抗生素对剑麻愈伤组织生长和植株再生的影响

研究卡那霉素、潮霉素、头孢霉素和羧苄青霉素对剑麻愈伤组织生长、不定芽分化及生根的影响,并确定抑制农杆菌生长的头孢霉素、羧苄青霉素的质量浓度。结果表明：潮霉素明显抑制剑麻愈伤组织生长和不定芽分化,卡那霉素次之,头孢霉素和羧苄青霉素相对较小;4种抗生素均能抑制剑麻生根,其抑制效果依次为头孢霉素＞卡那霉素＞羧苄青霉素＞潮霉素。头孢霉素和羧苄青霉素的浓度大于200 mg/L时,农杆菌生长完全被抑制。在筛选剑麻转化体时,卡那霉素和潮霉素的使用浓度分别以100、50 mg/L为宜,羧苄青霉素和头孢霉素的使用浓度均为200 mg/L。     

抗生素对巴西橡胶树花药愈伤组织生长与分化的影响

将巴西橡胶树花药胚性愈伤组织接种到添加不同浓度的羧苄青霉素、头孢霉素和特泯丁3种抑制农杆菌生长的抗生素培养基上,结果表明：除500mg/L特泯丁抑制胚性愈伤组织生长但促进体胚发生,其它抗生素均为促进愈伤组织生长但抑制体胚发生。潮霉素、卡那霉素和巴龙霉素3种筛选抗生素均抑制愈伤组织生长和体胚发生,三者抑制能力顺序为潮霉素〉卡那霉素〉巴龙霉素,但潮霉素完全抑制了体胚发生,而巴龙霉素则与对照相似即对体胚发生几乎没有抑制作用。故特泯丁可以作为农杆菌介导巴西橡胶树花药愈伤组织遗传转化的抑菌抗生素,500mg／L使用浓度效果较好,卡那霉素作为筛选抗生素,50mg／L使用浓度效果较好。     

抗生素对大豆未成熟子叶愈伤形成和体细胞胚胎发生的影响

用6个大豆品种进行了抗生素敏感性试验，结果表明：在培养基中加入50mg/L卡那毒素可显著地降低出愈率。大豆不同品种对卡那霉素的反应在出愈率上表现相似，而在体细胞胚胎发生率上存在差异，培养基中含有400mg/L头孢霉素时出愈率显著降低，而体细胞胚胎发生率因品种不同而不同，用农杆菌侵染大豆未成熟子叶后在含有头孢霉素的培养基中培养时，体细胞胚胎发生率大幅度下降，本试验初步确定了较适合于大豆未成熟子，叶抗性选择的卡那霉素浓度和头孢霉素的脱菌浓度。     

农杆菌介导的花生遗传转化研究

对影响花生遗传转化效率的PPT筛选压、根癌农杆菌的侵染浓度、侵染及共培养时间等因素进行研究，采用农杆菌转化花生叶片，成功地将抗虫基因豇豆蛋白酶抑制基因(CpTI)和耐除草剂基因(Bar)导入花生。实验结果表明，外植体在MS 3mg／LBA 0．8mg／LNAA 2mg／LAgNO3 6mg／L Gln培养基上预培养3d，于OD600为0．3的农杆菌菌液中浸泡5～7min后培养2d，再转移至含有3mg／LBA 0．8mg／LNAA 2mg／LAgNO3 6mg／L Gln 500mg／LCb 300mg／LCef 0．25mg／LPPT的MS培养基诱导筛选培养，3个月后得到24个再生株系。经PCR初步检测，有7个株系显示了310bp的CpTI基因核酸片段，Southern杂交证实了5个株系有外源基因的整合。     

人胰岛素样生长因子-Ⅰ基因转化葡萄的研究

以根癌农杆菌介导的叶盘法转化技术将huIGF－Ⅰ基因转入葡萄组织细胞，并通过既成的再生－转化体系诱导筛选huIGF－Ⅰ转基因葡萄植株，在抗性筛选中使用卡那霉素浓度为（Kan.)40mg/L，使用的根癌农杆菌工程菌株为EHA105／pBIGF－Ⅰ、EHA105／pCIGF－Ⅰ。最后用PCR技术、Southern blot对转基因植株作分子鉴定，其检测阳性率分别为60％和66.6%。     

农杆菌介导的CyMV-CP基因对石斛遗传转化研究

以本实验室构建的含有建兰花叶病毒外壳蛋白基因(CyMV-CP)的pBI121为表达载体,以继代培养2～3次的石斛类原球茎为转化受体,用农杆菌介导法转化石斛,建立并优化了石斛的遗传转化体系。结果表明:类原球茎经农杆菌菌液(OD600值为1.0)侵染30 min后,24℃培养4 d,用头孢霉素(500 mg/L)脱菌后转接到卡那霉素(150 mg/L)筛选培养基中进行筛选培养;对获得的转CyMV-CP石斛进行PCR和实时荧光定量RT-PCR检测,表明目的基因已经整合到石斛基因组中,并得到表达。所建立的转化体系,受体材料来源丰富、转化过程简单,可重复性强、转化效率高、假阳性少,适合于石斛的遗传转化研究。     

尾叶桉U6遗传转化再生体系的建立

以桉树品种尾叶桉U6叶盘为外植体,选用MS培养基为基本培养基,附加激素6-BA,IAA,IBA,NAAA,通过研究不同激素浓度组合对外植体愈伤诱导及不定芽分化的影响,建立了较好的遗传转化再生体系.结果表明,尾叶桉U6叶盘最适分化培养基为MS 6-BA 2.0 mg/L 2,4-D 1 mg/L IAA 0.2 mg/L 蔗糖30 g/L 琼脂粉5 g/L;小苗的最佳生根培养基为MS NAA 0.2 mg/L mA 0.5 m/L 蔗糖30 g/L 琼脂粉5 g,L.40mg/L卡那霉素可以抑制叶盘的分化;20 mg/L卡那霉素可以抑制再生植株的生根.2种抑菌抗生素中,头孢霉素对叶片再生影响较大;而250 mg/L的羧苄青霉素能有效地抑制农杆菌菌株EHA105的生长,却对尾叶桉叶盘的芽分化影响不大,为适宜的抑菌抗生素.3种农杆菌LBA4404,EHA105,GV3101的菌液浸染桉树叶盘,统计其愈伤组织GUS染色率,以EHA105对外植体的浸染能力最强,达83.3%.     

通过农杆菌介导将菜豆几丁质酶基因导入马铃薯

选用两个生产上主栽马铃薯品种“鲁引 1号”和“鲁引 4号”的试管微型薯为材料 ,通过农杆菌介导成功地将菜豆几丁质酶基因导入到马铃薯中。试管微型薯薯片与农杆菌共培养 3d后 ,转到含卡那霉素 10 0mg/L的分化培养基上诱导不定芽分化。待抗性芽长到 1 0～ 1 5cm高时 ,转入含卡那霉素 10 0mg/L的液体培养基中进行生根筛选。经过分化和生根两轮筛选的转化植株的PCR检测结果均为阳性 ,而未经转化的对照植株为阴性 ,证明该筛选系统是可靠的。早熟品种鲁引 1号的转化频率明显高于晚熟品种克新 4号 ,其最高转化频率为 4 1 0 % ,平均每个外植体可得到 3 85株转化苗。转化植株的抗病性鉴定正在进行中     

抗生素对亚麻下胚轴愈伤诱导及芽分化的影响

研究了抗生素对亚麻下胚轴愈伤诱导及芽分化的影响。结果表明:在以潮霉素为抗性选择剂时,低浓度潮霉素已严重抑制愈伤的形成,25 mg/L的潮霉素为亚麻下胚轴愈伤形成及芽分化的较合适筛选浓度;在以氨苄青霉素、头孢霉素和羧苄青霉素为抑菌抗生素时,不同浓度抗生素对亚麻下胚轴愈伤及芽分化产生的影响不同,羧苄青霉素浓度大于300 mg/L时,对亚麻下胚轴的分化产生抑制,氨苄青霉素和头孢霉素浓度大于500 mg/L时,对亚麻下胚轴的分化产生抑制。在3种抗生素中,选择氨苄青霉素作为农杆菌介导转基因的脱菌抗生素,浓度为300mg/L时,已有很好的抑菌效果。     

甘蔗愈伤组织、组培幼苗对抗生素的敏感性试验

以甘蔗愈伤组织、组培幼苗分别在附有卡那霉素、潮霉素、头孢霉素的培养基上进行培养，研究甘蔗对抗生素的敏感性。结果表明：甘蔗对卡那霉素敏感，在200－400mg/L的浓度范围内，愈伤组织失去分化能力，组培幼苗生长受到抑制，白化苗现象非常严重；甘蔗对潮霉素较敏感，在1－40mg/L的浓度范围内愈伤组织均有分化能力，但在20－40mg/L时幼苗不能存活；对头孢霉纱不敏感，在100－1000mg/L处理浓度中，愈伤组织均有分化能力，组培幼苗生长受抑制不明显。     

花生子叶遗传转化再生体系影响因素的研究

本试验选用子叶为外植体研究了影响植株再生和遗传转化的因素。结果表明,细胞分裂素(6-BA)5.00 mg/L (2,4-D)1.50 mg/L的诱导培养基子叶外植体丛生芽诱导率最高,分别达89.67%和83.33%。遗传转化影响因素结果表明,菌液OD600为0.5-0.7、侵染时间10min、共培养时间3d、每50mL菌液添加烟草提取物1.0mL可获得较好的转化效果。抗生素对芽分化率影响的研究结果表明,当头孢唑林钠(Cef)250 mg/L 羧苄青霉素(Carb)250-500 mg/L时效果最好,不但可以完全抑制农杆菌生长,而且有较高的芽诱导率。     

根癌农杆菌介导茶树转化研究

通过检测GUS瞬间表达 ,对影响根癌农杆菌侵染茶树叶片效果的若干因素进行研究。Kan对茶树叶片愈伤组织形成的抑制浓度在 3 0mg/L左右 ,因而对以Kan为筛选标记的载体来说 ,5 0mg/LKan是较为适宜的选择浓度。茶树较为适宜的农杆菌转化系统是用OD6 0 0 为 0 5 - 0 8的LBA4 4 0 4侵染 10分钟左右 ,暗中2 8℃共培养 2 - 3天。硝酸银对农杆菌生长有抑制作用 ,不宜在共培养阶段添加     

利用农杆菌介导法转化大豆子叶节的影响因素研究

以3个大豆品种为材料,采用GUS瞬时表达的方法,对适合于大豆子叶节和胚尖转化的基因型进行筛选,结果表明:适合大豆子叶节转化的品种为东农50,适合胚尖转化的品种为黑农41。在子叶节转化系统中,摸索了农杆菌侵染浓度与侵染时间的最佳配比组合、乙酰丁香酮浓度和超声波辅助处理对大豆转化效率的影响。优化后的条件为:农杆菌侵染的浓度OD600=0.6,侵染时间30～40 min,乙酰丁香酮浓度200μmol.L-1,超声波辅助转化时间5 s。在上述条件下,成功获得了转基因植株,转化效率为2.3%。     

苦参毛状根的诱导培养及氧化苦参碱含量的测定

本文主要利用三种发根农杆菌A4、15834、R1601诱导苦参产生毛状根,初步为建立苦参的毛状根培养体系提供参考。本实验采用共培养法,考察了不同外植体、菌种、培养时间对苦参毛状根诱导率的影响,并对苦参毛状根中氧化苦参碱进行初步的含量测定。研究结果表明,苦参毛状根的最佳诱导条件是以生长1周的苦参幼芽为外植体,R1601为菌株,添加100μmol/l的乙酰丁香酮,侵染20 min,(25±1)℃暗处诱导,最终测定诱导率最高为27.6%,存活率为45.8%,而苦参毛状根中氧化苦参碱的富集量为1.68mg/g(苦参毛状根干重),未检测到苦参碱。     

农杆菌介导向玉米茎尖导入HAL1基因的初步研究

选用玉米优良自交系郑58的茎尖为受体,研究以玉米茎尖为受体进行农杆菌转化体系的可行性。用农杆菌介导法将耐盐碱基因HAL1转入玉米中,获得70株转化苗,经过300 mg/L的除草剂(Basta)筛选,共获得9株转基因植株。进一步进行 PCR检测,其中6株表现阳性,转化率达8.57%。初步证明外源基因已经整合到玉米基因组中,以玉米茎尖作为受体孢子体的转化系统可用于基因转化。     

利用农杆菌介导法进行亚麻转基因的培养基研究

本试验以亚麻幼苗的下胚轴为外植体进行了卡那霉素选择压力的试验。确定5 0mg/L为适宜的选择压力。同时采用农杆菌介导法 ,利用EHA1 0 5菌株进行了亚麻转基因适宜培养基筛选试验。经试验认为MS培养基是亚麻转基因的适宜培养基。在附加IAA3.5mg/L、KT2mg/L、LH1 5 0mg/L的MS选择培养基上转化外植体的愈伤组织的诱导率可达 77.4%。     

抗氧化剂对橡胶树胚状体农杆菌侵染效果的影响

以体细胞胚为侵染受体，通过在共培养基添加抗氧化剂来研究抗氧化剂对橡胶树农杆菌侵染效率的影响。结果表明，参试的4种抗氧化剂中，GUS基因瞬时表达效率高低顺序为硝酸银＞二硫苏糖醇＞L-半胱氨酸＞硫代硫酸钠，共培养基中添加20 mg/L硝酸银的GUS瞬时表达率最高，染色总胚数最高达96.7%，显著高于对照76.7%。因此，抗氧化剂的应用有助于提高体细胞胚的农杆菌侵染效率。     

茶树农杆菌转化系统和基因枪转化系统的优化

在用农杆菌浸染前,将茶树外植体预培养在含有PVP(polyvinylpyrrolidone,16g/L)的预培养基上2-3d可提高转化频率。优化后的茶树基因枪转化体系,即制弹程序:60 mg/1ml钨粉悬浮液10 l中加入1.6 l质粒DNA(1 g/l),再分别加入0.1 mol/L的亚精胺4 l,2.5 mol/L 的CaCl2 15 l,最后定容至48 l;每次轰击上样量为8-10 l。基因枪转化后抗性筛选2个月,抗性愈伤组织存活率为5.0%~12.1%。