应用农杆菌介导法获得转大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF2小麦植株

以生产用5种基因型小麦为材料,利用农杆菌介导法将大麦黄矮病毒GPV株系复制酶基因ORF2转化愈龄40d的幼胚愈伤组织,经过G418筛选后,共再生出9株抗性植株,拓宽了小麦农杆菌转化的受体基因型。PCR及Southern杂交分析证实大麦黄矮病毒复制酶基因ORF2已经整合到小麦基因组中。初步抗病性检测结果显示转基因植株对GPV株系具有抗性。研究结果还表明,受体基因型、外植体的生理状态对农杆菌侵染起着至关重要的作用。     

花粉管通道法介导的抗大麦黄矮病毒转基因小麦研究

构建了大麦黄矮病毒GPV株系串联结构复制酶基因植物表达载体pPPI29,通过花粉管通道法转化了CA8686小麦,对T₀代种子进行了分子检测,获得6株转基因小麦,转化率达到0.45%;对获得的T0代转基因小麦进行了田间抗病性鉴定,结果表明4株转基因小麦对GPV株系表现为高抗,可以推迟发病23 d。     

应用基因枪法获得抗大麦黄矮病毒转基因小麦

 以我国特有的大麦黄矮病毒GPV株系的外壳蛋白(CP)基因为材料,设计合成了分别含有Act启动子或Emu启动子的植物表达载体pPPI2、pPPI3和pPPI5。采用基因枪法分别转化小麦幼胚和愈伤组织。诱导成苗后进行PCR检测,T₀代阳性率为18%。对转基因苗的后代进行进一步检测,部分转基因苗阳性株至T₃代PCR检测阳性率为100%,PCR结果CP探针杂交呈阳性反应,序列测定结果与GPV CP基因序列一致,表明GPV CP基因已整合到小麦基因组中。室内抗病性鉴定结果,虽然转基因植株全部发病,但对大麦黄矮病毒GPV株系具有一定的延迟发病作用。     

应用基因工程创造抗黄矮病毒转基因小麦新种质

应用花粉管通道法和基因枪法将大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系外壳蛋白基因导入小麦栽培品种，获得了抗大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的转基因小麦株系（文献检索证明世界上无任何其它抗病毒转基因小麦报道）。转基因植株经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，证明ＣＰ基因可稳定遗传到Ｔ３代；经Ｗｅｓｔｅｒｎ测定，证明ＣＰ基因在转基因小麦中已经得到表达；经带毒蚜温室和田间人工接种试验，获得了一些抗病性明显的后代，并得到了ＥＬＩＳＡ验证     

应用基因工程创造抗黄矮病毒转基因小麦新种质

应用花粉管通道法和基因枪法将大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系外壳蛋白基因导入小麦栽培品种，获得了抗大麦黄矮病毒ＧＰＶ株系的转基因小麦株系（文献检索证明世界上无任何其它抗病毒转基因小麦报道）。转基因植株经ＰＣＲ、Ｓｏｕｔｈｅｒｎ检测，证明ＣＰ基因可稳定遗传到Ｔ３代；经Ｗｅｓｔｅｒｎ测定，证明ＣＰ基因在转基因小麦中已经得到表达；经带毒蚜温室和田间人工接种试验，获得了一些抗病性明显的后代，并得到了ＥＬＩＳＡ验证     

晋南冬麦区大麦黄矮病毒流行株系监测及防治策略探讨

连续5年(1996～2000年)采集晋南冬麦区小麦黄矮病标样,采用生物学和血清学(酶联免疫吸附法)相结合的诊断方法对该地区的大麦黄矮病毒流行株系进行了鉴别。结果表明,该小麦黄矮病流行区近五年以GAV株系为主流株系,兼有少量GPV、PAV和混合株系存在。同时对小麦抗黄矮病新品种“临抗1号”进行了GPV和GAV两种株系的抗性测定,明确了该品种兼抗GPV和GAV两种株系。根据小麦黄矮病发生现状,提出了一套以选育推广抗耐病品种为主,以药剂防治为辅的综合防治措施。以期为当地小麦生产服务。     

酵母pac1基因介导对葡萄B病毒的抗性

为明确广谱性抗病毒基因—酵母pac1基因对葡萄B病毒(Grapevine virus B,GVB)的抗性效果,通过农杆菌介导的遗传转化,将pac1基因导入西方烟37B,对转基因植株进行PCR鉴定及Southern blot分析,通过病毒摩擦接种观察症状以及实时荧光定量RT-PCR检测植株体内病毒含量,并对转基因植株抗病性进行初步鉴定。结果表明,目的基因pac1成功导入并整合至西方烟37B基因组,共获得10个转基因株系。不同株系的T1代烟草中阳性植株比例为16.7%~72.7%,表明目的基因可成功遗传到子代。接种病毒后转基因植株普遍延迟发病,但后期症状与非转基因对照相似,其中仅1个转基因株系B6具有不表现典型症状等抗性反应。接种植株病毒含量检测中,所有转基因植株均检测到病毒存在,但表现为抗病的B6株系中病毒含量显著低于非转基因对照,表明该转基因植株虽不能完全抵抗GVB侵染,但对GVB具有耐病性。     

葡萄病毒B CP基因植物表达载体构建及烟草遗传转化

葡萄病毒B Grapevine virus B(GVB)是葡萄皱木复合病中栓皮病的病原,为开展抗GVB转基因研究,本研究利用RT-PCR技术克隆GVB外壳蛋白(coat protein,CP)基因,与植物表达载体pRI 101-AN连接构建植物表达载体pRI-GVB CP。采用电击转化法将植物表达载体pRI-GVB CP导入农杆菌LBA4404,并利用农杆菌介导的叶盘转化法将外源基因导入西方烟‘37B’。共获得16个烟草再生株系,PCR检测其中3个株系为阳性,阳性株系播种获得的64株T_1代植株中有30株扩增到目的条带,阳性率为46.9%,表明目的基因GVB cp成功导入烟草并可成功遗传到子代。28株T_1代转基因植株接种病毒进行抗病性鉴定,其中有6株对接种病毒GVB具有抗性。     

利用RNAi 介导的抗病性获得抗2 种花生病毒的转基因烟草

 分别以花生条纹病毒红安株系(PStV-Hongan)外壳蛋白基因(CP),花生矮化病毒轻型株系(PSV-Mi)和花生黄瓜花叶病毒(CMV-CA)复制酶基因2a为模板,通过PCR 方法分别得到PStV-CP 5′ 端,PSV-Mi 和CMV-CA 2a3′ 端150 bp 的片段,3 种片段混合物为模板经PCR 拼接得到450 bp 的片段,此拼接片段通过Gateway 系统重组至植物表达载体pK7GW1WG2,得到含反向重复拼接片段的植物表达载体pK450。冻融法导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株GV3101 后,叶盘法转化本生烟(Nicotiana benthamiana),经PCR 检测,获得转基因植株。对T1 代转基因植株分别人工接种3 种病毒,66. 7% 的植株表现对PStV 免疫,9% 的植株表现对CMV-CA 的恢复抗性,全部植株对PSV 感病。siRNA 的Northern blot 结果表明,所有转基因烟草植株都含有病毒特异siRNA,siRNA 含量随接种后时间延长而衰减。     

大麦黄矮病毒GPV株系外壳蛋白基因在E.coli中的表达及抗血清制备

 病毒外壳蛋白基因经适当引物逆转录成cDNA后,应用聚合酶链反应(PCR)扩增,得到大麦黄矮病毒(BYDV)GPV株系的外壳蛋白(CP)基因。将此基因克隆至表达载体pMal,转化E.coli TB1,诱导表达了携带外壳蛋白的融合蛋白,表达量约占菌体总蛋白量的7%,此融合蛋白的分子量约为60kD,经亲和层析纯化后免疫家兔,获得BYDV-GPVCP的抗血清。     

转隐地蛋白基因烟草的抗病性及遗传分析

 对转隐地蛋白(Cryptogein)基因烟草植株进行了抗病性测定、抗病分子机理及遗传分析的研究。结果表明:80%以上的转基因植株对烟草上3种重要病原菌的抗病性均增强,且能稳定遗传;转基因烟草植株的抗病性与整合的拷贝数成负相关,即绝大多数高度抗病的植株只含有1个拷贝,而感病植株一般为2~3个拷贝;部分转基因烟草植株Northern杂交分析表明:病程相关蛋白和渗透调节蛋白等防卫反应相关基因的表达丰度与转基因植株的抗病性存在着一定的正相关性,表达丰度越高,抗病性越强;综合农艺性状考察表明Cryptogein基因对烟草植株的生长有显著的促进作用。     

Regeneration of sugarcane elite breeding lines and engineering of stem borer resistance

Five elite sugarcane breeding lines were tested for efficiency in embryogenesis and plant regeneration. All of them produced regenerative embryogenic calli but with varied efficiencies. To engineer strongly insect-resistant sugarcanes, the GC content of a truncated cry1Ac gene, which encodes the active region of Cry1Ac insecticidal delta-endotoxin, was increased from the original 37.4 to 47.5% following the sugarcane codon usage pattern. The synthetic cry1Ac gene (s-cry1Ac) was placed under the control of maize ubiquitin promoter and introduced by microprojectile bombardment into the embryogenic calli of sugarcane lines YT79-177 and ROC16. Southern blotting analysis showed that multicopies of s-cry1Ac were integrated into the genomes of transgenic sugarcane lines. Immunoblotting analysis identified 18 transgenic lines expressing detectable levels of s-Cry1Ac, which were estimated in the range of 1.8-10.0 ng mg(-1) total soluble proteins. Four transgenic and two parental lines were assayed for sugarcane stem borer resistance in leaf tissue feeding trials and greenhouse plant assays. The results showed that, while the untransformed control lines were severely damaged in both leaves and stems, the transgenic sugarcane lines expressing high levels of s-Cry1Ac proteins were highly resistant to sugarcane stem borer attack, resulting in complete mortality of the inoculated insects within 1 week after inoculation.     

绿木霉Sm1基因的克隆、原核表达及蛋白纯化

木霉菌(Trichoderma spp.)是土壤内普遍存在的习居菌,具有多种生物防治功能,其中诱导植物免疫反应是重要的生物防治功能之一[1].木霉菌Sm1蛋白(small one protein)是从绿木霉(Trichoderma virens)中分离得到的一种低分子量、富含半胱氨酸的疏水性蛋白,属于蛋白类激发子,与Cerato-platanin基因家族有很高的同源性,具有诱导植物免疫抗性的作用[2].     

抗菌肽和几丁质酶基因提高烟草对黑胫病菌和赤星病菌的抗性研究

 通过农杆菌介导法将加信号肽修饰的人工合成杂合抗菌肽CEMA基因(SPCEMA),苜蓿防御素基因(AFP),苦瓜几丁质酶基因(CHI)以及SPCEMA-CHI、AFP-CHI、AFP-SPCEMA双价基因导入本明烟(Nicotiana benthamiana),并对转基因烟草T₀和T₁代进行了抗病性检测,比较了不同转基因植株的抗病效果。研究结果表明,转基因烟草对黑胫病菌(Phytophthora parasitica var.nicotianae)、赤星病菌(Alternaria alternata)的抗性均强于非转基因烟草,病情指数差异达极显著水平,其中转AFP-CHI双价基因烟草具有较强的抗性,与单价转基因烟草的抗性差异达显著水平。但各单价转基因以及双价转基因烟草之间对上述病菌并未表现出显著的抗病性差异。结果表明植物源的抗菌肽基因与几丁质酶基因在抗植物真菌病害中具有协同增效作用。     

Insect resistance to Nilaparvata lugens and Cnaphalocrocis medinalis in transgenic indica rice and the inheritance of gna+sbti transgenes

Molecular genetic analysis and insect bioassay of transgenic indica rice 'Zhuxian B' plants carrying snowdrop lectin gene (gna) and soybean trypsin inhibitor gene (sbti) were investigated in detail. PCR, 'dot' blot and PCR-Southern blot analysis showed that both transgenes had been incorporated into the rice genome and transmitted up to R3 progeny in most lines tested. Some transgenic lines exhibited Mendelian segregation, but the other showed either 1:1 (positive: negative for the transgenes) or other aberrant segregation patterns. The segregation patterns of gna gene crossed between R2 and R3 progeny. In half of transgenic R3 lines, gna and sbti transgenes co-segregated. Two independent homozygous lines expressing double transgenes were identified in R3 progeny. Southern blot analysis demonstrated that the copy numbers of integrated gna and sbti transgenes varied from one to ten in different lines. Insect bioassay data showed that most transgenic plants had better resistance to both Nilaparvata lugens (Stahl) and Cnaphalocrocis medinalis (Guenee) than wild-type plants. The insect resistance of transgenic lines increased with the increase in transgene positive ratio in most of the transgenic lines. In all, we obtained nine lines of R3 transgenic plants, including one pure line, which had better resistance to both N lugens and C medinalis than wild-type plants.     

转二价核酶基因马铃薯及抗病性研究

 用克隆的特异性切割马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)复制酶基因负链RNA的二价核酶基因,构建植物表达载体pROKⅡ/DR,经土壤农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导叶盘法转化马铃薯外植体,获得再生植株。PCR和Southern-blot检测,证明目的基因已成功地导入马铃薯再生植株,其转化率约为14.5%,并能够在无性繁殖后代植株中稳定存在。RT-PCR检测表明,再生马铃薯植株中的二价核酶基因可以转录表达。经病毒接种的转基因马铃薯株系L5、L7、L8和J-1的无性繁殖后代在继发感染中仍表现出较高的抗病性,为最终获得抗PLRV马铃薯新品系打下了基础。