毕赤酵母(Pichia pastoris )分泌表达牛白细胞介素2

利用舍有强启动子PAOX1和α-因子信号肽序列的巴斯德毕赤酵母载体pPICZαA，构建出舍牛白细胞介素2(BoIL-2)基因的重组质粒BoIL2-pPICZαA。线性化的重组表达栽体转化到巴斯德毕赤酵母X-33及KM71H中，筛选Zeoein高抗性酵母菌株，甲醇诱导目的蛋白表达。经SDS-PAGE和Western blot检测表明，BoIL-2以融合蛋白形式在胞内表达，但没能分泌到胞外。通过BoIL-2在巴斯德毕赤酵母中的表达，重点讨论了信号肽、基因的偏爱性等对外源基因分泌表达的影响。     

猪β-防御素1在毕赤酵母中的串联表达

猪β-防御素1(pBD1)是在猪体内广泛分布的一种抗菌肽,在猪的先天免疫系统中发挥重要的作用。本试验为实现pBD1在巴斯德毕赤酵母中的高效表达,根据pBD1基因的成熟肽序列和巴斯德毕赤酵母密码子的偏好性,设计合成pBD1三倍串联体(3pBD1)基因序列,将合成的目的基因克隆到表达载体pHLI-S1中,构建重组表达载体pHLI-S1-3pBD1,线性化后的pHLI-S1-3pBD1电转化至毕赤酵母宿主菌GS115,PCR鉴定阳性转化子,MM平板和MD平板鉴定Mut表型。将鉴定为阳性的Mut~+型重组酵母菌株进行甲醇诱导表达,SDS-PAGE分析表达上清液。结果显示,获得的重组酵母菌株为Mut~+表型,经甲醇诱导表达后,表达上清液中含有分子量为22 kDa的目的蛋白。结果表明,获得了能够表达3pBD1的重组巴斯德毕赤酵母。     

禽传染性支气管炎病毒M基因在毕赤酵母中表达与蛋白反应活性检测

将禽传染性支气管炎病毒(IBV)M基因克隆到毕赤巴斯德表达载体pPIC9K中,构建了重组表达载体pPIC9K-M,电击转化毕赤巴斯德酵母GS115,经MD和MM平板筛选和PCR鉴定后,采用G418抗性梯度筛选得到高拷贝重组菌株GS115/pPIC9K-M His~+Mut~+,重组菌株用1%的甲醇诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析.结果表明,IBV M基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的相对分子质量约为33 000,能与IBV阳性血清特异性结合.将表达蛋白初步纯化后作为包被抗原,ELISA检测结果显示表达蛋白与特异性抗体反应良好,表明表达的M蛋白生物学活性良好.本研究表达的IBV M蛋白可作为制备IB诊断抗原的基础材料,对IB的防治有重要理论和实用价值.     

土耳其斯坦东毕吸虫磷酸丙糖异构酶基因的克隆及在毕赤酵母中的表达

利用RT-PCR技术从土耳其斯坦东毕吸虫（Orientobilharzia turkestanicum）成虫总RNA中扩增磷酸丙糖异构酶基因（TPI），鉴定后将目的片段与毕赤酵母表达载体pPIC9k连接，构建重组表达质粒pPIC9k-TPI，并将其电击转化到毕赤酵母GS115中，重组菌株经甲醇诱导后表达的TPI蛋白，经SDS-PAGE、Western-blotting检测，并利用葡聚糖凝胶层析柱纯化。结果显示，成功地克隆了土耳其斯坦东毕吸虫TPI；重组毕赤酵母表达了分子质量为43ku的TPI蛋白；葡聚糖凝胶层析过滤得到单一的TPI蛋白。     

安徽三黄鸡β-防御素2（gal-2）在毕赤酵母细胞内的表达

目的:构建安徽三黄鸡β-防御素2(gal-2)基因的真核表达栽体,表达gal-2蛋白.方法:提取鸡肺组织中总RNA,应用RT-PCR技术获得鸡β-防御素2(gal-2)全长eDNA基因片段,经PCR获得gal-2的成熟肽基因片段,并将其克隆入真核表达载体pPIC3.5K中,构建重组表达质粒pPIC3.5K-gal-2;经测序鉴定正确后,电转化巴斯德毕赤酵母菌GS115.经甲醇诱导表达gal-2蛋白,对表达产物进行SDS-PAGE电泳分析.结果:通过电转化方法成功将经酶切线性化的重组表达质粒整合入宿主菌基因组中,并在甲醇诱导的条件下成功表达出了目的蛋白.结论:成功构建了重组真核表达质粒pPIC3.5K-gal-2;并借助巴斯德毕赤酵母细胞表达出了gal-2的蛋白,其分子量大约为4.1 kDa.该研究为下一步应用基因工程和蛋白质工程技术进行gal-2蛋白的规模化生产奠定了基础.     

重组猪圆环病毒2型Cap蛋白在毕赤酵母中的表达及免疫原性研究

为了获得在体外表达的猪圆环病毒2型(Porcine circovirus 2,PCV2)Cap蛋白,研究其免疫原性,试验根据GenBank公布的国内PCV2-Cap蛋白基因序列特点,结合毕赤酵母密码子偏好对Cap基因进行优化,合成目的基因后,构建分泌型表达载体pPIC9K-Cap,转化毕赤酵母GS115后,经诱导表达获得重组Cap蛋白。重组蛋白以50μg/只的剂量连续3次免疫豚鼠后检测抗体水平。结果表明:含有PCV2-Cap基因的质粒成功转化到酵母菌基因组中,重组酵母菌株在30℃,经1%甲醇诱导表达96 h后,培养液中能够检测到33 ku的重组蛋白,重组蛋白表达量为155μg/mL,占培养上清液总蛋白的9.362%,Western-blot试验结果显示重组蛋白具有良好的抗原活性。重组蛋白以50μg/只的剂量连续3次免疫豚鼠后,能够刺激豚鼠产生特异性抗体且与接种0.3头份/只剂量的市售PCV2灭活疫苗产生的抗体水平无显著差异(P0.05)。说明成功利用毕赤酵母表达系统分泌表达了PCV2-Cap蛋白,表达的重组蛋白具有良好的抗原活性。     

E.tenella河北株EtMIC-2基因的克隆及毕赤酵母系统表达

为表达鸡柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)河北株EtMIC-2蛋白,本试验采用RT-PCR方法克隆出E.tenella河北株EtMIC-2基因,连接到毕赤酵母分泌表达载体pPIC9中,构建重组表达载体pPIC9-EtMIC-2。将其线化后转化到巴斯德毕赤酵母GS115中,甲醇诱导表达,饱和硫酸铵4℃沉淀浓缩后,用His选择镍-亲和层析柱纯化EtMIC-2蛋白。采用SDS-PAGE和Western blot方法验证其蛋白的表达。结果表明,构建的重组表达载体pPIC9-EtMIC-2在毕赤酵母菌中表达出相对分子质量约为45 000的目的蛋白,表达的EtMIC-2蛋白能被E.tenella阳性血清识别,具有良好的免疫反应原性。为进一步研究EtMIC-2蛋白功能及构建DNA疫苗奠定基础。     

犬细小病毒结构蛋白VP2基因的克隆和在毕赤酵母中表达

表达犬细小病毒VP2蛋白（CPV—VP2）,用于重组蛋白免疫小鼠制备单克隆抗体,并为犬细小病毒病的诊断奠定基础。采用PCR方法对CPVVP2基因进行扩增,将CPVVP2基因克隆到毕赤酵母分泌表达载体pPICZAA中,构建真核重组表达载体pPICZAA-VP2,将该重组质粒线性化后,转化巴斯德毕赤酵母（Pichiapastoris）X-33中,甲醇诱导表达CPVVP2,SDs_PAGE和Westernblotting鉴定表达蛋白。结果,成功扩增了CPV—VP2基因,构建了真核重组表达载体pPICZAA—VP2,在毕赤酵母菌中表达出约68000蛋白。Western—blotting鉴定表明,表达蛋白为目的蛋白VP2。表达菌株扩大表达体系于培养基中培养,上清液用70％过硫酸铵4℃沉淀浓缩,采用His选择镍-亲和层析柱分离纯化获得重组的酵母表达的带组氨酸标签的VP2蛋白,表达量约3mg／L。结果表明,在毕赤酵母中成功地表达了CPV—VP2蛋白,且能被犬细小病毒VP2单克隆抗体特异识别。     

微小牛蜱Bm86基因的真核表达

采用RT-PCR技术从微小牛蜱饥饿幼蜱破解物中扩增到Bm86基因，将其与巴斯德毕赤酵母分泌型表达载体pPlC9K重组构建了重组表达载体pPIC9K-Bm86，测序正确后将其用SacⅠ内切酶线性化后采用电穿孔法转化巴斯德毕赤酵母菌Gs115，经G418抗性筛选高拷贝重组菌株后用甲醇诱导表达，SDSPAGE和Western-blotting分析结果表明，诱导表达的培养上清液中表达出具有反应活性的68ku重组Bm86蛋白，目的蛋白约占培养上清液中蛋白总量的32％以上，诱导96h目的蛋白的表达量为0．36mg／mL。     

猪细小病毒VP2蛋白病毒样颗粒在伪狂犬病病毒表达系统中的表达

利用PCR技术从猪细小病毒（PPV）SC1株基因组中扩增VP2全基因,并将其插入真核表达载体pPI-2.EG-FP中,构建转移载体pPI-2.EGFP.VP2。采用脂质体介导法将猪伪狂犬病病毒（PRV）SA215株DNA与pPI-2.EGFP.VP2DNA共转染Vero细胞,待出现细胞病变后收集病毒液。经空斑纯化,并同时采用检测PPV VP2基因的PCR方法筛选获得重组病毒PRV SA215/VP2株。以兔抗VP2的多克隆抗体建立的免疫荧光技术可检测到Vero细胞发出的特异性荧光,表明PPV VP2成功插入到PRV SA215基因组中,并获得表达。进一步电镜观察表明,感染PRV SA215/VP2的Vero细胞中可同时观察到PRV与PPV 2种类病毒样颗粒。结果表明,成功实现了利用PRV载体表达PPV VP2蛋白病毒样颗粒,为进一步研制PPV病毒样颗粒疫苗奠定了基础。     

猪肠黏膜保护因子HO-1的短小芽孢杆菌表达系统建立与分析

【目的】 对猪黏膜保护因子——血红素加氧酶-1（heme oxygenase-1，HO-1）基因进行克隆及原核表达，为研究高表达HO-1在肠黏膜损伤中的保护作用提供技术支持。【方法】 根据GenBank中公布的HO-1序列（登录号：NM_001004027.1），利用Primer Premier 6.0设计1对特异性引物，利用RT-PCR方法扩增HO-1基因片段，将其与pMD19-T克隆载体连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行PCR鉴定；将载体pNCMO2与重组载体pMD19-T-HO-1进行Sal Ⅰ和Kpn Ⅰ双酶切，使用T4 DNA连接酶连接，利用电击转化技术将重组表达载体pNCMO2-HO-1转入感受态短小芽孢杆菌，使用IPTG进行诱导表达，应用SDS-PAGE和Western blotting分析HO-1在短小芽孢杆菌中的融合表达情况。【结果】 猪HO-1基因全长897 bp，编码298个氨基酸。双酶切后在约5 200和897 bp处分别观察到pNCMO2载体片段和HO-1基因片段，证明成功构建基因表达载体pNCMO2-HO-1；电转后的双酶切结果表明，在相同的位置观察到pNCMO2和HO-1片段，证明重组表达载体pNCMO2-HO-1成功导入短小芽孢杆菌。SDS-PAGE和Western blotting鉴定结果发现，在36.5 ku处出现了明显的蛋白印迹，表明成功表达了HO-1的重组蛋白，且为胞外分泌。【结论】 本研究成功构建了HO-1的重组原核表达载体，pNCMO2-HO-1重组载体可以在短小芽孢杆菌中诱导表达。     

猪圆环病毒2型ORF2-ORF1串联基因的原核表达及活性分析

为探讨原核表达的PCV-2ORF2-ORF1串联蛋白的抗原性及其作为基因工程亚单位疫苗的可能性,以构建好的PCV-2大庆分离株质粒pMD-18T/PCV-2为模板,PCR分别扩增去掉核定位信号的Cap蛋白基因(dNLS-ORF2)和Rep蛋白基因(ORF1),将其串联克隆到原核表达载体pET30a(+)上,经PCR、酶切和测序鉴定,成功构建了重组质粒pET30a-ORF2/ORF1。转化E.coli BL21(DE3)pLysS感受态细胞,经IPTG诱导后,进行SDS-PAGE电泳与Western blot分析。纯化的重组蛋白与PCV-2阳性血清发生特异性反应,并能与免疫小鼠的抗血清发生特异性反应。重组蛋白具有较好的免疫学活性,为基因工程亚单位疫苗的研制奠定了基础。     

表达虎源H_5N_1亚型禽流感病毒NP蛋白重组犬2型腺病毒的构建及鉴定

将A/Tiger/Harbin/132/2007(H5N1)的NP基因克隆入pVAX1载体中,然后将含有NP基因的表达盒(CMV+NP+PolyA)克隆入pVAXE3的SspⅠ酶切缺失处,获得含有NP基因表达盒的穿梭载体pVAXΔE3-NP。用SalⅠ+NruⅠ分别对pVAXΔE3-NP和pPoly-2-CAV-2进行双酶切,将含有NP基因表达盒的片段定向克隆入pPoly-2-CAV-2,获得在E3区缺失处插入NP基因表达盒的重组质粒pCAV-2-NP。释放CAV-2-NP重组基因组,脂质体介导转染DK细胞,获得了能使DK细胞产生典型腺病毒样细胞病变的CAV-2-NP重组病毒。从形态学、基因组水平、NP基因的转录、NP蛋白的表达以及重组病毒的生长特征等方面进行鉴定。结果表明,CAV-2-NP具有典型的CAV-2形态特征,在繁殖过程中没有对H5N1NP表达盒片段进行缺失或重排,并且能够转录H5N1NP基因的mRNA,ELISA和免疫荧光分析表明重组表达产物可被流感病毒NP基因单克隆抗体1G6G4所识别。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD基因的克隆与表达

构建pET32a重组表达载体,转化到BL21(DE3),诱导表达牛传染性鼻气管炎病毒重组gD蛋白。用已发表的IBRV的gD基因序列设计一对特异性引物,通过PCR方法扩增一条766bp的目的基因gD,将gD基因克隆到原核表达载体pet32a,得到重组表达载体pet32-gD,转化到BL21(DE)中,通过IPTG诱导获得融合蛋白。重组表达蛋白经纯化后,免疫印迹分析。结论证明表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。     

大片吸虫组织蛋白酶L1在大肠杆菌中的表达及纯化

利用PCR方法从pET28/FgCL1重组质粒中扩增FgCL1基因,定向克隆至原核表达载体pGEX-4T-2中,构建重组质粒pGEX/FgCL1,将该重组质粒转化大肠杆菌BL21中,转化子经IPTG诱导表达。重组蛋白以包涵体形式存在,相对分子质量为61 000。Western-blot、ELISA试验结果显示,纯化后的重组蛋白能被自然感染大片吸虫的牛血清所识别,表达产物具有良好的抗原性。     

猪圆环病毒2型DY株ORF2基因在Sf9昆虫细胞中的表达

本试验采用PCR方法扩增出完整的PCV2 ORF2基因,并将其克隆到Bac-to-Bac杆状病毒表达系统的转移载体pFastBac1^TM中,获得重组转移载体pFast-ORF2,再将其转化DH10Bac感受态细胞,发生转座反应,通过抗性及蓝白斑筛选获得含有ORF2基因的重组杆粒,通过Cellfectin转染试剂介导将重组杆粒DNA转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒。用该重组杆状病毒感染Sf9昆虫细胞,并通过间接免疫荧光法和Western blotting检测目的蛋白的表达。结果表明,ORF2基因在昆虫细胞中获得表达,表达的蛋白质可被PCV2阳性血清识别,这为进一步研究PCV2亚单位疫苗及诊断抗原奠定了基础。     

牛巴贝斯虫新疆株MSA-2c基因的克隆表达及其重组蛋白免疫原性

本试验将新疆株牛巴贝斯虫的MSA-2c基因克隆,并构建重组质粒pGEX-4T-2/MSA-2c.利用大肠杆菌原核表达系统进行外源蛋白的表达,并成功诱导出GST-MSA-2c融合蛋白.通过优化诱导条件,得到了较高的可溶性表达;利用亲和层析技术纯化后的重组蛋白皮下免疫试验小鼠.间接ELISA检测发现,免疫接种56 d后,抗重组蛋白的抗体效价达到1∶220 000以上.用获得的抗血清进行Western-blot试验,可获得清晰的免疫反应条带.结果表明,本试验所表达的MSA-2c蛋白与文献报道的目的蛋白相符,并具有免疫原性.同时本试验也为建立以MSA-2c重组蛋白作为抗原的血清学诊断体系奠定了基础.     

PEDV和TGEV双基因共表达载体pVAXD-PS1-TS的构建及体外表达

采用RT-PCR扩增猪传染性肠胃炎病毒（TGEV）SC-H株S基因N端主要抗原位点片段（大小约为1 916bp）和猪流行性腹泻病毒（PEDV）SC-L株S1基因（大小约为2 367bp）,插入pMDl9-T simple载体,经酶切与测序鉴定后,构建重组质粒pMD19-T-TS与pMD19-T-PS1。从T载体上将PS1、TS基因切下,以亚克隆方法插入双启动子真核表达载体pVAXD,构建能同时表达TGEV S基因和PEDV S1基因的重组质粒pVAXD-PS1-TS。对重组质粒进行PCR与酶切鉴定后,以脂质体转染法转染COS7细胞,间接免疫荧光检测转染后细胞外源基因的表达情况。结果表明,重组质粒构建正确且能够在COS7细胞中得到表达,转染的细胞呈现特异性荧光。真核表达质粒pVAXD-PS1-TS的成功构建为进一步研究PEDV和TGEV的二联核酸疫苗奠定了基础。     

牛病毒性腹泻-黏膜病病毒Changchun184株E2基因在卡介苗中的表达

在成功克隆牛病毒性腹泻一黏膜病痛毒Changchun184株E2基因的基础上,将E2基因与表达载体pMV261连接,构建了重组穿梭质粒pMV261-E2,后电转化到卡介苗中,获得了具有卡那霉素抗性的重组卡介苗,并对重组卡介苗进行菌落PCR鏊定.在45℃下热诱导E2基因在重组卡介苗中的表达,并对表达产物进行SDS-PAGE电泳和Wesern blotting 分析.结果证明,牛病毒性腹泻-黏膜病病毒Changchun184株E2基因在卡介苗中成功的表达.