模板DNA)4个水平进行优化筛选。[结果]确立了适合苦瓜SRAP分析的优化反应体系,即1×buffer,1.0 ng/μl模板DNA,1.5 mmol/L Mg2+,0.3 mmol/L dNTPs,0.5μmol/L引物,0.075 U/μlTaq聚合酶,总体积20μl。[结论]优化的SRAP-PCR反应体系的建立为利用SRAP技术进行苦瓜种质资源分类、遗传图谱构建和基因定位奠定了技术基础。     

梨属野生种质资源SRAP-PCR反应体系优化研究

采用正交直观分析法和新复极差法对影响梨属野生种质资源SRAP-PCR反应的5种因素(Mg2+浓度、d NTPs浓度、引物浓度、Taq DNA聚合酶、模板DNA)4个水平进行优化筛选。结果表明,优化后的梨属SRAP-PCR反应体系为25μL,包括10×PCR buffer 2.5μL,2.0 mmol/L Mg2+,200μmol/L d NTPs,0.4μmol/L引物,1.5 U Taq酶,60 ng模板DNA。     

龙爪槐SRAP-PCR反应体系的建立与优化

以龙爪槐(Sophora japonica f.pendula Hort.)叶片为材料,采用L_(16)(4~5)正交设计试验,对SRAP-PCR反应体系中的Mg~(2+)、dNTPs、Taq DNA聚合酶、引物和模板DNA用量5个因素进行优化,并确立适用于龙爪槐SRAP-PCR反应的最佳体系。结果表明,龙爪槐SRAP-PCR反应的最佳体系为反应总体积12.5μL,Taq酶0.10 U、Mg~(2+)3.0 nmol/L、dNTPs 2.5 nmol/L、正反向引物均为1.2 nmol/L、DNA 100ng,其余体积用ddH_2O补足。各因素水平变化对反应体系的影响影响大小依次为引物、模板DNA、Mg~(2+)、dNTPs、Taq酶。用35个龙爪槐样品对优化体系进行验证,均得到条带清晰、多态性丰富的图谱,证实了该体系的稳定性。     

白芨属SRAP引物筛选及反应体系优化

为给白芨种质遗传多样性评价、分子标记辅助育种和遗传改良研究提供基础,建立适于白芨SRAP-PCR扩增的反应体系,利用L16(45)正交试验设计对白芨SRAP-PCR反应体系中的各影响因子进行探索.结果表明:Mg2+浓度为影响白芨SRAP-PCR反应的关键因素;在优化的20μLSRAP-PCR反应体系中各组分的最适含量为10×Buffer 2.0 μL,Mg2+2.5 mmol/L,dNTPs 0.5 mmol/L,引物0.2μmol/L,Taq酶1.0U,模板DNA 2.0 ng/μL.利用SRAP反应体系,从72对SRAP引物组合中筛选出条带清晰、扩增稳定、多态性好的引物15对.     

辣椒SRAP-PCR反应体系优化及杂交群体多态性引物筛选

[目的]对辣椒SRAP反应体系进行研究和优化,并利用优化体系对164对多态性引物进行筛选。[方法]采用单因素随机试验设计和L25(65)正交试验设计对辣椒SRAP反应体系中6种关键因素(退火温度、Taq DNA聚合酶、Mg2+、dNTPs、引物、模板DNA)进行体系优化,并以"泡椒"×"青皮大椒"的亲本和F1代为材料,利用聚丙烯胺酰胺凝胶进行筛选。[结果]辣椒SRAP-PCR的最佳反应体系为:退火温度35.5℃,Taq DNA聚合酶1.0 U,模板DNA 2.25 ng/μl,dNTPs 0.2 mmol/L,引物0.4μmoL/L,Mg2+2 mmol/L,总体积为20μl。利用该体系,从164对SRAP引物组合中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富、条带稳定的31对引物组合。[结论]该体系的建立与多态性引物组合的筛选为SRAP标记技术在辣椒育种中的应用奠定了基础。     

火焰兰属SRAP-PCR 体系的建立优化及验证

为建立火焰兰SRAP-PCR体系,采用U20(55)均匀试验设计,以10份火焰兰种质基因组DNA为模板,用3对SRAP引物对DNA模板、Mg2+、引物、Taq DNA聚合酶和dNTPs等5个因素的浓度进行优化组合和验证.结果表明,提取的火焰兰基因组DNA纯度高、完整性好;利用引物对Me6/Em6进行PCR扩增,对20个处理初步筛选出扩增条带较清晰,多态性丰富的处理,再用2个DNA模板进行复筛,获得最佳反应体系(20μL):模板DNA 60 ng、Mg2+2.0 mmol/L、引物1.0 μmol/L、Taq DNA聚合酶1.2 U、dNTPs 0.20 mmol/L.最后用2对引物、8份火焰兰种质来验证优化SRAP-PCR体系,其所获条带清晰,多态性丰富.     

褐苞薯蓣ISSR-PCR反应体系的建立与优化

通过单因素考察结合正交试验的方法,基于反应体系中Taq DNA聚合酶量、DNA模板用量、dNTPs浓度、引物浓度、Mg~(2+)浓度等因素对简单重复序列间扩增(ISSR)反应体系进行优化。结果表明,褐苞薯蓣ISSR-PCR的20μL最佳反应体系为Taq DNA聚合酶1. 875 U,DNA模板量52. 5 ng,d NTPs浓度0. 25 mmol/L,引物浓度0. 437 5μmol/L,Mg~(2+)浓度1. 5 mmol/L,10×Taq Buffer 2. 0μL,其余用dd H_2O补齐。     

华山松SRAP-PCR反应体系的优化

为建立华山松SRAP-PCR反应体系,研究先采用L16(45)正交设计对影响华山松SRAP反应的5个因子(DNA模板浓度、Mg2+浓度、dNTPs浓度、引物浓度、Taq酶)在4个水平上进行优化试验。结果表明:各因素对SRAP反应的影响依次为:Mg2+>dNTPs>Taq酶>DNA模板>引物;对SRAP反应结果影响较大的3个因子(Mg2+浓度、dNTPs浓度、Taq酶浓度)进行单因素试验;确立华山松SRAP反应最佳体系为:20μL的PCR体系中含有Mg2+2.2mmol/L、dNTPs0.25mmol/L、DNA模板60ng、Taq酶0.8mol/s、引物0.8μmol/L。将该体系用于华山松的SRAP扩增能获得稳定、清晰的多态性条带。     

椰子SSR-PCR反应体系的优化

为进一步开发利用椰子种质资源和开展分子标记辅助幼苗早期筛选及遗传育种工作,采用L_9(3~4)正交试验设计,探索了椰子SSR-PCR的最佳反应体系。通过对模板DNA、Mg~(2+)、dNTPs、Taq酶、引物、退火温度的筛选优化,建立了椰子SSR-PCR最佳反应体系(10μL)为:模板DNA 60 ng、Mg~(2+)2.5 mmol/L、dNTP 250μmol/L、Taq酶0.5μmol、引物0.5μmol/L、退火温度58℃,在该体系条件下,PCR扩增条带最为清晰,该反应体系的优化,为今后应用SSR标记技术为椰子群体结构分析、种质资源丰富度、基因定位和遗传育种等研究奠定工作基础。     

小豆SSR-PCR反应体系优化及引物筛选

为探索适宜小豆SSR-PCR反应的最佳条件以筛选具有多态性的SSR引物,采用L16(45)正交设计优化影响小豆SSR-PCR反应的5个因素(Mg~(2+)浓度、dNTPs浓度、Taq用量、引物浓度、模板DNA用量),利用优化后的SSR-PCR体系,以10份小豆种质为模板,对80对小豆(50对)和绿豆(30对)的SSR引物进行多态性筛选,得出小豆SSR-PCR的最佳反应体系(20μL):Mg~(2+)浓度2.5 mmol/L,dNTPs浓度1.0 mmol/L,Taq活性1.5 U,引物浓度0.6μmol/L,模板DNA用量30 ng。利用优化后的体系在小豆和绿豆引物中筛选出31对条带清晰、多态性丰富、重复性好的SSR引物,有效扩增率为38.75%。小豆SSR-PCR优化体系的建立及多态性引物的筛选为进一步开展小豆遗传育种研究奠定了基础,为小豆遗传多样性分析和遗传图谱库构建等研究提供了技术参数和理论依据。     

用正交设计法优化臭椿SRAP-PCR反应体系

[目的]确定臭椿SRAP-PCR反应条件,为进一步研究臭椿SRAP分子标记提供依据。[方法]以新疆吐鲁番3号和江西臭椿叶片DNA为材料,利用引物组合EM1-EM8进行SRAP-PCR反应的L16(45)正交试验,建立了臭椿SRAP-PCR反应体系,新复极差法对体系进行方差分析,并对体系的稳定性进行检测。[结果]确定臭椿SRAP-PCR反应体系为:模板DNA 2.5 ng/μl、Mg2+1.75 mmol/μl、dNTPs0.3 mmol/μl、Taq酶0.3 U/μl、引物0.6μmol/μl、10×PCR Buffer 2.5μl;该体系稳定,适用于臭椿的SRAP反应。[结论]该试验优化的SRAP反应体系,将为臭椿种质资源多样性评价、分子标记,以及遗传连锁图谱构建奠定基础。     

籽用西瓜SCoT-PCR反应体系优化及引物筛选

采用L_(25)(5~6)正交试验设计,对影响目标起始密码子多态性-聚合酶链式反应(SCoT-PCR)的5个因素(Taq酶用量、Mg~(2+)浓度、模板DNA用量、dNTPs浓度和引物浓度)进行优化试验,建立了籽用西瓜SCoT-PCR反应体系:Mg~(2+)2.5mmol·L~(-1)、dNTPs 0.15mmol·L~(-1)、Taq酶1.5U、引物0.5μmol·L~(-1)、模板DNA 20ng,总体积20μL。比较各因素对扩增反应的结果,其中以Mg~(2+)浓度的影响最大,Taq酶用量的影响最小。应用22个籽用西瓜品种验证该体系稳定可靠,并从41个SCoT引物中筛选出扩增条带清晰、多态性丰富的22个引物,并逐一筛选出最适退火温度。该反应体系的建立为今后利用SCoT标记技术对籽用西瓜种质遗传多样性评价、指纹图谱构建、种质鉴定、分子标记辅助选择育种等研究提供了新的技术手段。