高粱Na~+转运蛋白基因SbSKC1的克隆及其在烟草中的抗盐功能鉴定

钠离子转运蛋白基因在植物抵御逆境胁迫中起重要作用,本研究克隆了高粱钠离子转运蛋白基因SbSKC1(XM_002457691.1),其完整开放阅读框包含1497个核苷酸,编码498个氨基酸残基。氨基酸序列比对及进化树分析表明,SbSKC1与玉米(Zea mays)LOC100382359(NP_001162576.1)具有高度相似性。构建pSH-SbSKC1植物表达载体,利用农杆菌介导法将SbSKC1转入烟草(Nicotiana tabacum cv.Xanthin)。转基因植株经PCR验证后进行300 mmol L~(–1)NaCl胁迫处理,转基因植株的存活率高于野生型,其根长显著高于野生型,而且转基因烟草保持了较高的钾钠离子比。盐胁迫后,转基因烟草的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性显著高于野生型,而过氧化氢(H_2O_2)含量比野生型烟草低37.7%。根据以上结果推断,过量表达SbSKC1基因能够提高烟草的抗盐性。     

梭梭HaNAC1基因的亚细胞定位、转录激活及表达分析

HaNAC1为本课题组前期从梭梭幼苗中克隆得到的一个NAC家族(ATAF亚家族)转录因子编码基因,本研究将对该基因进行进一步的活性验证和功能分析。通过烟草叶片细胞中的绿色荧光蛋白瞬时表达系统对表达蛋白进行亚细胞定位,结果表明HaNAC1蛋白位于细胞核中。构建AH109酵母pGBKT7-HaNAC1表达载体,证明该转录因子在酵母中具有转录激活活性。利用实时荧光定量PCR方法测定HaNAC1在盐、旱胁迫条件下的表达水平,结果显示该基因的表达量与盐胁迫的浓度呈现正相关,表明HaNAC1参与调节梭梭的盐胁迫响应。本研究探索了HaNAC1的定位和表达,为梭梭抗逆体系的功能基因挖掘及胁迫应答机理提供科学依据。     

烟草ERF基因NtRAP2-7的表达载体构建及表达模式分析

为了研究烟草Nt RAP2-7基因在非生物胁迫响应中的功能,采用同源克隆的方法,在烟草品种K326中克隆到1个ERF转录因子基因Nt RAP2-7。并利用生物信息学软件分析了该基因编码蛋白的理化性质、空间结构与系统进化关系。序列分析结果表明,该基因序列全长1 398 bp,共编码465个氨基酸残基,预测蛋白的分子量为51. 16 ku。该蛋白包含一个由3个β-折叠及1个α-螺旋组成的保守结构,并含有58个磷酸化位点。亚细胞定位预测表明,该蛋白主要定位于细胞核,并包含单分型的核定位信号序列。进化分析表明,Nt RAP2-7蛋白与林烟草RAP2-7蛋白序列同源性最高,为98%。运用q RT-PCR技术进行了该基因的表达模式分析,组织表达分析发现,Nt RAP2-7基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,但在根中的表达量最高。该基因的表达在低钾、高盐、干旱、ABA、H2O2处理下受到诱导和在低温处理下受到抑制,结果表明,烟草Nt RAP2-7基因参与了烟草的非生物胁迫应答反应。并利用双酶切法成功构建了p BI121-Nt RAP2-7过表达载体,为今后该基因在非生物胁迫下的功能研究奠定了基础。     

烟草NtCYP734A1基因的克隆及表达分析

油菜素内酯是一种参与胁迫响应的甾醇类植物激素,CYP734A1基因是油菜素内酯代谢通路上的关键基因。为探索CYP734A1基因在烟草响应非生物胁迫时发挥的功能,本研究以普通烟草品种K326为材料,克隆CYP734A1基因,通过生物信息学技术分析NtCYP734A1蛋白的理化性质及进化关系,运用实时荧光定量法分析CYP734A1基因在不同组织、不同非生物胁迫处理下的基因表达模式。结果表明,CYP734A1基因全长1 638 bp,编码545个氨基酸;亚细胞定位预测NtCYP734A1蛋白存在于内质网。qRT-PCR分析表明,烟草CYP734A1基因在不同组织均有表达,叶中表达量最高,茎中的表达量最低。非生物胁迫处理下,CYP734A1基因在各组织的表达量显著改变,在干旱、盐和低温胁迫下根的CYP734A1基因表达上调;在干旱、盐、高温和低温共4种胁迫下,叶中CYP734A1基因表达下调。     

小麦组氨酸磷酸转运蛋白TaHP4基因的克隆和表达分析

细胞分裂素在植物生长发育和抵御盐、干旱等非生物胁迫过程中发挥着重要作用。为了研究小麦细胞分裂素信号转导途径中组氨酸磷酸转运蛋白基因的功能和在植物逆境响应中的分子机制,以电子克隆结合RT-PCR的方法,从小麦中克隆了组氨酸磷酸转运蛋白基因Ta HP4。该基因的开放阅读框为456 bp,编码的蛋白长度为151个氨基酸,推测的蛋白分子量为17.71 ku,等电点为9.09,属于碱性蛋白,具有一个HPt结构域和一个负责磷酸基团传递的保守的组氨酸位点。多序列比对和系统进化树分析表明,Ta HP4与水稻和玉米中不含保守组氨酸位点的Os PHP1-Os PHP3和Zm HP4亲缘关系较近,相似性为62.3%~88.7%;而与小麦中前期已经克隆的Ta HP1-Ta HP3亲缘关系较远,相似性仅为32.2%~34.2%。Ta HP4基因表达模式具有较强的组织特异性,在叶、穗、茎等地上部表达量较高,而在根中则表达量很低。另外,Ta HP4基因受盐、干旱和ABA抑制表达,初步推测该基因可能在小麦抵御逆境胁迫的生物学过程中具有重要作用。     

玉米热激蛋白基因ZmHSP90-1的克隆及表达分析

HSP90是普遍存在于原核和真核细胞中的一种高度保守的分子伴侣。本研究从玉米中克隆了一个HSP90同源基因, 命名为ZmHSP90-1基因, 并对其进行了初步的序列分析。该基因cDNA序列全长2 371 bp, 开放阅读框2 094 bp, 编码697个氨基酸, 蛋白质分子量约79.98 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明, ZmHSP90-1基因编码蛋白含ATPase位点和HSP90保守结构域, 并与拟南芥、水稻等多种物种的热激蛋白高度同源; 进化树分析表明ZmHSP90-1与拟南芥AtHSP90.1基因关系较近, 蛋白序列相似性达88.3%。目的蛋白亚细胞定位显示, ZmHSP90-1蛋白在细胞质中表达。实时荧光定量PCR分析表明, ZmHSP90-1对非生物胁迫高温、高盐、ABA、低温、干旱均具有明显的应答反应。推测ZmHSP90-1是玉米的一个胁迫相关基因。     

陆地棉耐盐相关基因GhSAMS的克隆及表达

为了挖掘棉花耐盐相关基因,我们根据陆地棉耐盐性抑制消减文库中的一个S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的同源EST设计引物,利用RACE结合RT-PCR技术克隆陆地棉S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因的cDNA全长,命名为GhSAMS。该cDNA全长1 576 bp,ORF为1 182 bp,编码393个氨基酸的多肽。生物信息学分析表明GhSAMS蛋白与拟南芥、盐地碱蓬、水稻中该蛋白的相似性分别为91%、93%和93%。系统发育树结果显示GhSAMS与盐地碱蓬中该蛋白的亲缘关系最近。Real-time PCR分析结果表明,GhSAMS的表达受盐胁迫诱导,在盐敏感材料中诱导被推迟,而且,该基因表达水平在耐盐材料中9835中明显高于在盐敏感材料中S9612中。我们构建了原核表达载体pET28-GhSAMS,经IPTG诱导,实现了GhSAMS在大肠杆菌中的表达,为进一步开展GhSAMS的遗传转化工作奠定了有益基础。     

盐角草P5CS基因克隆及其在高盐胁迫下的表达分析

Δ1-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)是植物脯氨酸合成途径中的限速酶,但P5CS基因在调节植物耐盐过程中具体的生物学功能尚不明确。本研究利用RT-PCR方法从盐角草中分离得到一个P5CS基因,并对其进行了生物信息学分析和盐胁迫表达特性分析。结果表明,盐角草P5CS基因的c DNA序列全长为2151 bp,编码716个氨基酸,其编码的蛋白质分子量为77.6 k D,等电点为5.83,为稳定蛋白,无信号肽和跨膜区域。二级结构预测显示该蛋白分子中α螺旋结构最多,占43.3%。与已知甜菜、菠菜、滨柃、葡萄中的P5CS基因的氨基酸序列相似性分别为91%、89%、81%和80%,说明该基因与P5CS为同源基因,被命名为Se P5CS。Real-time PCR分析表明,该基因受植物盐胁迫后诱导表达,推测Se P5CS基因在盐角草抵御盐胁迫逆境中起着重要作用。研究结果为明确P5CS基因在植物耐盐应答机制中的生物学功能提供基础。     

苦荞麦FtNHX1基因的克隆及表达分析

为深入研究液泡膜Na~+/H~+逆向转运蛋白在植物耐盐中的作用,以耐盐苦荞麦品种川荞1号为材料,利用同源克隆方法得到NHX基因,命名为FtNHX1,并在Gen Bank中注册,登录号为KY438929;序列分析表明,该基因开放阅读框1 662 bp,共编码553个氨基酸,预测蛋白分子量61.24 kDa,等电点5.15。系统进化树分析表明,FtNHX1与拟南芥(AtNHX1)、水稻(OsNHX1)和小麦(TaNHX1)的亲缘关系较近,氨基酸同源率分别为60.22%,58.95%和57.30%;荧光定量PCR分析表明,随着Na Cl胁迫浓度的增加,FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的相对表达量极显著增加,150 mmol/L NaCl胁迫下增加幅度最大,分别比对照增加了254.10%,311.35%和256.18%;Na Cl胁迫下FtNHX1基因在苦荞麦根部、茎基部和叶片的平均表达量分别比对照增加了109.46%,145.67%和155.94%,茎基部和叶片的平均表达量较高,说明苦荞麦FtNHX1基因的表达明显受盐胁迫诱导和调节,FtNHX1基因与苦荞麦的耐盐性有密切联系。     

高温和盐胁迫下硅对辣椒CaMADS-box基因表达的影响

为了探索非生物胁迫下硅对辣椒Ca MADS-box基因表达的影响,以豫椒101为材料,在对辣椒Ca MADS-box基因片段同源克隆的基础上,对其编码的部分蛋白进行氨基酸同源性分析、理化性质预测、亚细胞定位预测和进化树分析,探讨了硅处理后辣椒Ca MADS-box基因在高温胁迫、盐胁迫下表达量的变化,结果表明,克隆得到的Ca MADSbox基因所编码的蛋白为亲水性蛋白,含有MADS结构域,属于MADS基因家族,亚细胞定位在细胞核中,分子进化树表明其与茄属和烟草属亲缘关系最近,相似性达到67%。荧光定量分析表明,Ca MADS-box基因在高温胁迫和盐胁迫后表达量都呈现出先升高后下降的模式,高温胁迫下48 h达到峰值,而盐胁迫在24 h达到峰值,硅处理能够诱导Ca MADS-box基因表达,在高温胁迫和盐胁迫下都在12 h达到高峰值,这表明Ca MADS-box是一个硅快速响应基因,推测硅处理在缓解辣椒高温胁迫和盐胁迫等非生物胁迫方面具有重要作用。     

烟草过氧化物酶基因NtPOD1的克隆及表达模式分析

为烟草过氧化物酶基因的功能及结构研究奠定理论基础,采用同源克隆的方法,从烤烟品种K326中克隆出了过氧化物酶基因Nt POD1的c DNA全长,并进行了生物信息学分析;同时,运用q RT-PCR的方法,分析了该基因的组织器官及逆境胁迫表达模式。结果显示,该基因c DNA全长981 bp,编码326个氨基酸残基,预测分子量为37.19 ku,等电点为8.89。生物信息学分析表明,该蛋白是一个亲水性蛋白,结构域中含有4个保守的二硫键和2个保守的钙结合位点,可能定位在细胞外(包括细胞壁),属于植物血红素依赖性过氧化物酶超家族的Ⅲ类分泌氧化酶,与渐窄叶烟草POD42、美花烟草POD42、马铃薯POD42等具有很高的同源性。该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中叶中表达量最高,花中表达量最低。同时,Nt POD1的表达受高盐、干旱、低钾、ABA和H2O2诱导。结果表明,Nt POD1基因属于烟草的过氧化物酶,并可能在烟草非生物逆境胁迫响应中发挥作用。     

烟草K~+通道NtSKOR基因的克隆及表达分析

钾通道是植物吸收和转运K~+的主要蛋白质,SKOR属于Shaker通道外整流家族,在植物低钾胁迫反应中起关键作用。为了研究烟草NtSKOR基因在非生物逆境胁迫中的功能和作用,以普通烟草K326为试验材料,同源克隆一个NtSKOR基因c DNA全长,利用实时荧光定量PCR表征基因表达模式,结合生物信息学分析,对蛋白的理化性质、结构域、磷酸化位点和进化关系等进行初步预测。生物信息学分析表明,该基因全长2 484 bp,编码827个氨基酸残基,预测分子量为94. 75 ku,等电点为6.52。该蛋白最大二级结构元件为α-螺旋,最小为β-转角,含有6个跨膜结构域(S1～S6),具有丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸3种不同激酶磷酸化位点。进化分析表明,NtSKOR与美花烟草和绒毛状烟草SKOR蛋白同源性高,分别是99%和96%,故命名为NtSKOR。组织表达分析发现,该基因在烟草根、茎、叶、花中均有表达,其中根中表达量最高,花中表达量最低。逆境胁迫试验表明,该基因能快速响应低钾、高盐、干旱、H_2O_2、ABA和4℃等非生物逆境处理。由此推测,NtSKOR在烟草非生物逆境胁迫起着重要调节作用,为今后进一步深入研究NtSKOR功能提供了理论基础。     

烟草NtNramp1-1基因克隆及特征分析

在植物中Nramp蛋白参与重金属的吸收转运,为了研究烟草重金属的吸收转运机理,本文在烟草中克隆了NtNramp1-1基因。该基因ORF由1 602个核苷酸组成,编码534个氨基酸。生物信息学分析结果表明,NtNramp1-1基因编码跨膜蛋白。对NtNramp1-1基因进行组织特异性表达,结果表明该基因主要在烟草根部表达。Cd和As处理能够大幅提高NtNramp1-1基因的表达水平,推测该基因参与烟草Cd、As的吸收转运。     

小麦抗坏血酸过氧化物酶TaAPX基因克隆与表达分析

为了研究非生物胁迫处理下小麦抗坏血酸过氧化物酶(APX)的作用,以小麦百农207为试验材料,根据小麦APX基因序列,采用RT-PCR技术对小麦APX基因进行克隆、生物信息学分析及组织表达模式分析;对小麦进行非生物胁迫处理,分析小麦APX基因在环境胁迫条件下的表达特征。结果表明,TaAPX基因包含876 bp的开放阅读框,编码1个291个氨基酸组成的蛋白质,分子质量为31.73 ku,等电点为7.74,分子式C_(1417)H_(2246)N_(394)O_(423)S_5,TaAPX可能是两性蛋白,无信号肽,为非分泌蛋白。蛋白质序列比对和进化树分析表明,小麦与大麦的APX编码蛋白的氨基酸全长序列相似性最高达到97.25%,亲缘关系最近。实时荧光定量PCR分析表明,TaAPX在小麦幼根、茎、茎节、幼叶、叶鞘、雌蕊和雄蕊中均有表达,其中在幼叶中表达量最高,其次是茎、茎节,在幼根、叶鞘中表达量较低,在雌、雄蕊中表达量最低。在非生物胁迫条件下该基因受干旱、低温胁迫表达增强,而在NaCl胁迫和渗透胁迫下表达降低。综上,获得了TaAPX基因的编码区序列,分析发现其响应干旱、低温和盐等逆境胁迫,提示该基因可能与小麦抗逆境机制密切相关。     

棉属野生种旱地棉蛋白激酶基因GarCIPK8的克隆与功能分析

CIPK (calcineurin B-like calcium sensor interacting protein kinase)是植物钙感受器钙调磷酸酶B类似蛋白特定靶向的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。在前期的研究中, 我们将棉属野生种D亚组旱地棉(Gossypium aridum)盐胁迫前后RNA混合样品进行转录组测序, 发现一CIPK相关基因存在较高的转录丰度。盐胁迫下荧光定量PCR分析表明该基因在根部表现诱导上调表达, 推测该基因可能参与植物在高盐胁迫下的生理调控。利用电子克隆及RT-PCR方法从旱地棉中克隆了一个ORF全长为1350 bp的蛋白激酶基因GarCIPK8。序列分析表明该基因编码的蛋白含有449个氨基酸, 分子量为51.12 kD, 理论等电点为8.13, 其N端催化结构域包含一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶域, C端具有植物CIPK蛋白家族特有的24个氨基酸组成的NAF保守结构域; 与水稻OsCIPK8蛋白的相似度为73.95%。为进一步验证其功能, 利用组成型高效强启动子CaMV35S和拟南芥逆境胁迫启动子rd29A构建植物表达载体并转化烟草, 经PCR和RT-PCR分子检测, 证明GarCIPK8基因已经整合到烟草基因组中, 并正常表达。T₁代转基因植株耐盐性鉴定结果表明GarCIPK8基因对提高转基因植株的耐盐性有较明显的作用, PEG干旱模拟试验也证明GarCIPK8基因可增强植株的抗旱性。     

苎麻ACC合酶基因(BnACS1)的克隆和表达分析

根据苎麻转录组测序中的ACS基因片段, 利用RT-PCR结合RACE技术从湘苎3号中克隆了该基因的全长cDNA序列, 命名为BnACS1, 在GenBank中的登录号为JQ970520。该基因的cDNA序列全长为1 674 bp, 其开放阅读框长1 470 bp, 编码489个氨基酸多肽, 预测其分子量和等电点分别为54.55 kD和6.37, 与苹果(AB034993)、枇杷(GQ370520)、苦瓜(AF248734)、牡丹(DQ337250)、烟草(AY426755)和胡杨(AB033502) ACS基因核苷酸序列的相似性分别为74%、74%、72%、71%、70%和70%, 氨基酸序列的相似性分别为75%、74%、71%、71%、70%和74%。半定量RT-PCR分析表明, BnACS1基因在根、茎、茎尖、叶片、雌花和雄花中均有表达, 其中在根和雄花中表达较高, 在茎中表达最低。荧光定量PCR分析表明, BnACS1受ABA和干旱的诱导表达上调, 不受高盐诱导表达。     

棉花GhTFL1b基因的表达及调控分析

为解析棉花中磷脂酰乙醇胺结合蛋白GhTFL1b基因对胁迫的响应及生理功能,从棉花中克隆了磷脂酰乙醇胺结合蛋白GhTFL1b基因,并对该基因进行表达分析和蛋白质互作研究。利用启动子分析软件PlantCARE预测得出,GhTFL1b启动子区域有茉莉酸响应元件、脱落酸响应元件、干旱诱导的MYB结合位点和光周期响应元件等。对GhTFL1b进行组织特异性表达分析,发现该基因在花中表达量最高,其次是根和顶芽,其他组织中表达量极低。进一步比较栽培种和半野生种不同时期的表达,发现无明显差异。激素和胁迫处理研究表明,GhTFL1b基因受水杨酸(Salicylic acid,SA)诱导低调表达,而受盐胁迫处理后高调表达。酵母双杂交验证GhFD与GhTFL1亚组蛋白互作,结果表明GhFD蛋白只能与GhTFL1b互作,而不与GhTFL1a、GhTFL1b、GhTFL1c互作。GhTFL1b基因不参与光周期调控通路,可能参与植物逆境胁迫水杨酸和盐胁迫响应的调控。     

费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因的异源表达增强了烟草对干旱、盐及叶斑病的抗性

为明确一年生草本盐生植物费尔干猪毛菜(Salsola ferganica Drob.)病程相关蛋白基因SfPR1a (GenBank登录号为JQ670917)是否参与了植物对逆境胁迫的响应,采用qRT-PCR检测了该基因在不同组织部位和脱落酸(ABA)、茉莉酸(JAs)、乙烯合成直接前体(ACC)等相关激素胁迫及NaCl处理下的表达规律,同时对转基因烟草在盐、旱及丁香假单胞菌等胁迫下的抗性进行了鉴定。结果显示, SfPR1a基因在费尔干猪毛菜根中的表达量显著高于茎叶中,且受到ABA、JAs、ACC、NaCl的积极诱导;干旱胁迫下,转基因烟草的丙二醛(MDA)含量显著低于野生型烟草,显示出较强的抗旱表型;盐胁迫下,异源表达SfPR1a的转基因烟草幼苗生长显著优于野生型烟草;丁香假单胞菌攻毒后的转基因烟草叶片呈现严重的坏死反应,但植株的整体抗性表型显著优于野生型烟草;亚细胞定位结果显示该蛋白定位于植物细胞质外体空间。以上结果表明,费尔干猪毛菜病程相关蛋白SfPR1a基因参与了植物对非生物及生物胁迫的抗性。     

木薯MeAnn1基因的克隆及表达分析

以华南8号木薯为材料,采用RT-PCR技术,克隆得到1个具有完整阅读框的木薯膜联蛋白基因,命名为MeAnn1(Gen Bank序列号为:KM975562),该基因CDS序列长度为951 bp,编码317个氨基酸。生物信息学分析发现,其理化性质、蛋白保守结构域及多个蛋白功能位点与已报道的植物膜联蛋白一致。进化树分析表明,木薯MeAnn1与Ptr Ann6、At Ann1、At Ann2、At Ann6和Ann Bj1具有较近的亲缘关系,具有59.9%~84%的序列相似性。细胞定位结果表明MeAnn1蛋白主要定位于细胞质和细胞核中。实时荧光定量PCR分析表明,木薯膜联蛋白基因MeAnn1的表达受多种非生物胁迫的诱导,其中低温胁迫下基因表达量上调幅度最大,为对照表达量的24倍;但对H2O2胁迫不敏感。本研究结果有助于进一步研究MeAnn1基因的功能及木薯抗逆的分子机理。     

烟草转录因子NtNAC080在非生物胁迫下的表达分析及功能鉴定

NAC作为植物特有的转录因子,广泛参与植物生长发育、衰老及胁迫响应等生物学过程。为探究烟草NtNAC080在非生物胁迫响应中的功能,利用qRT-PCR技术分析了不同胁迫处理下NtNAC080的表达模式,结果表明,NtNAC080的表达受干旱、高盐胁迫以及ABA、MeJA和SA激素的诱导;以NtNAC080基因的敲除突变体及野生型(K326)烟株为材料,分析敲除株系在高盐和干旱胁迫下抗逆表型。试验表明,与野生型相比,2个敲除株系的耐盐抗旱能力均明显增强;干旱和盐胁迫下敲除株系的抗氧化酶(SOD、POD、CAT)活性以及可溶性蛋白、脯氨酸含量显著高于野生型,而丙二醛含量显著低于野生型。相反地,异源表达NtNAC080的转基因拟南芥与野生型(Col-0)相比对盐和干旱的耐受性明显减弱。qRT-PCR分析发现在干旱和盐处理后胁迫相关基因(NtDREB1A、NtKAT2、NtNHX1等)在NtNAC080基因敲除株系中表达水平显著高于野生型。以上结果表明,NtNAC080在烟草的非生物胁迫响应中起负调控作用,这可能是通过调控抗氧化酶活性及胁迫相关基因的表达来实现的。