绵羊肺炎支原体延伸因子Tu基因的分子特性分析

对绵羊肺炎支原体(Mycoplasma ovipneumoniae)参考菌株Y98株和11个临床分离株的tuf基因进行克隆、测序,生物信息学分析及构建进化树,分析绵羊肺炎支原体tuf基因的分子结构特性。结果表明:Y98株和11株分离株tuf基因编码区全长1 209bp,编码402个氨基酸,氨基酸相似性为93.3%~100%,有较高的抗原指数和抗原表位,不含信号肽,平均GC含量为39.80%。Y98株与10个分离株延伸因子Tu存在1个跨膜区,含有6种不同的功能位点。而一分离株该蛋白质存在2个跨膜区,在271—274位点多出1个N-糖基化位点。12个菌株的tuf基因有117个单核苷酸突变位点,其中无义突变为41个,有义突变为76个,造成53个推导的氨基酸变化,主要发生在325—354位点靠近羧基端,有可能导致该蛋白质功能的改变。基于该基因的遗传进化与全基因组建立的进化关系一致,比16SrRNA基因更适合作为绵羊肺炎支原体进化关系的分子靶标。该基因种内保守同时也存在遗传多样性,作为分子分型的潜力值得进一步研究。     

绵羊肺炎支原体Hsp70蛋白C末端基因真核表达载体的构建

为探讨绵羊肺炎支原体(Mo) Hsp70蛋白作为核酸疫苗的可能性,在对Mo贵州分离株Hsp70蛋白基因进行生物信息学分析的基础上,选择Mo Hsp70蛋白C末端基因,将其与载体pcDNA 3.1 (+)进行连接构建重组质粒,通过脂质体转染至CHO细胞,采用RT-PCR和间接免疫荧光方法评价转染效果和真核细胞表达效果。结果显示:Mo贵州分离株Hsp70蛋白的C末端是具有优势抗原表位的区域,通过PCR方法成功扩增出567 bpHsp70蛋白的C末端基因,并成功构建pc DNA 3.1-Hsp70重组质粒,在转染细胞中PCR扩增出预期大小的目的基因,可以观察到特异性的绿色荧光,提示本研究成功构建的重组质粒能在真核细胞中良好表达,为后续Mo Hsp70蛋白抗原性和免疫佐剂特性的研究奠定基础。     

绵羊肺炎支原体贵州流行株P113基因序列分析

为探讨绵羊肺炎支原体贵州流行株P113蛋白基因分子特征,对Mo Y98标准株和Mo贵州流行株(GZ-CS1株、GZ-QX1株)P113基因进行克隆与测序,应用生物信息学软件对测序序列进行变异性、同源性及系统进化关系分析。结果显示,Mo贵州株(GZ-QX1、GZ-CS1)与Y98标准株P113基因全长分别为3 240、3 141和3 240bp;推导氨基酸序列比较显示Mo GZ-QX1株与Y98株高度相似,仅存在2个位点差异;GZ-CS1株与Y98株相比,P113蛋白存在27个点突变,缺失41个氨基酸;GZ-QX1株和GZ-CS1株相对Y98标准株存在第111位点突变和共同缺失19个氨基酸;Mo贵州流行株(GZ-CS1株、GZ-QX1株)与Y98标准株核苷酸同源性分别为98.4%和99.9%,贵州流行株间核苷酸同源性为98.3%;其与四川SC01株的核苷酸同源性分别为90.2%和89.1%。此外,种间比较显示Mo P113基因与猪肺炎支原体P97基因的相似性较高,同源性均大于61.7%,亲缘关系亦较近;而其与丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种之间的同源性较低,都在39.4%以下,其亲缘性也较远。该研究结果为深入探讨绵羊肺炎支原体的遗传变异及其生物学特性关系奠定基础。     

绵羊肺炎支原体贵州株P30基因的遗传进化分析

为了解绵羊肺炎支原体(Mo)贵州株P30基因的进化情况,通过对Mo贵州分离株(GZQX、GZXS、GZHZ、GZKY)、Mo Y98标准株的P30基因进行体外扩增、克隆以及测序,并对所测序列运用生物信息学软件进行基因变异性、基因同源性以及基因进化树分析。结果:(1)基因同源性:4株Mo贵州分离株与Mo Y98标准株核酸序列相似性在94.9%～99.4%之间。其中GZQX株与标准株同源性最高,达到99.4%。Mo贵州分离株与绵羊肺炎支原体四川分离株(Mo SC01)、猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae)、絮状支原体(Mycoplasma flocculare)的P30基因同源性在70%～80%之间;与其他支原体同源性均在30.0%以下。(2)系统进化树分析显示:4株Mo贵州分离株与Mo Y98标准株的P30基因处于同一进化分支,亲缘关系最近;与牛支原体(Mycoplasma bovoculi)、鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum)亲缘关系次之;与Mo SC01、絮状支原体、猪肺炎支原体、肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)亲缘关系最远。结论:Mo贵州株P30基因种属特异性好,种内保守,可作为基因工程疫苗的候选靶标基因。     

牛支原体内蒙古分离株脂蛋白vspY基因的克隆和序列分析

旨在为进一步研究牛支原体内蒙古分离株（NM 2012）的vsp Y1、vsp Y2基因功能提供依据。根据已发表的牛支原体vsp Y1、vsp Y2基因序列设计引物,对NM 2012株的vsp Y1、vsp Y2基因进行克隆、测序,并与已发表的相关序列进行相似性比较;采用在线生物信息学分析工具对NM 2012株的vsp Y1、vsp Y2推导的氨基酸的相似性、保守结构域、跨膜结构、信号肽、脂蛋白、抗原表位进行预测。结果表明,牛支原体内蒙古分离株（NM 2012）的vsp Y1、vsp Y2基因大小分别为1 029 bp和804 bp,分别编码342和267个氨基酸组成的完整开放阅读框;vsp Y1与已发表的牛支原体vsp Y1基因相似性为99.4%~100%,其推导的氨基酸序列相似性为98.6%~99.7%,vsp Y2与已发表的牛支原体vsp Y2基因相似性为100%。根据生物信息学软件分析结果推测,vsp Y1蛋白是潜在的毒力因子。     

禽白血病病毒贵州流行株gp85基因的序列分析

为了解禽白血病病毒(ALV)gp85基因的特点,采用Primer Premier 5.0设计一对特异性引物,对gp85基因进行扩增、克隆及序列测定,用相关生物学软件对贵州流行株gp85基因进行序列分析,并对其编码蛋白进行二级结构、B细胞表位、保守结构域、跨膜结构域和信号肽预测。测序获得921 bp长的序列,将此流行株命名为ALV-GZ-16。分析发现,流行株ALV-GZ-16的gp85基因核苷酸序列与J亚群中国分离毒株的gp85基因序列同源性为97.5%~99.9%,其编码的氨基酸序列与J亚群中国分离毒株的同源性为96.8%~99.7%;系统进化分析显示,该流行株与J亚群原型毒株处于同一分支,与贵州分离株GZN49处于同一小分支;其二级结构中无规则卷曲和β-折叠所占比例较大;预测此蛋白存在4个B细胞优势抗原表位,无跨膜结构和信号肽区域。研究结果进一步完善了贵州省禽白血病病毒流行株的生物学特性,为gp85蛋白特异性抗体的制备提供一定的理论基础。     

绵羊肺炎支原体Y98株未知基因Hsp70（DnaK）的克隆

绵羊肺炎支原体（Mycoplasma ovipneumoniae,MO）是绵羊传染性胸膜肺炎（Contagious ovine pleuropneumo-nia）的主要致病菌。热休克蛋白Hsp70也叫（DnaK）,具有分子伴侣和免疫的作用。本试验以MO Y98基因组为模板,通过比对15种支原体Hsp70基因的序列并设计简并引物,分别利用同源克隆和染色体步移—Tail-PCR技术克隆到了四段Hsp70（DnaK）基因片断并进行了核苷酸序列测定。利用序列拼接软件对克隆的四段序列进行序列拼接,通过ORF Finder软件分析出了MO Y98的Hsp70的开放式阅读框架,预测分析该基因是由1 815bp组成,编码604个氨基酸。本试验于国内外首次克隆到了MO的Hsp70基因序列,为MO的抗原研究以及Hsp70的功能研究等奠定了基础。     

山羊支原体肺炎亚种Hsp70基因克隆与序列分析

山羊传染性胸膜肺炎(contagious caprine pleuropneumonia,CCPP)是由山羊支原体山羊肺炎亚种(M.capricolum subsp.Capripneumoniae,Mccp)引起的高度接触性传染病,热休克蛋白Hsp70,在Mccp所有蛋白翻译后功能和结构的表达起作用。以Mccp中国分离株87001为模板,扩增了Hsp70的全序列,将该序列克隆到pMD18T载体上并测序。将序列与其它已知动物支原体的Hsp70序列进行分析比较。测序结果87001株Hsp70基因全长1773bp,编码591个aa,第631～633位TGA在支原体编码色氨酸而不是作为终止密码子。将该序列与多种致病支原体Hsp70基因进行分析比较,发现87001株Hsp70基因与山羊支原体山羊亚种(Mcc)、丝状支原体丝状亚种SC的DNA同源性为99.3%～99.4%,氨基酸同源性为99.2%～99.3%,而与非同种支原体猪肺炎支原体232株等Mhp菌株的DNA和氨基酸同源性仅为64.5%～74.4%和59.3%～77%。这表明DnaK基因在种内高度保守,种间差异较大。原核表达得到大小为41Kd的目的蛋白,经Westernblot证实,纯化蛋白可与Mhp阳性猪血清反应,具有免疫活性。     

日本血吸虫期别差异基因的Th细胞表位预测及串连多表位的原核表达

目的表达日本血吸虫(Schistosoma japonicum)转录本组中筛选获得的候选抗原基因Th细胞表位,以备免疫试验验证,为建立大规模、高通量、快速鉴定日本血吸虫Th细胞表位的方法奠定基础。方法应用数据挖掘技术,按照序列在不同期别转录本的数量,从Feng L iu等公布的转录本组EST序列中筛选出期别差异表达基因,选择具有完整可读框的序列作为抗原候选基因,其所编码蛋白按照有无信号肽和跨膜结构分为:信号肽跨膜结构组、非信号肽、跨膜结构组序列组。对编码蛋白应用表位预测服务器PRED-BALB/c、SYFPEIT、MHCPred、Rankpep分别对I-Ad、I-Ed、I-Ak、I-Ek型MHC分子进行表位预测。各期别各组筛选出5条最优混合预测表位。选择童虫期信号肽和跨膜结构组(m ep1)和非信号肽、跨膜结构组序列组(m ep2)的各5条最优15肽表位,分别设计并合成其编码核苷酸,克隆到原核表达载体pET-28 a( )进行表达、纯化。结果筛选到不同期别差异表达基因166条。表位预测后,总共筛选出40条最优混合表位,各期别各组5条。将童虫期目的基因m ep1和m ep2成功合成和克隆到了表达载体pET-28 a( ),目的基因m ep1表达量很高,而m ep2未见表达,纯化得到m ep1表达蛋白。结论成功表达了串连抗原表位,为进一步分析其免疫原性、鉴定出有效表位做好了准备。     

羊口疮病毒QD/2015株B2L基因克隆及生物信息学分析

为分析羊口疮病毒(ORFV/QD/2015株)B2L基因的分子特征,预测其编码蛋白的生物学功能,对其B2L基因进行PCR扩增、克隆及序列测定,应用生物信息学相关软件及方法,对扩增所得的基因进行序列分析,并对其编码蛋白的二级结构、细胞抗原表位、三级结构、跨膜结构域和信号肽等进行预测和分析。结果显示:ORFV/QD/2015株B2L基因序列长1 137 bp,编码379个氨基酸;该毒株与其他12株羊口疮病毒参考株的B2L基因核苷酸序列同源性为96.8%~99.7%,氨基酸序列同源性为96.8%~99.2%。系统进化分析显示,ORFV/QD/2015株与2015年分离到的ORFV/Shaan Xi/2015/China株亲缘关系最近;B2L基因编码蛋白二级结构以α-螺旋区域和β-折叠区域所占比例较大,预测此蛋白可能存在7个细胞优势抗原表位,无跨膜区域,无信号肽区域;三级结构呈弯曲状螺旋结构。     

牛支原体新疆分离株P48基因克隆及分子特征分析

本研究旨在分析牛支原体P48基因的序列特性、蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株P48基因序列（GenBank登录号：CP002188.1）设计特异性引物,运用Overlap-PCR扩增获得P48基因全长,其目的片段连接到pMD19-T载体上并进行测序,利用生物信息学方法分析和预测其核苷酸序列及其编码蛋白的理化性质、结构功能（信号肽、跨膜结构、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构和三级结构）。结果显示,分离株P48基因序列为1 407 bp,与Mb PG45国际标准株的同源性为100%,聚类于一支;P48基因编码467个氨基酸残基,组成一个无跨膜、稳定的亲水性蛋白;P48蛋白存在信号肽,有44个潜在的磷酸化位点和1个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（41.76%）,无规则卷曲次之（37.69%）。功能预测显示,在信号转导、胁迫应答、受体等方面该蛋白存在较高概率。本研究成功克隆了分离株P48基因片段,其编码的蛋白是一个稳定可溶、亲水性蛋白,为分析分离株P48基因的特性和功能提供了一定的理论基础和科学依据。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒JL株 Nsp10基因生物信息学分析

本研究旨在对高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)贵州JL株Nsp10基因(GenBank登录号:EU886322)进行生物信息学分析,了解其生物学特征,为下一步Nsp10的表达和ELISA检测方法的建立奠定基础。应用BioEdit、DNAStar、PsortⅡ、SignalP、TMHMM、ProtFun、Clustal_1.81、Mega等软件对Nsp10蛋白的理化参数、信号肽、跨膜区域、亲水性、表面可及性、抗原性、二级结构、亚细胞定位及与其他PRRSV毒株相应片段同源性等进行分析和预测。该蛋白理论分子质量为26.38 ku,pI为8.93,为稳定蛋白,不含信号肽,无跨膜结构,具有良好的形成抗原表位的条件。亚细胞定位结果表明,该蛋白极有可能位于细胞质,其编码氨基酸序列与参考毒株同源性为97.4%~100%。该蛋白保守性较高,是可溶性蛋白,有良好的抗原性,具备作为靶蛋白建立免疫方法的条件。     

猪伪狂犬病病毒SL株TK基因的克隆与生物信息学分析

本试验对伪狂犬病病毒SL株(四川分离株)TK基因进行克隆,并对TK基因的同源性、遗传进化树、密码子偏嗜性、氨基酸结构及亲疏水性、跨膜区、信号肽进行了分析。结果显示,本研究成功克隆了PRV SL株TK全基因,其编码区长963 bp,编码320个氨基酸残基,与其他PRV分离株核苷酸序列同源性超过99.3%,编码的多肽链中疏水区域大于亲水区域,不含跨膜区及信号肽,不存在于病毒囊膜。     

牛支原体新疆分离株oppD/F基因克隆及分子特征分析

试验旨在分析牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列,并探究其序列特征及编码蛋白的结构和功能。根据GenBank中PG45菌株oppD/F基因序列（登录号：AF130119.1）设计1对引物,应用PCR技术扩增获得分离株oppD/F基因,将oppD/F基因片段克隆至pMD19-T载体中进行测序,在采用生物信息学方法分析其核苷酸序列的基础上对其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、可溶性、信号肽、跨膜域、亚细胞定位、磷酸化位点、糖基化位点、二级结构、三级结构和功能等进行分析和预测。结果显示,牛支原体新疆分离株oppD/F基因序列全长1 617 bp,与Mb PG45株和Mb JF4278株的同源性均为100%,处于同一分支;该基因编码蛋白是由539个氨基酸残基组成,不存在信号肽及跨膜结构,是一种稳定的亲水性蛋白质;oppD/F蛋白存在1个AAA家族结构域,50个潜在的磷酸化位点和3个糖基化位点,其二级结构是混合型,其中α-螺旋所占比例最高（61.78%）,无规则卷曲次之（20.78%）。功能预测结果显示,oppD/F蛋白在信号传导、受体、结构蛋白、离子通道、免疫应答和胁迫应答等方面的几率均较高。本研究结果为进一步分析牛支原体oppD/F基因的功能提供了一定的理论依据。     

山羊HSPA6蛋白的特性分析及互作蛋白网络构建

为了研究山羊热休克蛋白70（HSP70）家族成员HSPA6基因编码蛋白的结构与功能特性,本研究利用生物信息学方法,分析了山羊HSPA6基因编码蛋白的氨基酸组成、基本理化性质、亲疏水性、跨膜区结构、信号肽、可能的磷酸化修饰位点、亚细胞定位,以及蛋白的二级结构和三级结构;选取多种生物的同源HSP70蛋白序列构建系统进化树,另外还对HSPA6进行了蛋白互作网络分析。结果显示,山羊HSPA6蛋白序列与哺乳动物（牛、猪）的序列同源性较高;山羊HSPA6蛋白分子质量为70.9 ku,理论等电点为5.78,属于酸性蛋白和亲水性蛋白,无跨膜结构和信号肽;蛋白质功能预测结果显示,HSPA6包含10个分值很高的可能磷酸化位点,这些位点分布在N-端的核苷酸结合结构域（NBD）和C-端的多肽结合结构域（PBD）。经序列分析发现,HSPA6 C-端含有EEVD基序,是HSP70家族蛋白定位于细胞质的保守基序,表明HSPA6主要分布在细胞质。蛋白质二级结构主要以α-螺旋和无规则卷曲为主,分别占41.52%和33.75%,为混合型蛋白;蛋白互作网络构建结果显示,和HSPA6相互作用的蛋白包括HSP70家族成员,另外也有HSP40、HSP90家族成员,预示着山羊HSPA6可能在细胞内与HSP40和HSP90形成复合体发挥作用。本试验结果为进一步深入探讨山羊HSPA6响应环境应激的功能机制提供了理论依据。     

应用荧光定量PCR筛选绵羊肺炎支原体最适生长培养基

为筛选绵羊肺炎支原体(Mo)最适生长培养基,针对Mo 16S rRNA基因设计特异性引物FQs/FQa,建立可定量检测Mo 16S rRNA基因FQ-PCR方法,通过检测不同培养时间各Mo培养液中Mo Y98株核酸含量,比较Mo于不同培养基中培养特性,以筛选Mo最适生长培养基。结果,以Broth-ame与TSB1培养Mo 7,10和14 d时Mo核酸检测值较高,较Frey-ame、PPLO-ame更适合Mo生长。本研究为后续Mo生物学特性分析奠定了基础。     

细粒棘球蚴脂肪酸转运蛋白生物学特性分析

本研究根据NCBI GenBank数据库中的Eg-FATP氨基酸序列,采用生物信息学方法分析细粒棘球蚴脂肪酸转运蛋白(Eg-FATP)理化性质,亚细胞定位、抗原表位、信号肽、跨膜区二级和三级结构、系统进化树、蛋白互作网络等,并通过qPCR方法探究其在原头蚴和包囊壁的差异表达,旨在为后期相关的研究提供理论支持和数据参考。结果显示,Eg-FATP蛋白无信号肽,无跨膜区,亚细胞定位于细胞质;该蛋白有10个B细胞线性表位和14个CTL细胞表位;系统发育分析显示:细粒棘球蚴的FATP蛋白与多房棘球蚴亲缘关系较近,细粒棘球蚴中国株和英国株之间的氨基酸序列同一性较高,为97%左右。预测的互作功能蛋白可能参与胆固醇代谢的调节、脂肪酸跨血屏障的转运等过程;GO和KEGG富集分析结果显示,Eg-FATP对长链和超长链脂肪酸具有酰基辅酶A连接酶活性;qPCR结果显示,FATP基因在原头蚴阶段转录水平较高于包囊壁,具有统计学意义(P<0.05)。本研究对细粒棘球蚴FATP基因的生物学特性进行了初步分析,为进一步揭示其生物学功能奠定了基础。     

猫泛白细胞减少症病毒北京株NS1基因克隆与生物信息学分析

为分析猫泛白细胞减少症病毒（FPV）北京株（FPV-BJ 05株）NS1基因的分子特征及其编码蛋白的生物学功能,本研究对FPV-BJ 05株NS1基因进行PCR扩增、克隆及序列测定。应用生物信息学软件分析FPV-BJ 05株与GenBank上登录的11株FPV参考株NS1基因的同源性,并预测NS1蛋白理化性质、信号肽、跨膜结构、B细胞抗原表位、磷酸化位点、亚细胞定位及蛋白结构与功能、高级结构等。结果显示,NS1基因全长2 007 bp,编码668个氨基酸,且与其他FPV分离株NS1基因核苷酸序列同源性为98.8%~99.3%,氨基酸序列同源性为97.9%~98.8%。系统进化树分析结果显示,FPV-BJ 05株NS1蛋白与GenBank上登录的3株FPV参考株处于同一大分支,但由于氨基酸的突变导致其属于独立的一小分支。NS1蛋白既无信号肽也无跨膜结构域,属于非分泌型的疏水性蛋白。B细胞抗原表位预测结果显示,NS1蛋白柔韧性较好,抗原性及表面可及性较高,预测该蛋白含有13个优势抗原位点。修饰结构预测表明,NS1蛋白含有62个潜在磷酸化位点,27个O-糖基化位点和2个N-糖基化位点。亚细胞定位结果显示,NS1蛋白在细胞质和细胞核的概率较高,分别为69.6%和17.4%。NS1蛋白二级结构中α-螺旋、延伸链、无规则卷曲和β-转角分别占39.37%、15.42%、39.37%和5.84%。应用在线软件SWISS-Modle对NS1蛋白进行建模,预测其三级结构,结果发现NS1蛋白主要以α-螺旋为主。本试验结果将为北京地区FPV免疫诊断及核酸疫苗研究提供理论依据。     

Cloning and Bioinformatic Analysis of L1 Gene of BPV from Guizhou Province

In order to study and analyze L1 gene of bovine papillomavirus（BPV）in Guizhou province,the L1 gene of BPV-GZ01 strain was amplified,cloned and sequenced using bioinformatic softwares and methods,and the secondary structure,tertiary structure,B-cell preponderant epitope,conserved domains analysis, transmembrane domain and signal peptide of L1 gene were predicted.The results showed that the length of L1 gene was 1 494 bp,encoding 497 amino acids.The L1 gene of BPV-GZ01 strain shared an amino acid identities of 98.6%,99.4%,98.4%,94.4% and 91.3%,and a nucleotide identities of 99.1%,99.8%,99.4%,87.6% and 82.8% with those of BPV2,BPV2-SW01,BPV2-AKS01,BPV13 and BPV1 strains,respectively.The results of phylogenetic tree analysis indicated that there was a close relationship between BPV-GZ01 and BPV2-SW01 strains.The prediction of secondary structure of L1 protein indicated that the random coil,extended strand and alphahelix took a higher percentage.The L1 protein was supposed contain 6 potential antigen epitopes.And no transmembrane domains and no signal peptide were found.The tertiary structure of L1 protein was curved spiral structure.These results provided a theoretical basis for immunologic diagnosis and further research of nucleic acid vaccine of BPV.     

桑树matK基因的生物信息学分析

利用生物信息学软件对桑树matK基因进行分析,对matK氨基酸序列的理化性质、疏水性/亲水性、信号肽、跨膜结构域、二级结构及同源建模、亚细胞定位、聚类分析、结合区进行预测分析,同时构建桑树等13种生物的同源树。结果表明：matK氨基酸序列由20种、505个氨基酸组成,无信号肽,为亲水性非跨膜蛋白,二级结构以α螺旋为主,无法进行同源建模,存在6种GO功能和9个结合区,亚细胞定位证实matK氨基酸序列只存在于真核生物叶绿体中,桑树等13个物种matK氨基酸序列具有高度的同源性。