福建省羊支原体性肺炎分子流行病学研究

为了解福建羊支原体性肺炎和山羊传染性胸膜肺炎的分子流行情况,于2014-2016年从福建省6个市采集到疑似羊支原体性肺炎或山羊传染性胸膜肺炎病料61份,用支原体目引物、绵羊肺炎支原体、丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊肺炎亚种、山羊支原体山羊亚种、精氨酸支原体、莱氏无胆甾原体和无乳支原体的特异引物,通过PCR方法进行检测。挑取部分PCR阳性病料进行支原体分离和纯化,用16SrRNA基因通用引物进行克隆测序。结果显示61份样品中检出绵羊肺炎支原体45份(73.77%),检出丝状支原体山羊亚种4份(6.56%),检出莱氏无胆甾原体4份(6.56%),检出精氨酸支原体2份(3.28%)。该研究结果表明福建省发生的类传染性胸膜肺炎是以绵羊肺炎支原体为主的羊支原体性肺炎,为福建省羊支原体性肺炎的有效防治提供了科学依据。     

绵羊肺炎支原体的微生物学特性的研究

绵羊肺炎支原体是山羊和绵羊呼吸道中最常见的支原体,引起非进行性肺炎(CNP).2001～2002年对河北省的保定、邢台、邯郸、廊坊的6个种羊场的绵羊、山羊通过微量间接血凝试验(IHA)进行血清学检测,发现绵羊肺炎支原体的自然病例的阳性检出率为84.2%;并且从病羊的肺脏和鼻腔中分离出18株支原体,经过理化特性鉴定与生长抑制试验定型,证明其中12株为绵羊肺炎支原体,6株为精氨酸支原体.     

江苏泰州地区山羊传染性胸膜肺炎血清学调查

为了调查江苏省泰州市山羊传染性胸膜肺炎的流行情况,利用山羊支原体山羊肺炎亚种(Mccp)、丝状支原体山羊亚种(Mmc)、绵羊肺炎支原体(Movi)抗体检测间接血凝试剂盒对江苏省泰州各市(区)的1 157份山羊血清进行检测。结果发现,发病场山羊Mccp、Mmc血清平均阳性率为51.85%、39.81%;未发病场Mccp、Mmc血清平均阳性率为10.52%、5.84%,合计支原体感染阳性率为16.37%。由此可见,泰州市的山羊支原体性疫病的感染率较高,应该加强对该病的防控。     

绵羊肺炎支原体感染山羊病例的实验室诊断

为确诊铜仁地区山羊肺炎病例病原,开展了山羊肺炎的发病情况调查、临床症状与病理变化观察和血清抗体与病原核酸检测等实验室诊断。结果表明:该病以2～3月龄山羊最为易感,秋冬两季多发;临床症状多为呼吸系统症状,病理变化主要是纤维素性胸膜肺炎;绵羊肺炎支原体抗体阳性率为69.6%(78/112),病原核酸检出率为64.3%(9/14);丝状支原体山羊亚种抗体阳性率为8.0%(9/112),未检出其病原核酸。绵羊肺炎支原体是引起铜仁地区山羊支原体肺炎的主要病原。     

绵羊肺炎支原体P208蛋白质的分子特征分析及免疫原性

为了研究绵羊肺炎支原体P208蛋白质的结构及功能,本试验在对p208基因进行生物信息学分析的基础上,对其部分基因片段进行了克隆及原核表达,并采用Western-blot对其免疫原性进行分析。结果显示,p208基因与猪肺炎支原体黏附素p216基因、殊异支原体细胞表面蛋白基因以及絮状支原体P97/LPPS家族蛋白基因具有较高的同源性。重组P208蛋白以可溶性形式在大肠杆菌BL21(DE3)工程菌中成功得到表达;纯化的重组蛋白与山羊抗绵羊肺炎支原体全菌血清发生结合反应,表明P208蛋白质是绵羊肺炎支原体的免疫原之一。研究结果为进一步分析其功能及其应用提供了重要的依据。     

河西绒山羊DQB1基因核苷酸序列变异和跨种进化

DQB1基因在抗原呈递和免疫系统中发挥重要的作用。为了研究河西绒山羊DQB1基因的核苷酸序列变异和跨种进化,采用PCR-SSCP和测序技术,检测899只河西绒山羊DQB1基因的多态性,并用来自山羊、绵羊和黄牛DQB1基因的33条核苷酸序列构建NJ树。结果表明,河西绒山羊DQB1基因存在6个等位基因和34个核苷酸变异位点,变异位点数目占分析位点数目的15.53%。经与GenBank中山羊DQB1基因的核苷酸序列比对后发现,5个等位基因为首次发现。系统进化研究表明,山羊DQB1基因的所有核苷酸序列均聚在第1支中,部分核苷酸序列与绵羊、牛的序列相似性高于山羊之间的序列相似性。因此,河西绒山羊DQB1基因多态性丰富,在山羊、绵羊和牛中存在跨种多态性。     

A型产气荚膜梭菌青海分离株virR基因序列与蛋白结构分析

为了探究产气荚膜梭菌virR基因功能及其蛋白结构特点,提取了产气荚膜梭菌青海分离株的基因组,设计引物对virR基因进行PCR扩增和测序,使用生物软件对该基因进行序列分析和蛋白预测。结果显示,产气荚膜梭菌分离株virR基因长为759 bp,其编码252个氨基酸;分离株virR基因与参考菌株SM101、13、ATCC 13124、CP15、Del1、EHE-NE18、FORC 003、FORC 025、JIR4025、JP55、JP838、LLY N11、NCTC2837以及NCTC13170的virR基因核苷酸序列同源性和氨基酸同源性均在97%以上;二级结构预测显示分离株virR蛋白主要由α螺旋结构和β折叠组成;三级结构预测表明分离株virR蛋白有5种可信度较高的结构,蛋白功能位点预测表明分离株virR蛋白具有1个N-糖基化位点、1个cAMP和cGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点、3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点以及1个N-豆蔻酰化位点。     

合作猪IFN-ε基因克隆及生物信息学分析

旨在克隆合作猪干扰素ε(Interferon epsilon,IFN-ε)基因,并对其结构和编码蛋白进行生物信息学分析,为进一步研究合作猪IFN-ε生物学功能提供参考。根据GenBank上公布的猪IFN-ε基因序列(登录号:NM_001105310.1)设计引物,PCR扩增及测序获得合作猪IFN-ε基因完整编码区序列(Coding sequence,CDS),并对其进行生物信息学分析。结果显示,合作猪IFN-ε基因编码区长582bp,编码193个氨基酸。该基因编码区序列与杜洛克猪、人、小鼠、黑猩猩、狗、瘤牛、蒙古野马、山羊和绵羊的同源性分别为98.4%、77.7%、56.8%、78.2%、76.5%、87.0%、85.5%、85.0%和86.0%;系统进化树结果表明,合作猪与瘤牛、蒙古野马、绵羊、山羊亲缘关系较近。此外,在合作猪IFN-ε基因CDS上共发现3个碱基突变,均为错义突变。氨基酸序列分析表明,合作猪IFN-ε蛋白分子式为C_(1027)H_(1630)N_(278)O_(290)S_(10),理论分子质量为22.83ku,等电点(pI)为8.43,属于碱性蛋白;平均亲水系数为-0.240,属于亲水蛋白质;IFN-ε蛋白无跨膜结构,存在信号肽序列,属于分泌型蛋白;IFN-ε蛋白只包含1个超家族保守结构域,即IFab结构域。二级结构分析表明,该蛋白中α-螺旋、无规则卷曲、β-转角和延伸链所占比例分别为61.66%、30.05%、3.11%和5.18%。     

绵羊肺炎支原体延伸因子EF-P基因的克隆、表达及其重组蛋白免疫原性研究

为筛选绵羊肺炎支原体(MO)免疫相关蛋白,以MO新疆流行株基因组DNA为模板,通过PCR扩增其EF-P基因,测序后对其编码蛋白进行分子特征分析;用生物信息学软件预测其抗原表位集中区编码片段;进一步将该基因片段克隆入pET-32a(+)中,构建原核表达载体pET-32a(+)-EF-P,将pET-32a(+)-EF-P质粒转化至感受态细胞Escherichia coli BL21(DE3)中,IPTG诱导目的蛋白表达后,检测重组蛋白反应原性和免疫原性。SDS-PAGE结果显示,EF-P重组蛋白分子质量为29.5ku;Western blot结果显示,该重组蛋白可被MO阳性血清特异性识别,证实其具有良好的反应原性;小鼠免疫试验结果显示,该重组蛋白可诱导机体产生特异性抗体,采用正向间接血凝方法检测效价可达1∶64,提示其具有较强的免疫原性。     

绵羊肺炎支原体 p113 基因的序列分析及功能预测

采用多种软件对p113基因的相似性、跨膜结构、重复序列、信号肽、抗原表位等进行预测,并与同源序列进行比较分析.结果表明,p113基因是猪肺炎支原体黏附素基因p97的直系同源基因,并具有与P97蛋白R2区类似的特征性重复序列.通过综合比较分析,推测P113蛋白极可能是绵羊肺炎支原体的黏附素和膜表面免疫原.     

蜻蜓凤梨 AfERF113基因的克隆与表达特性

观赏凤梨是一类重要的热带花卉,但有关其生长发育调控分子机理的研究相对匮乏,这在一定程度上限制了新品种的开发和利用。以热带观赏花卉蜻蜓凤梨(Aechemia fasciata)为材料,在分析蜻蜓凤梨转录组数据的基础上,结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术克隆了APETALA2/Ethylene Response Element Binding Protein(AP2/EREBP)家族的1个转录因子编码序列,并将其命名为AfERF113。生物信息学分析表明,AfERF113 cDNA全长1 093bp,有1个864bp的开放阅读框(open reading frame,ORF),编码287个氨基酸。蛋白质理化性质分析表明,该蛋白分子质量为29.768 5ku,理论等电点为6.06,为一类不稳定的酸性亲水蛋白。亚细胞定位软件预测表明该蛋白定位于细胞核。结构域分析表明,该蛋白有1个保守的AP2结构域,分属ERF亚族的B-4类,与拟南芥中所有ERF蛋白的ERF113亲源关系最近。实时荧光定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)结果表明,AfERF113转录本在成熟株的根中表达量最高,且外源乙烯诱导后,AfERF113的表达量无论是在幼株还是在成株的各组织中均显著上调。研究结果证实,AfERF113响应了外源乙烯调控,为进一步研究AfERF113基因的功能及通过基因工程手段调控凤梨科植物生长发育提供了理论依据。     

长叶红砂咖啡酸-O-甲基转移酶（RtCOMT）基因的克隆及蛋白纯化

长叶红砂(Reaumuria trigyna)是内蒙古东阿拉善-西鄂尔多斯地区特有双子叶盐生小灌木,有极强的耐盐抗旱性,入药可以治疗湿疹、皮炎等疾病,具有一定的药用价值。咖啡酸-O-甲基转移酶(RtCOMT)是一个重要的甲基化酶,主要调控木质素合成过程中中间产物及木质素的变化。基于高通量测序结果,利用RT-PCR技术克隆获得长叶红砂COMT(RtCOMT)基因,构建RtCOMT原核表达载pET32a-RtCOMT,并将其转化大肠杆菌,重组阳性菌经IPTG诱导和SDS-PAGE电泳检测。结果表明:RtCOMT基因开放阅读框长1 023bp,编码340个氨基酸,推测蛋白分子质量37.24ku,理论等电点(pI)6.71,发现该基因在大肠杆菌中正常表达得到与预期大小一致的融合蛋白。采用Ni-IDA His-Bind亲和层析方法对RtCOMT重组蛋白进行纯化,体外获得目的蛋白。     

大豆疫霉生防菌解淀粉芽孢杆菌JDF3的鉴定

分离获得1株细菌JDF3，它能有效地抑制大豆疫霉菌丝的生长和孢子囊的形成。该菌株对细极链格孢、小麦全蚀病菌和西瓜炭疽病菌的抑制率高于70%。盆栽结果显示细菌JDF3对大豆疫病的防治率为70.7%。菌株形态特征、18项生理生化和gyrB基因测序结果鉴定菌株JDF3为解淀粉芽孢杆菌。     

核盘菌磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶编码基因的 预测与生物信息学分析

为了解磷酸泛酰巯基乙胺基转移酶(PPTases)在核盘菌生理代谢与致病过程中的作用,在核盘菌全基因组中寻找PPTases同源物。利用同源比对的方法,预测出核盘菌中PPTases基因,进而分析其编码蛋白的基本理化性质、疏水性、跨膜区、信号肽、亚细胞定位、二级、三级结构和保守结构域,并对PPTases编码氨基酸进行遗传进化分析。结果表明,在核盘菌全基因组中预测存在3个PPTases基因同源物,分别命名为:Ss-Ppt1、Ss-Ppt2和Ss-Ppt3。3个蛋白均为亲水性的非分泌型蛋白,在其二级和三级结构中α螺旋结构和无规则卷曲占主要部分,且三者都含有PPTases的保守结构域SCOP和(或)ACPS。     

东方蜜蜂微孢子虫KRAB-A蛋白的分子特性及系统进化分析

为明确KRAB-A的分子特性并进行东方蜜蜂微孢子虫与其他物种KRAB-A蛋白的系统进化分析，以期丰富KRAB-A的基本信息，使用NCBI数据库中的ORF工具预测KRAB-A蛋白的氨基酸序列。利用ExPASy网站上的相关软件预测和分析KRAB-A蛋白的亲水性、信号肽、磷酸化位点、二级结构及三级结构。通过Mega11.0软件采用邻接法构建基于KRAB-A蛋白的系统进化树。结果显示，KRAB-A基因可编码1 018个氨基酸；KRAB-A蛋白的分子式为C₅₃₁₄H₈₅₂₆N₁₅₂₂O₁₅₅₆S₄₃，分子量约为120.00 kDa，等电点为9.33，脂溶系数为79.20，亲水性为-0.75；KRAB-A含有41个丝氨酸、21个酪氨酸和16个苏氨酸磷酸化位点，1个H2C2模体，但不含有信号肽；KRAB-A含44.40%的α-螺旋，5.40%的β-转角，16.50%的延伸及33.69%的无规卷曲；蜜蜂微孢子虫的1个KRAB-A蛋白（NAPIS_ORF00138）与明球囊霉的2个KRAB-A蛋白（RCL2_000589200和RCL2_003114000）中存在与东方蜜蜂微孢子虫KRAB-A蛋白中相同的H2C2模体；东方蜜蜂微孢子虫KRAB-A（AAJ76_2380003054）与其姐妹种蜜蜂微孢子虫KRAB-A（NAPIS_ORF01514）聚为一支。研究结果明确了东方蜜蜂微孢子虫KRAB-A基因的分子特性，揭示KRAB-A可能是一种亲水性蛋白和胞内蛋白，东方蜜蜂微孢子虫KRAB-A（AAJ76_2380003054）与蜜蜂微孢子虫KRAB-A（NAPIS_ORF01514）间具有很高的保守性，为进一步的功能研究提供依据。     

苹果树腐烂病生防链霉菌A144的鉴定及其代谢产物的抑菌活性

旨在明确菌株A144的分类地位及其代谢产物的抑菌活性。基于形态学观察、生理生化特征以及16S rDNA序列分析将菌株A144鉴定为娄彻氏链霉菌(Streptomyces rochei)。采用含药平板法测定菌株A144的抑菌谱,结果表明其发酵滤液对苹果树腐烂病菌(Valsamali var.mali)、西瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、水稻恶苗病菌(Fusarium moniliforme)以及番茄早疫病菌(Alternaria solani)均有抑菌活性,抑菌率分别为68.15%±2.62%、28.90%±1.79%、33.77%±2.59%和11.43%±0.81%。以苹果树腐烂病菌为指示菌,从12种不同培养基中筛选出ISP2培养基为菌株A144的最佳发酵培养基,其发酵滤液的抑菌率达85.06%±0.86%。平板涂抹法和平板对扣法试验结果表明,其脂肽粗提物、蛋白粗提物和挥发性物质对苹果树腐烂病菌均有抑菌活性,抑菌率分别为81.44%±0.92%、47.92%±2.25%和22.87%±4.40%。可见,菌株A144在苹果树腐烂病的生物防治中具有良好的开发潜力。     

毛果杨Eukaryotic translation initiation factor 5A（eIF5A） 同源基因的生物信息学分析

为研究毛果杨eIF5A基因间的同源性及其进化关系,以毛果杨的eIF5A基因为研究对象,利用生物信息学软件及网站对其进行碱基分布、氨基酸组成、亲疏水性、保守区以及二级结构和三级结构的预测与分析,并与其他物种的eIF5A氨基酸序列进行多重比对与进化分析。结果表明,4个毛果杨eIF5A基因定位于不同染色体上,且都只含有5个外显子;研究还发现不同成员间氨基酸数目、氨基酸序列间的疏水性存在一定的差异;亚细胞定位分析表明,4个eIF5A蛋白均定位于细胞质上;二级结构预测结果显示,4个eIF5A氨基酸序列以无规则卷曲、扩展链和α-螺旋为主要组成部分,且4条氨基酸序列三维结构十分相似。上述结果均为毛果杨eIF5A基因家族的进一步功能分析提供了一定基础。     

防治植物枯、黄萎病的优良放线菌株筛选

采用平板对峙法、生长速率法和组织研磨法对实验室前期获得的放线菌进行测定,以期筛选出对植物枯、黄萎病生防作用较为全面的优良放线菌株。皿内抑菌试验结果表明,菌株SC11的抑菌能力最为突出,对3种靶标菌的平均抑制率接近80%,菌株153、SE2和F46也有较好的抑菌效果,平均抑菌率均超过50%;耐药性试验结果表明,菌株153、SC11耐药性较强,菌株F46在各杀菌剂存在条件下均不能生长;盆栽试验结果表明,菌株153、SC11在不同作物上均有较强的定殖能力,对供试作物种子萌发及植株生长有明显的促进作用。经室外盆栽模拟大田试验证明,153、SC11放线菌具有较好的防病促生效果。总体来看,菌株153和SC11的生防特性较全面,抗菌、耐药、易定殖并且能够促进作物生长,具有一定的应用潜力。     

马铃薯 StBI-1 基因鉴定及其抗疫霉菌的功能探索

Bax inhibitor 1(BI-1）是真核生物中高度保守的细胞死亡调节因子,在植物响应生物与非生物胁迫中扮演重要角色。为探究BI-1是否参与马铃薯响应疫霉菌侵染的免疫应答,首先以拟南芥AtBI-1蛋白序列为模板在马铃薯蛋白数据库中进行BLAST检索。通过比对分析及构建系统进化树,鉴定到与AtBI-1相似度为77.22%的马铃薯蛋白NP_001305552.1,将编码该蛋白的马铃薯基因命名为 StBI-1 ;蛋白结构预测分析表明, StBI-1 包含7个跨膜域和Bax inhibitor-1-like家族结构域。利用实时定量PCR分析 StBI-1 基因在马铃薯响应致病疫霉菌侵染过程中的表达模式,并借助农杆菌介导的烟草瞬时表达体系初步探索 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能。结果显示, StBI-1 响应致病疫霉菌侵染而诱导上调表达,尤其是在侵染后期。同时,过表达 StBI-1 可显著增强本氏烟草对寄生疫霉菌和致病疫霉菌的抗性。综合以上结果,本研究对马铃薯 BI-1基因进行鉴定分析及克隆,并初步揭示 StBI-1 抗疫霉菌的生物学功能,为挖掘马铃薯抗晚疫病新型基因资源及深入解析其抗病分子机理奠定了理论基础。