弓形虫E/SA疫苗对小鼠抗弓形虫感染的保护作用

用细胞培养方法制备了弓形虫(GJS 株)ES 抗原(Exceted/Sereted Antigen,E/SA),用油佐剂 M206按不同剂型制备 ES 苗,随机分组免疫健康小鼠(昆明鼠,23～25 g·只~(-1)),每组5只,皮注/腹注0.3 mL·只~(-1)。其中:组1,E/SA 浓缩苗;组2,E/SA 苗;组3,E/SA-H 浓缩苗;组4,E/SA-H;组5,培养液对照;组6,M206对照.另设:组7,健康攻毒对照;组8,健康对照.先后免疫2次(间隔15 d),第28 d 用弓形虫 GJS 速殖子强毒攻毒,每鼠腹注10~2.免疫前后分别取尾血片检测弓形虫血清抗体(IHA 法).     

东莞2010～2016年猪弓形虫流行病学调查与分析

弓形虫病是一种由刚第弓形虫引起的,呈全球性分布的人畜共患寄生虫病,因宿主广泛,传染源复杂、人和动物感染率高,给人体健康和畜牧业发展带来严重威胁。弓形虫是专性细胞内寄生的原虫,多数宿主感染后无症状,但对一些免疫功能不健全和先天感染的人或动物来说可引起严重病变。母猪可通过胎盘感染胎儿,导致早产、流产、畸形胎等。随着东莞市社会经济的发展,养殖业以散养为主,养殖防疫和卫生条件无法规范进行,这势必会增加防控猪源弓形虫的难度。为了解东莞市猪弓形虫感染情况,预测今后我市弓形虫感染变化情况,为预防人畜共患病提供准确的数据,在2010~2016年期间,随机采集了东莞市32个镇(街)猪血清,使用正向间接血凝方法对猪弓形虫进行了流行病学调查。     

猪子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞的分离培养

为了获得高纯度的猪子宫内膜基质细胞和腺上皮细胞,对猪子宫内膜进行胶原酶消化,分离基质细胞和腺上皮细胞进行体外培养,研究其生长特性.结果表明:猪子宫内膜组织在37℃、通过1 g/L胶原酶Ⅰ消化90 min可以获得游离的腺体,对腺体进行培养时上皮细胞比例可达70％以上.培养过程中采用差速消化和差速贴壁可以成功分离腺上皮细胞和基质细胞.基质细胞最适贴壁时间为25 min,腺上皮为3h.纯化的基质细胞生长迅速,可传5代以上,上皮细胞生长缓慢,并且成片脱落.     

猪弓形虫病的中西药结合治疗效果

为研究中西药结合对猪弓形虫病的疗效,将日龄一致、体重相近的5窝(共50头)40日龄健康猪随机分为4组:中药治疗组、西药治疗组、中西药结合治疗组和对照组.先将各组猪腹腔接种弓形虫滋养体,感染24h后治疗组开始用药,对照组不用药,并检测4组猪腹水含虫量.再将感染猪的病料接种小白鼠,进行动物回归试验,同时观察各组猪只的临床表现并采取双抗体夹心一步ELASA法检测弓形虫循环抗原.结果表明:中西药结合组对猪弓形虫滋养体的杀灭作用较好,其血清循环抗原转阴速度明显比其他3个试验组快,值得在临床上推广应用.     

猪圆环病毒2型培养方法的研究

利用有限稀释法从含猪圆环病毒2型(PCV2)的PK15细胞中克隆得到1株含PCV2高感染比例的PK15-A8细胞株,初步研究了该克隆株中PCV2增殖的特性及稳定性。间接免疫荧光试验结果表明,将该克隆株在方瓶中静置培养连续传代40代后病毒滴度最高可达10~(7.5)TCID_(50)/mL,用生物反应器培养病毒滴度最高可达10~(8.0)TCID_(50)/mL以上。利用常规方瓶培养细胞方法,在37℃培养96h,收获得到猪圆环病毒2型病毒液。本研究结果为进一步开发高效价的PCV2全病毒灭活疫苗奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌灭活疫苗(SYS株)生产工艺的初步建立

为制备副猪嗜血杆菌灭活疫苗并对其生产工艺进行优化,试验分别对制苗过程的发酵工艺和灭活工艺进行优化,对制备的疫苗进行质量检测,并分析免疫效果。结果表明,制苗用含10%新生牛血清和15μg·m L-1NAD的TSB培养基,并按培养基总量2%~4%分别接种副猪嗜血杆菌各菌株二级种子液,设定搅拌速度为100 r·min-1,37℃培养10 h收获菌液,可获得理想的制苗菌液;0.3%的甲醛于37℃灭活24 h,可完全灭活菌液。按照优化后的工艺制备的灭活疫苗是安全的。     

几种不同免疫程序制备抗弓形虫高免血清的比较

用弓形虫血清抗体阴性的健康家兔,以4种不同的免疫程序皮下接种弓形虫速殖子裂解抗原制备高免血清.研究结果表明,先以完全弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂分别进行一免和二免,然后再以抗原进行三免或四免制备高免血清,其抗体效价高达1:4096(IHA),与每次都使用抗原的传统免疫程序制备的抗体效价相当,但所用抗原剂量减半,该法优于另外2种免疫程序.     

PEDVN蛋白单克隆抗体的制备及间接免疫荧光检测方法的建立

【目的】制备猪流行性腹泻病毒(PEDV) N蛋白单克隆抗体,并建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法。【方法】以重组表达的PEDV N蛋白为免疫原,免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,分离高抗体效价小鼠的脾细胞,与SP2/0细胞融合。筛选分泌抗PEDV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株。在已经感染PEDV的Vero细胞中,以抗PEDV N蛋白的单克隆抗体为一抗,FITC-羊抗鼠IgG为二抗,建立PEDV的间接免疫荧光检测方法。【结果】制备的杂交瘤细胞株可以稳定分泌抗PEDV N蛋白抗体,细胞上清液的ELISA抗体效价在1∶3 200以上,而诱导的小鼠腹水抗体效价在1∶1 000 000以上。将单克隆抗体应用在间接免疫荧光试验时,最适条件为-20℃80%(φ)丙酮溶液中固定30 min;一抗用PBS缓冲液按体积比1∶1 000稀释,4℃条件下过夜孵育;二抗用PBS缓冲液按体积比1∶100稀释,37℃条件下孵育1 h。以建立的间接免疫荧光试验方法检测细胞中的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪伪狂犬病毒(PPRV)、猪肠道α冠状病毒(PEAV)、猪轮状病毒(PoRV)和PEDV,只有PEDV显示阳性,其他病毒均为阴性。【结论】制备了抗PEDV N蛋白单克隆抗体,以该抗体为一抗建立检测PEDV的间接免疫荧光试验方法具有良好的特异性,为PEDV的实验室检测及PEDV在培养细胞中的定位和动态分布提供了有效的手段。     

猪附红细胞体的体外培养研究

用RPMI—1640和胎牛血清按比例混合并添加肌苷作为体外培养猪附红细胞体（M．suis）的基础培养基,以无附红细胞体感染的兔红细胞泥作为培养寄生载体,置于体积分数为5％CO,的37℃生化恒温培养箱进行M．suis的体外培养研究．结果表明,培养时每24h换培养液1次,每36h传代1次,可连续传代40代次以上,并能保持最高感染率90％以上;感染M．suis的猪红细胞在4℃条件下可保持30d以上而不发生溶血;兔红细胞接种新鲜制备的自然感染M．suis的猪红细胞,36h后感染率可达91．6％,并一直维持到96h,96h后有少量细胞开始出现溶血;接种4℃条件下保存30d以内自然感染M．suis的猪红细胞与新鲜制备的自然感染M．suls诂的猪红细胞对兔红细胞的感染率影响差异不显著．     

γ-干扰素对弓形虫MIC3的基因免疫效果研究

将编码弓形虫微线蛋白3(MIC3)的真核表达质粒pcMIC3和编码γ-干扰素(IFN-γ)的真核表达质粒pcIFN-γ各100μg混合肌肉注射,间隔2周、3次免疫Balb/c小鼠,同时设相同剂量的pcMIC3、pcDNA和PBS免疫对照组。分别以酶联免疫吸附试验(ELISA)、四氮甲唑蓝(MTT)比色法和乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测试验小鼠血清的特异性抗体、脾淋巴细胞的增殖应答和细胞毒性T细胞(CTL)活性,并观察腹腔接种弓形虫RH株速殖子后质粒的免疫保护效果。结果表明:与其它试验组相比,pcMIC3 pcIFN-γ组试验小鼠在免疫8周后的ELISA抗体水平、脾淋巴细胞的增殖应答和CTL活性显著或极显著提高,免疫小鼠45 d时的生存率为100%,能有效抵抗小剂量弓形虫强毒株的攻击。     

巨噬细胞介导PCV2诱导体外培养仔猪淋巴细胞凋亡的研究

选用5头猪圆环病毒2型(PCV2)及猪呼吸和繁殖综合征病毒(PRRSV)抗体阴性普通断奶仔猪,无菌分离脾脏淋巴细胞和巨噬细胞(macrophage,Mφ),分别以PCV2和PCV2+Mφ与淋巴细胞相互作用,同时设Mφ和淋巴细胞对照组.培养0、6、12、24 h后分别收取各组淋巴细胞,用流式细胞术对细胞凋亡率进行测定,半定量RT-PCR法测定淋巴细胞Fas和FasL mRNA的转录情况.结果显示:PCV2+Mφ组的淋巴细胞凋亡率在24 h时显著高于其他3组(P<0.05).PCV2+Mφ组的淋巴细胞6 h时Fas mRNA转录量显著高于空白对照组(P<0.05),24 h时显著高于其他3组(P<0.05).FasL mRNA的转录变化与Fas mRNA基本一致.相关性分析表明,淋巴细胞凋亡率和Fas(FasL)mRNA的转录呈极显著相关(Fas:P=0.000,r=0.606;FasL:P=0.000,r=0.579).表明:巨噬细胞能介导PCV2诱导体外培养淋巴细胞的凋亡,这种细胞凋亡的发生与Fas/FasL系统紧密相关.     

猪弓形虫特异PCR诊断方法的建立

[目的]建立特异PCR方法诊断猪弓形虫病.[方法]以核糖体DNA第一内转录间隔区(ITS1)序列作为弓形虫种特异的遗传标记,优化PCR反应条件,对猪弓形虫分离株和临床病料进行检测.随机取阳性PCR扩增片段进行克隆,测序鉴定.[结果]在猪弓形虫分离株中PCR扩增出目的条带,且在肺门淋巴结和肠系膜淋巴结中扩增出特异性条带;PCR方法能检测到的最低DNA量为7.81 pg/μL;测序结果显示核苷酸序列与Genbank中已登录的猪弓形虫IST1基因序列相应部分序列完全相同.[结论]该PCR方法具有较高的敏感性和特异性,是诊断猪弓形虫病的一种快速检测方法.     

弓形虫紫外线弱毒虫株的培育及免疫研究（第二报）

本文报道了弓形虫NT强毒虫株,经紫外线全暴露垂直连续照射,通过细胞致弱培养筛选出抗辐射变异虫株NTA-Ⅲ系。本虫对猪、兔和小鼠的毒力均明显减弱。猪安全试验116头,21头出现弱反应,占18.1％,无重病或死亡;非带虫免疫试验36头,连续测35128天,均末查到虫体和包囊。用含虫数10~5/毫升弱毒虫苗每头猪接种1毫升,6个月免疫保护力为100％。     

分泌抗IBDV单抗的杂交瘤细胞在新型5L细胞反应器中连续培养的研究

能稳定分泌抗IBDV单抗的杂交瘤细胞,直接从方瓶中接种进入已改装的新型5L细胞反应器,接种浓度不少于3×10~8个细胞/L,细胞在pH7.10、DO55、50～70r/min、37℃的培养条件下生长良好;在保持反应器内的葡萄糖浓度不低于1;,.0g/L的情况下,平均每天可生产单抗3L左右,产物的平均OD值为0.368,持续周期达30d左右。     

猪CD127流式单克隆抗体的研制

[目的]研制出猪CD127(调节因子IL-7受体α链)流式单克隆抗体,为研究分析猪淋巴细胞亚群,尤其是猪Treg细胞亚群提供流式细胞分析抗体,也为进一步探究猪抗病性状与免疫机制间的关系打下基础.[方法]克隆猪CD127基因片段,通过原核载体诱导表达出相应的融合蛋白,以纯化后的融合蛋白免疫Balb/c小鼠,然后取其脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,综合ELISA和流式细胞仪检测筛选出亚克隆抗体,并采用Western blotting验证所得亚克隆抗体能否与猪淋巴细胞上的CD127特异性结合.[结果]猪CD127基因cDNA全长1999 bp,第49~1428 bp为开放阅读框(ORF),编码459个氨基酸,其中前21位氨基酸为信号肽,成熟肽N端第1~219位氨基酸为胞外蛋白,第220~242位氨基酸为跨膜蛋白,第243~459位氨基酸为胞内蛋白.以pET28a和pET32a原核载体诱导表达CD127胞外片段可获得大小介于34~43 kD的融合蛋白,经Ni亲和层析柱纯化后用于免疫Balb/c小鼠,6只免疫小鼠血清中的多克隆抗体均能对猪淋巴细胞中的CD3阳性细胞(CD3+)进行共标记,其中以M2和M4两只免疫小鼠抗血清对CD3+的共标记效果较优,分群清晰;但流式细胞仪检测发现,仅2.3%的CD3+能与M2混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记,而67.0%的CD3+能与M4混合池培养基上清液中的分泌抗体共标记,且分群清晰.从M4混合池中筛选出6株效价稳定的亚克隆细胞株(1E2、1D8、2F3、2F8、3C6和4E1),且以1D8、2F3、2F8和3C6亚克隆抗体标记的CD3+较多,其培养基上清液中的分泌抗体在猪胸腺和肌肉样品中均能检测出大小约50 kD的单一目的条带.[结论]制备获得的猪CD127流式单克隆抗体可与T淋巴细胞表面的IL-7受体特异性结合,同时在流式细胞仪检测过程中可用于猪Treg细胞亚群检测.     

猪脾转移因子的制备与生物学特性研究

试验采用透析法提取了猪脾转移因子(TF),并对其理化特性、生物安全性以及其对非特异性和特异性免疫的影响等方面进行了初步研究。结果表明,利用透析法制备的猪脾TF能够显著(P<0.05)增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬能力;对于E玫瑰花环的形成数和形成率具有极显著(P<0.01)的促进作用;将猪脾TF与猪瘟疫苗同时使用,能够显著(P<0.05)提高机体体液免疫的抗体滴度。此外,制备的猪脾TF安全无毒、无抗原性,不会使异种动物体内产生相应抗体。表明猪脾TF对于机体的特异性和非特异性免疫均有促进作用,是一种安全的生物免疫调节剂。     

培养过程中温度对猪卵母细胞发育的影响(脂滴部分)

猪成熟的卵母细胞在体外20℃和37℃的条件下,以M—199为培养基,以未培养的卵母细胞做对照,分别培养24和48小时,观察和分析不同温度下猪卵母细胞的发育以及超微结构的变化。结果表明,不同温度对细胞内脂滴的数量没有影响,对脂滴内容物的致密度无显著影响,但对脂滴大小有影响。与对照组比较,实验组的脂滴明显增大。在37℃培养时,脂滴的大小与时间呈正比,20℃时,则先增大后缩小。形态上的差别:20℃培养时一些细胞的部分脂滴出现相变现象,未见脂滴的外排;37℃时脂滴的变化不同。猪卵母细胞不耐低温,可能由于猪卵母细胞含有大量脂类,低温时由液晶态的脂类变成晶态,使细胞失去正常功能,甚至死亡。     

刚地弓形虫NT株P30基因的克隆与表达

参考Genbank登录的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)P30全基因序列,设计合成1对引物,通过PCR在刚地弓形虫的基因组DNA中扩增出P30基因片段,然后构建重组表达质粒pET-32a(+)/P30,用IPTG诱导,在表达菌BL21(DE3)表达出分子量为4.83×104的融合蛋白,经Western-blotting鉴定目的蛋白具有良好的免疫学活性,为刚地弓形虫疫苗的制备及猪弓形虫抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础.     

猪轮状病毒免疫初探——Ⅰ.用强毒进行非肠道途径免疫

根据何家惠等试验证实,猪轮状病毒经肌肉或腹腔注射不会引起肠道排毒。为了加快免疫工作的进展,在弱毒株未培育成功之前,用强毒通过非肠道途径对母猪及仔猪进行了免疫试验。 材料和方法 1.猪轮状病毒株 用本组从自然病例中分离到的南86号毒株MA104细胞上连续传代繁殖至35～37代。 2.猪轮状病毒苗的组成 (1)母猪免疫疫苗:用南86号毒株的35代或37代MA104细胞培养毒(MA86F_(35)或MA86F_(37)),蚀斑滴度10~(-7),临用前,加入20%氢氧化铝及0.05％皂素,充分混合。     

猪圆环病毒衣壳蛋白单克隆抗体的制备

以大肠杆菌表达的猪圆环病毒2型(PCV2)重组衣壳蛋白(GST-CAP2)为抗原,以一定的免疫程序接种BALB/c小鼠后,取其脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0按常规杂交瘤技术进行融合.以GST-CAP2以及猪圆环病毒1型(PCV1)重组衣壳蛋白(GST-CAP1)为包被抗原,经间接ELISA筛选获得2株能稳定分泌针对PCV的单克隆抗体的杂交瘤细胞株(M1和G1).通过dot-ELISA、Western-blotting以及间接免疫荧光(IFA)技术证明G1株分泌的单抗同时识别PCV1和PCV2, 而M1株分泌的单抗则特异性针对PCV2.该单抗的制备将为进一步建立快速检测PCV的方法奠定基础.