奶牛产气荚膜梭菌的分离鉴定与药物敏感性分析

本研究旨在对从奶牛内脏、组织病料样品中分离得到产气荚膜梭菌并进行鉴定分型,为后续疫苗研究提供材料,并通过药敏试验筛选出较为敏感的药物以针对性的指导牧场对牛群进行治疗并提出有效的防治隔离建议。2019年山东21家牧场部分奶牛出现腹泻、便血及短期内死亡等现象,对部分死亡奶牛进行剖检,并送检64份内脏、组织病料样品进行CP培养初筛,对初筛阳性菌株用生化鉴定及PCR分型鉴定;以16S rDNA技术对CP菌株进行同源性分析;采用E-test法测定分离菌对7种抗菌药物(红霉素、左氟沙星、利奈唑胺、万古霉素、克林霉素、四环素、利福平)的最低抑菌浓度(micro inhibition concentration,MIC),筛选出敏感药物。8份样品血琼脂培养基细菌培养出现灰白色菌落,梭菌显色培养基培养为橘红色梭菌典型特征菌落;生化鉴定结果符合产气荚膜梭菌特征;PCR分型结果显示5株为A型、2株C型和1株E型;16S rDNA分析得出8株分离菌与产气荚膜梭菌同源性最高可达100%;8株CP菌株对7种药物敏感,其中2株对克林霉素、利福平更为敏感,3株对红霉素及利奈唑胺敏感,1株对左氟沙星更敏感。对有病牛的2家牧场推荐使用林可酰胺类、利福霉素类及大环内酯类药物进行防治,对牧场防治效果及时追踪,对于没有治疗价值的牛立即扑杀,无害化处理,改善饲养条件,减小饲养密度。     

迁徙候鸟产气荚膜梭菌的分离鉴定与特性分析

产气荚膜梭菌是一种人兽共患病原菌,可通过多种途径感染人类。本研究从迁徙候鸟样品中对产气荚膜梭菌进行分离鉴定,并进行毒力基因检测、分型、生物被膜形成能力鉴定及耐药性测定。结果从549份健康候鸟粪便样品中分离细菌42株,35只死亡候鸟病料样品中分离细菌11株,通过PCR方法共鉴定A型菌48株,E型菌5株,所有菌株均未检出β2毒素、肠毒素和NetB毒素基因,30株经测定能够形成生物膜;分离菌株对黏菌素、杆菌肽、克林霉素和红霉素的耐药率在40%以上,所有菌株均对复方新诺明敏感。结论得出迁徙候鸟携带产气荚膜梭菌的比例较低,但是对部分抗生素的高耐药性值得关注。     

规模化养鸡场A型产气荚膜梭菌的分离鉴定及其对海南霉素敏感性的测定

为探究海南霉素对产气荚膜梭菌的敏感性,在某大型养鸡场采集了209份鸡肠道样本,采用选择性培养基和MALDI-TOF质谱仪微生物鉴定仪鉴定,并对鉴定的菌株进行分型。采用琼脂稀释法测定了海南霉素、恩拉霉素、盐霉素、丁酸甘油酯对临床分离的产气荚膜梭菌的抗菌活性,以期为当前限抗禁抗后养殖场选择合适的药物控制产气荚膜梭菌提供理论依据。试验结果表明：共分离出61株产气荚膜梭菌,分离率为29.2%;通过多重PCR对所分离的产气荚膜梭菌进行分型,结果分离株均为A型产气荚膜梭菌;4种药物均有不同程度的抑菌效果,其中海南霉素与恩拉霉素对鸡源产气荚膜梭菌的抑菌效果最好,且MIC值范围均为0.004～0.06μg/mL。海南霉素具有很好的抗梭菌效果。     

甘肃省牛和羊源产气荚膜梭菌耐药性分析

旨在探究甘肃省牛和羊产气荚膜梭菌的流行情况及对常用抗菌药物的耐药性.对采集自甘肃省不同地区的229份牛、羊源肛拭子进行了产气荚膜梭菌的分离鉴定,并对分离到的产气荚膜梭菌菌株进行毒素基因检测、最小抑菌浓度(MIC)测定及四环素耐药菌株的同源性分析.结果表明,在229份样品中分离到53株A型产气荚膜梭菌,分离率达23.1％...     

绵羊大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的病原分离鉴定

试验旨在对宁夏一绵羊场疑似大肠杆菌与A型产气荚膜梭菌混合感染的死亡病例进行确诊并提出相应的防治方案。采用产气荚膜梭菌显色培养基及伊红美蓝固体培养基进行病原分离培养,对分离菌株进行16S rRNA基因序列PCR检测,依据16S rRNA序列构建分离株分子进化树;之后对大肠杆菌分离株毒素因子进行PCR检测,对产气荚膜梭菌分离株进行毒素分型鉴定。结果显示,分离株PCR检测获得了16S rRNA特异性条带;分子进化树结果显示,大肠杆菌分离菌株NXDC001与大肠杆菌在同一分支,产气荚膜梭菌分离菌株NXSJ001与产气荚膜梭菌在同一分支。大肠杆菌分离株检测出毒素因子HPI (irp2)及LEE (eae);产气荚膜梭菌分离株携带毒素因子cpa,证明分离株为A型产气荚膜梭菌。研究表明,试验成功分离鉴定大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌各一株,证明病死羊为大肠杆菌及A型产气荚膜梭菌混合感染。     

陕西省部分地区鸡源A型产气荚膜梭菌分离株的药敏试验

通过应用纸片法对52株分离自陕西部分地区的A型鸡源产气荚膜梭菌分离菌株进行药物敏感性检测,了解各菌株对常见抗菌药物的耐药状况。结果分离菌株对磺胺异恶唑、复方新诺明、强力霉素耐药率较高,均在70%以上;对万古霉素、氯霉素、杆菌肽的敏感率均在80%以上;大部分菌株为多重耐药。结果表明,陕西部分地区的鸡源性产气荚膜梭菌的耐药性较为严重。     

牛出血性肠炎A型产气荚膜梭菌的分离鉴定

从新疆维吾尔自治区某牛场采集的3份疑似出血性肠炎病料中分离到8株产气荚膜梭菌,用PCR扩增保守基因16SrRNA,并进行序列测定和同源性分析,再通过多重PCR方法扩增型特异性基因进行分离菌株的分型鉴定。结果显示,所分离的8株产气荚膜梭菌之间16S rRNA基因同源型为100%,与GenBank参比序列同源性在99.8%以上,确定为产气荚膜梭菌。遗传进化分析表明,本次分离的8株产气荚膜梭菌之间拥有共同起源,但与所用的参考菌株分属不同来源。多重PCR扩增结果显示,8株菌株均为产气荚膜梭菌A型。     

麋鹿产气荚膜梭菌分离鉴定方法的建立与初步应用

探索了产气荚膜梭菌在营养琼脂、甘露醇卵黄琼脂和血琼脂平板上的菌落形态和培养特点,优化了产气荚膜梭菌的分离方法,并对分离菌株进行生化鉴定;在此基础上对北京南海子麋鹿苑和江苏大丰麋鹿国家级自然保护区的麋鹿自然感染情况进行了调查。结果发现,粪样中的产气荚膜梭菌在营养琼脂上生长呈半透明边缘不整的白色菌落,接种甘露醇卵黄琼脂和血琼脂平板,分别出现伴有卵磷脂酶乳光浑浊带的粉红色火山口状菌落和伴有双溶血环的灰绿色勋章样菌落。生化试验结果确认这些分离株均为产气荚膜梭菌。对北京南海子麋鹿苑和江苏大丰麋鹿国家级自然保护区麋鹿粪样检测发现,阳性率分别为13.04%(3/23)和19.51%(8/41)。说明本研究建立的麋鹿产气荚膜梭菌分离鉴定方法简便快速,确实可行;麋鹿产气荚膜梭菌自然感染率较高,应加强麋鹿产气荚膜梭菌病的防控。     

我国部分地区猪产气荚膜梭菌流行病学调查及毒素型分析

试验收集了湖南、浙江、福建、广东等4省8市的规模化猪场各阶段猪的粪便样品74份和肠道样品15份,以及现场采集了广州某生猪屠宰场肝脏和肺脏样各30份共计149份样品,对产气荚膜梭菌在猪中的感染情况进行流行病学调查.处理样品后进行产气荚膜梭菌的分离培养,16s rDNA PCR并测序鉴定阳性菌株,后进行毒素型分析.结果表明...     

反刍动物源产气荚膜梭菌新疆流行株的分离鉴定及分型研究

为了弄清反刍动物源产气荚膜梭菌新疆流行株的生物学特性和分子特征,本研究从新疆不同地区规模化养殖场和屠宰场采集158份牛羊临床病料,进行产气荚膜梭菌的分离培养;通过形态学、生化特性、16S rRNA序列分析对产气荚膜梭菌分离株进行鉴定;利用多重PCR技术扩增产气荚膜梭菌α、β、ε、ι、β2基因,将测序结果与NCBI数据库比对进行新疆流行株的基因分型。结果从158份临床病料中共分离出产气荚膜梭菌67株,形态学、生化和16S rRNA序列分析鉴定结果均为产气荚膜梭菌。毒素基因检测表明,其中α基因检出率为100.00%(67/67),ε基因检出率为17.91%(12/67),β2基因检出率为37.31%(25/67),β、ι基因未检出。毒素基因分型可将产气荚膜梭菌新疆流行株分为A、D型,其中A型占82.09%(55/67),D型占17.91%(12/67),提示产气荚膜梭菌新疆流行株优势型别为A型。本研究为产气荚膜梭菌流行病学研究和防控提供科学依据。     

鸡蛋壳蜡样芽孢杆菌的分离鉴定及耐药性分析

【目的】 分析不同环境下鸡蛋外壳携带蜡样芽孢杆菌的情况和分离菌株的基本特征。【方法】 从养殖场和超市各采集9种新鲜鸡蛋,对鸡蛋表面携带的蜡样芽孢杆菌进行分离鉴定、基因分型、毒力基因筛查和耐药性分析。采用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术对分离菌株进行初步鉴定,全基因组测序后进行菌种鉴定并确定基因分型、筛选毒力基因和耐药基因,同时采用微量肉汤稀释法测定分离株对头孢曲松、红霉素、万古霉素等12种抗菌药物的耐药性。【结果】 经MALDI-TOF MS初步鉴定和基因组菌种鉴定,确定从养殖场3种未经清洁加工的鲜蛋中分离出的6个菌株为蜡样芽孢杆菌,其序列分型（ST）较为多样,其中有2株新的ST型。在毒力基因筛查方面,6株蜡样芽孢杆菌均检出了非溶血型肠毒素nheB基因、腹泻型毒力因子hlyⅡ基因和侵袭免疫系统的inhA基因;nheA和nheC基因携带率为83.3%,编码溶血型肠毒素HBL的hblA、hblC和hblD基因携带率均为66.7%;cytK和hlyⅢ基因携带率分别为33.3%和50.0%;肠毒素基因BceT、entFM和致吐毒素基因ces均未检出。耐药性方面,6株菌均对庆大霉素、四环素、氯霉素、利福平、利奈唑胺和环丙沙星敏感,对氨苄西林、头孢曲松和泰妙菌素耐药;对红霉素、克林霉素的中介率分别为83.3%和100%;33.3%的菌株对万古霉素耐药。6株菌均携带有磷霉素耐药基因FosB和万古霉素耐药基因簇vanA的部分基因vanRSYZ,其中5株菌携带大环内酯类药物耐药基因mphL,部分菌株携带β-内酰胺类药物耐药基因或核苷类药物耐药基因。【结论】 本试验从养殖场未经消毒处理的鸡蛋外壳上成功分离到了蜡样芽孢杆菌,并发现其携带有多种毒力基因,存在多重耐药性,有潜在致病性和公共安全风险。     

健康奶牛生殖道乳酸菌的分离鉴定及其抑菌活性研究

【目的】 从健康奶牛生殖道分离筛选益生乳酸菌,为未来防治奶牛子宫内膜炎提供益生菌菌株并为开发防治此病的微生态制剂奠定基础。【方法】 采集10份健康奶牛的生殖道分泌物样品,用MRS培养基进行分离培养,通过形态学观察和16S rDNA序列对分离出的菌株进行鉴定,将所得序列结果与NCBI核酸数据库参考菌株进行相似性比对,确定各分离菌株的种属。利用牛津杯法分离筛选出具有较好抑菌活性的菌株,研究这些筛选出的菌株的生长曲线、产酸能力及抗菌药敏感性,并对其主要抗菌物质进行检测。【结果】 从10个样品中共分离出13株乳酸菌,经染色镜检和16S rDNA测序分析鉴定出13株乳酸菌,分别为植物乳杆菌11株、殊异肠球菌和鼠肠球菌各1株。单株抑菌试验得到5株对大肠杆菌抑菌能力较好的乳酸菌,5株乳酸菌生长特性及产酸能力均良好,对氨苄西林、四环素、红霉素、利福平、甲氧苄啶、氯霉素和青霉素7种抗菌药物敏感性较强。其中21和35号菌株的抗菌物质为过氧化氢和细菌素,而25、33和34号菌株的抗菌物质除过氧化氢和细菌素外还包括有机酸。【结论】 从奶牛生殖道中分离得到的3株乳酸菌有望作为微生态制剂用于奶牛子宫内膜炎的临床防治,其具体防治效果有待进一步探究。     

鸡源高产淀粉酶丁酸梭菌的分离鉴定

为了获得产淀粉酶的丁酸梭菌,本研究从鸡小肠表面黏液中进行丁酸梭菌的分离与筛选,首先对样品进行80℃水浴10 min除去非芽孢菌后,然后接种到TSN培养基进行菌株的分离与筛选。对分离到的菌株进行菌落形态、显微形态初步观察,然后对疑似丁酸梭菌的菌株进行产酸能力和淀粉酶酶活检测,最后对既产酸又高产淀粉酶的菌株进行生理生化鉴定和16S rDNA序列分析。结果表明分离到一株革兰氏阳性厌氧菌C.B1,菌体呈短杆状,能形成圆形或椭圆形芽孢,生理生化结果也符合丁酸梭菌的基本特征,16S rDNA序列长度为1450 bp,与丁酸梭菌的同源性高达99%以上,因此确定该分离菌株为丁酸梭菌,为进一步开发新的微生态制剂奠定了基础。     

广东省宠物源伪中间型葡萄球菌的耐药性调查研究

为调查广东省宠物源伪中间型葡萄球菌(Staphylococcus pseudintermedius)的携带和耐药情况,从小动物临床采集皮肤、耳部和鼻腔等部位的样品,分离鉴定伪中间型葡萄球菌,并采用琼脂稀释法和纸片扩散法对伪中间型葡萄球菌进行抗菌药物敏感性检测,采用PCR方法检测mecA基因。结果表明,从898个样品中共分离到144株伪中间型葡萄球菌,检出率为16.0%,皮肤、耳部和鼻腔的伪中间型葡萄球菌检出率分别为20%(64/319)、17.8%(64/359)和7.5%(3/40)。抗菌药物敏感性检测和mecA基因检测结果显示有89株(61.8%)为耐甲氧西林伪中间型葡萄球菌(MRSP)。伪中间型葡萄球菌对氨苄西林、红霉素、阿奇霉素、克林霉素和四环素的耐药率均在80%以上,对利福平和阿米卡星的耐药率低于8%,对万古霉素、利奈唑胺、喹奴普汀/达福普汀和替考拉宁均敏感。大部分(>69%)MRSP对红霉素、克林霉素、泰乐菌素、阿奇霉素、复方新诺明、四环素、环丙沙星和恩诺沙星等抗菌药物表现耐药。本研究结果表明宠物源伪中间型葡萄球菌的耐药情况严重且MRSP的检出率高,应高度重视宠物源细菌耐药问题。     

内蒙古锡林郭勒盟犊牛腹泻大肠杆菌的分离鉴定及药物敏感性试验

[目的] 确定内蒙古锡林郭勒盟多伦县某养殖场犊牛腹泻的致病菌,为选择敏感药物治疗该病提供依据。[方法] 无菌采集腹泻犊牛肛拭子进行细菌培养鉴定、致病性试验及体外药物敏感试验。[结果] 肛拭子经培养后的菌落形态一致,经表型鉴定、生理生化鉴定及16S rDNA鉴定确定分离菌为大肠杆菌;大肠杆菌分型引物鉴定分离菌株为ETEC型;且分离菌株可致小鼠死亡;分离菌株对氨苄西林、氨曲南、头孢唑啉、四环素、氧氟沙星、左氧氟沙星、复方新诺明等21种药物表现为耐药,对头孢哌酮、头孢曲松、克林霉素、多黏菌素B、米诺环素等10种药物表现为中度敏感,对头孢西丁、万古霉素、环丙沙星及呋喃妥因4种药物表现为敏感。[结论] 该养殖场的犊牛腹泻是由大肠杆菌ETEC型所致,临床治疗过程中可使用环丙沙星。     

牛源抗氧化芽孢杆菌的分离鉴定及生物特性研究

【目的】从奶牛瘤胃中分离具有抗氧化能力且耐受性好的芽孢杆菌,为牛源益生菌作为抗氧化添加剂使用提供理论依据及参考。【方法】采集3头成年荷斯坦奶牛瘤胃内容物,通过细菌分离纯化、形态观察、生化检测及16S rDNA分子检测进行鉴定,同时检测筛选菌株的超氧自由基和羟自由基清除率、耐酸、耐胆盐能力及对抗生素的耐药性。【结果】从奶牛瘤胃液中共获得了12株菌,通过特异性培养基与革兰氏染色共筛选出5株芽孢杆菌(X-1～X-5)。对5株芽孢杆菌进行分子鉴定,确定X-1为热噬淀粉芽孢杆菌,X-2为短小芽孢杆菌,X-3为解蛋白芽孢杆菌,X-4为枯草芽孢杆菌,X-5为沙福芽孢杆菌。抗氧化能力检测结果显示,5株菌均具有一定的抗氧化能力,X-5菌株抗氧化能力最高,超氧自由基和羟自由基清除率分别达到73.81%和73.54%。当pH为2.5时,5株芽孢杆菌存活率均在25%以上;胆盐浓度为0.6%时,5株芽孢杆菌存活率均在60%以上,说明菌株具有良好的耐受性。药敏试验结果显示,试验分离出来的大多数菌株对氧氟沙星、呋喃妥因、红霉素等高度敏感;对头孢呋辛、头孢噻肟、链霉素等耐受;对卡那霉素、环丙沙星、氨苄西林等中度敏感。...     

黑龙江省鸡西地区奶牛子宫内膜炎病原菌分离鉴定及耐药性研究

从黑龙江省鸡西地区部分奶牛场选取25头临床诊断为子宫内膜炎的患牛,并从这25头患牛体内分离得到39株细菌,其中大肠杆菌17株、葡萄球菌13株、链球菌5株、其他菌4株。耐药性试验表明,大肠杆菌、葡萄球菌和链球菌都对头孢曲松钠和头孢噻呋钠敏感,对庆大霉素比较敏感,对其他几种常用抗生素存在不同程度耐药性。     

新疆石河子奶牛隐性乳房炎源金黄色葡萄球菌的分离鉴定及药物敏感性分析

为了解石河子地区部分规模化奶牛场奶牛隐性乳房炎源金黄色葡萄球菌的生物学特性及药物敏感性,为科学防治该病的发生提供参考依据,本试验选择了石河子周边地区不同规模的11个奶牛场,通过采用LMT法检测其隐性乳房炎的感染率,并从采集到的313份隐性乳房炎奶样中分离鉴定金黄色葡萄球菌,同时采用纸片扩散法（K－B法）对分离株的药物敏感性进行了分析。结果表明,试验区奶牛隐性乳房炎的总阳性率为44．56％（869／1950）,金黄色葡萄球菌的分离率为44．71％（93／208）;药敏试验结果表明,大部分菌株对阿莫西林、红霉素、四环素表现为高度耐药,耐药率分别为92．30％（24／26）、80．77％（21／26）、80．77％（21／26）;对庆大霉素、氧氟沙星、头孢唑啉表现为敏感,敏感率分别为57．70％（15／26）、76．92％（20／26）、76．92％（20／26）;部分菌株对克林霉素中度敏感,敏感率为46．15％（12／26）。建议在选用抗生素治疗奶牛隐性乳房炎时,以流行菌株的药物敏感性为依据。     

湖南省奶牛源金黄色葡萄球菌分离鉴定与耐药性分析

为了掌握湖南省内奶牛源金黄色葡萄球菌的耐药情况,指导临床合理用药,抽取牛乳样品,通过对细菌的分离培养和纯化,采用基质辅助激光电离飞行时间质谱仪和全自动生化鉴定仪进行鉴定,并对分离菌株进行18种抗菌药物耐药性检测;结合耐药表型和mecA基因检测判定MRSA菌株。结果显示,2020-2021年从湖南地区257份牛乳样品中分离出金黄色葡萄球菌39株,89.74%的临床分离菌株表现为不同程度耐药,其中对青霉素耐药最为严重,耐药率达82.05%;对红霉素、克林霉素、替米考星、庆大霉素、头孢西丁耐药率在20%-35%之间;对多西环素及万古霉素绝对敏感,耐药率为0。38.46%分离菌株表现为多重耐药,以7重耐药最多。鉴定出19株MRSA,其中包含15株OS-MRSA和4株OR-MRSA。本研究可为湖南省内奶牛企业制定合理用药措施提供依据。     

中国部分地区犬源伪中间葡萄球菌的流行特征分析

旨在调查犬源伪中间葡萄球菌的耐药性和分子特征，本研究自2017年11月—2019年4月收集601份送检至中国农业大学动物医院检验科和第三方检测机构的犬源临床样本，分离鉴定伪中间葡萄球菌；采用琼脂稀释法检测伪中间葡萄球菌对14种抗菌药物的敏感性；所有分离菌株均进行全基因组测序（WGS），并从WGS结果中获取耐药基因、多位点序列分型（ST）和葡萄球菌染色体基因盒（SCCmec）分型。结果显示，共分离到75株伪中间葡萄球菌（分离率为12.5%），其中包括42株（56%）耐甲氧西林伪中间葡萄球菌（MRSP）和33株（44%）甲氧西林敏感伪中间葡萄球菌（MSSP）；所有菌株均对青霉素、阿奇霉素、克林霉素、多西环素、环丙沙星、恩诺沙星、苯唑西林和氯霉素高度耐药，对利奈唑胺、万古霉素、阿米卡星和利福平敏感，多重耐药率达90.7%；所有MRSP均具有多重耐药性；75株伪中间葡萄球菌中检测到19种耐药基因，blaZ和aac（6'）-aph（2″）检出率最高，均为92%（69/75）；共发现70种ST型，54种为新ST型，无优势ST型；23株（54.7%） MRSP为SCCmec V型。综上表明，犬源伪中间葡萄球菌存在严重的多重耐药性；MRSP和MSSP均具有较大的遗传多样性。