赤羽病ELISA检测方法的建立及试剂盒的研制

为了提高赤羽病的检测速度与效率,建立双抗夹心ELISA检测方法并进行试剂盒的研制。试验用纯化的AKV免疫BALB／c小鼠,细胞融合后用ELISA方法筛选出3株分泌抗AKV特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞（1D1、1812和2G1）,各杂交瘤细胞株均可以稳定地分泌特异性单克隆抗体,且其单克隆抗体亚型测定的结果均为IgG1、轻链均为k链。建立DAS--ELISA检测方法,确定抗AKV单克隆抗体1812株的最佳包被浓度为4μg／mL,多克隆抗体最佳稀释比为1：500,二抗最佳工作浓度为1：5000,阴性／阳性结果判定临界值为0．238,具有较好的特异性,检测极限为10^-4。表明该方法及试剂盒具有较强的实用价值。     

阪崎肠杆菌单克隆抗体制备及ELISA检测方法的建立

试验旨在制备抗阪崎肠杆菌的单克隆抗体,初步建立其ELISA检测方法。以灭活的阪崎肠杆菌全菌体为抗原免疫BALB/c小鼠,筛选血清效价高的小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,制备杂交瘤细胞,并用间接ELISA法选取阳性杂交瘤细胞,扩大培养后测定单克隆抗体的效价,进行特异性及抗体间的配对,使用mAb亚类检测试剂盒鉴定单克隆抗体的亚型,并利用得到的抗体建立双抗体夹心ELISA检测方法。本试验得到3株具有良好特异性能稳定分泌单克隆抗体的阳性细胞株5C10、2B6和Ab02,经两两配对,据阳性D_{450 nm}值及P/N值选择1：20000稀释的5C10作为包被抗体,1：40000稀释的Ab02作为酶标二抗,建立ELISA检测法,应用建立的方法与荧光定量PCR方法检测动物实验室保存的20份进出口送检奶粉样品,结果显示试验结果一致。本试验成功制备阪崎肠杆菌的单克隆抗体并建立其ELISA检测法,为大批量快速检测阪崎杆菌奠定了基础。     

小反刍兽疫病毒核蛋白单克隆抗体的制备与初步应用

针对小反刍兽疫病毒核蛋白制备特异性的单克隆抗体,并对其进行生物学特性鉴定和初步应用。以纯化的Bacmid-PPRV-N重组蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠的致敏脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞在PEG作用下融合,获得单克隆抗体,并通过染色体技术等方法研究其生物学特性,将其作为竞争单抗,Bacmid-PPRV-N重组蛋白作为检测抗原建立竞争ELISA检测方法。结果表明:经克隆和间接ELISA筛选,获得了2株能稳定分泌抗小反刍兽疫病毒N蛋白抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为5B11和3H10-3B8。生物学特性鉴定试验表明:5B11和3H10-3B8抗体类型和亚类均为IgG2b;5B11单抗腹水的效价达1∶819 200,3H10-3B8达1∶12 800;血清学试验证明2株单抗均能与Bacmid-PPRV-N重组蛋白抗原结合,具有高度的特异性;相加ELISA试验结果显示,5B11和3H10-3B8 2株单克隆抗体分别识别N蛋白上不同的抗原位点;2株杂交瘤细胞的染色体均为99～104。应用建立的c-ELISA检测方法对222份血清样品进行PPRV抗体的检测,与参考试剂盒比较得到98.20%的符合率。本研究获得了2株能稳定分泌抗PPRV N蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,以单抗5B11作为竞争抗体建立了PPRV的c-ELISA检测方法。     

地方株马驽巴贝斯虫Bc48截短体单克隆抗体的制备及应用

本研究旨在建立马驽巴贝斯虫抗体的快速、准确检测方法。以纯化的马驽巴贝斯虫Bc48基因片段的原核表达产物免疫6周龄雌性BALB/c小鼠制备单克隆抗体,并利用重组抗原与单克隆抗体建立间接竞争ELISA(CI-ELISA)方法检测马驽巴贝斯虫抗体。结果显示:制备出3株能稳定分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为1H2、7F4、11F4,通过对CI-ELISA条件筛选得出,抗原最佳包被浓度为0.19μg·mL~(-1),单克隆抗体11F4的最佳工作浓度为1∶3.2×10~5,通过检测30份马驽巴贝斯虫阴性血清及20份阳性血清,确定该检测方法临界值为45%;特异性试验发现,该CI-ELISA方法不与感染马泰勒虫病的阳性血清发生反应,具有特异性;用所建立的CI-ELISA检测临床血清90份,与标准c-ELISA试剂盒总符合率为92.2%、阳性符合率92.1%、阴性符合率94.1%。试验结果表明,该CI-ELISA方法特异性强,敏感性高,稳定性和重复性好,操作简便。基于单克隆抗体(11F4)与重组蛋白(HIS-Bc48)所建立的CI-ELISA特异性、重复性好,可为新疆马驽巴贝斯虫的检测、监控提供有效手段。     

肠炎沙门氏菌SEFA基因表达和间接ELISA检测方法的初步建立

为了给临床检测肠炎沙门氏菌的感染和血清学调查提供一种切实可行的方法,本研究根据肠炎沙门氏菌SEF14菌毛操纵子亚单位sefA基因序列设计一对引物,利用PCR技术从国内标准株CMCC(B)50336中扩增sefA基因,并按预定的阅读框插入表达载体pET22b+中,获得重组质粒pET-sefA,限制性内切酶结合琼脂糖凝胶电泳分析和序列测定结果表明,该序列大小为498bp,与已发表的sefA结构编码序列完全一致。重组质粒pETsefA转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)并能获得高效诱导表达,通过对菌体裂解上清液SDS-PAGE和western blot分析鉴定,该重组菌可以表达大小为15.2ku的可溶性重组蛋白rSEFA。纯化的rSEFA免疫小鼠所得高免血清以及标准株CMCC(B)50336感染小鼠后所获阳性血清,均能识别标准株肠炎沙门氏菌SEF14菌毛蛋白以及纯化的重组蛋白rSEFA,结果表明明体外表达的rSEFA蛋白有较好的免疫原性和反应原性。而基于rSEFA介导的间接ELISA有较好的特异性,对肠炎沙门氏菌特异性抗体检测有潜在的应用前景。     

A群牛轮状病毒胶体金免疫层析快速诊断方法的建立与初步应用

为建立A群牛轮状病毒(BRV)快速诊断方法,采用不连续蔗糖密度梯度离心法纯化的A群牛轮状病毒为抗原,利用淋巴细胞杂交瘤技术,制备了能够稳定分泌抗BRV抗体的5株杂交瘤细胞系,将其分别命名为1D5,1B5,1G9,1C7和3C10。用直径20 nm的胶体金颗粒标记提纯的BRV单克隆抗体1G9并制备金标垫,同时将BRV高免阳性血清与羊抗鼠IgG结合于硝酸纤维素膜上,组装BRV诊断试纸条;试验结果表明,该试纸条只能检测出BRV,且检测下限可达5.3μg/mL,其他对照病毒检测结果均为阴性;表明本试验建立的A群牛轮状病毒胶体金免疫层析技术(GICA)快速诊断方法特异性强,临床应用效果好。     

牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备及双抗夹心ELISA检测方法的建立

本试验以牛乳铁蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体,获得了3株稳定分泌乳铁蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3C6、3F8和4D3,最后用相对亲和力最强的3C6所产生的抗体作为包被抗体,用辣根过氧化物酶标记过的多克隆抗体作为酶标抗体,最终建立了用于检测牛乳汁中乳铁蛋白含量的双抗夹心ELISA检测方法,该法对牛乳铁蛋白最低检测限为4 ng/m L,最适检测范围为4²56 ng/m L。     

猪塞尼卡谷病毒单克隆抗体的制备及鉴定

[目的] 纯化猪塞尼卡谷病毒（Seneca Valley virus，SVV）SVV-CH-HB2016毒株，并制备其结构蛋白VP1、VP2和VP3的单克隆抗体。[方法] 以蔗糖密度梯度离心法纯化的SVV-CH-HB2016病毒颗粒作为抗原，免疫BALB/c小鼠，取脾细胞与骨髓瘤细胞（SP2/0）进行细胞融合。通过间接免疫荧光试验（IFA）结合间接ELISA筛选阳性细胞株，制备能特异性分泌针对结构蛋白的杂交瘤细胞株。采用Western blotting和IFA方法分别检测单克隆抗体与重组表达蛋白及天然结构蛋白的反应性，并对单克隆抗体的病毒中和保护效果进行测定。利用空斑试验和实时荧光定量PCR方法探究中和性单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株吸附过程的影响，最后用抗体相加试验来分析14株单克隆抗体的抗原表位。[结果] 在蔗糖密度梯度为5%~45%（W/V）时获得了纯度较好、浓度较高的SVV-CH-HB2016毒株结构蛋白，免疫小鼠血清抗体效价均达到了1：12 800，成功制备了17株能稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株。经验证14株单克隆抗体能与重组结构蛋白发生Western blotting反应，17株单克隆抗体能与病毒发生IFA作用；2G6、4A3和4C11 3株单克隆抗体对SVV-CH-HB2016毒株感染的BHK-21细胞具有明显中和保护作用，也能有效抑制SVV-CH-HB2016毒株对293T细胞的吸附。经分析发现，除1F5与2E1、4B8与4F11外，其余10株单克隆抗体分别针对不同抗原表位。[结论] 本研究初步建立了SVV的纯化方法，制备了17株特异性针对SVV-CH-HB2016毒株的单克隆抗体，为后期进一步开展SVV全病毒灭活疫苗的研发、ELISA检测方法的建立及保护性抗原表位的鉴定奠定了基础。     

检测伪狂犬病病毒双抗体夹心间接ELISA方法的建立与应用

以猪伪狂犬病病毒（PrV）Ea株特异性单克隆抗体576株为捕获抗体，纯化的抗PrV IgG为检测抗体，建立了检测PrV抗原的双抗体夹心ELISA方法。最佳反应条件为，单克隆抗体576株的包被浓度为12．2μg／mL，IgG的工作浓度为16．0μg／mL，对PrV的检测灵敏度达15．6ng（0．156μg／mL），与乙型脑炎病毒（JEV）、猪瘟病毒（HCV）、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）和猪流感病毒（SIV）等无交叉反应。批间和批内变异系数较小，分别为6．39％和4．1％。应用本方法对人工感染PrV的40日龄仔猪组织进行检测，肺和脑PrV抗原检出率最高，其次是脾、心、肝和肌肉。应用该方法和PrV对159份临床样本进行平行检测，发现二者的符合率可达到77．4％，比PCR敏感。实验结果表明：双抗体夹心间接ELISA方法具有敏感性高、特异性强和重复性好的特点，可广泛应用于动物组织中PrV的检测。     

肠炎沙门氏菌快速检测方法的建立

利用针对肠炎沙门氏菌主要O因子抗原O9的3－47－26单克隆抗体建立了快速检测肠炎沙门氏菌的竞争ELISA方法（C－ELISA）。将被检样品与McAb作用，竞争性抑制了McAb与包被肠炎沙门氏菌的结合，同时，也减弱了酶标二抗与McAb的结合，以降低底物反应的颜色，从而达到检测样品的目的。试验结果表明，本方法只选择性地与肠炎沙门氏菌反应，而与其它沙门氏菌均不反应。通过与国标法对210份样品检测结果比较表明，竞争ELISA方法的敏感性和特异性分别为94．4％和97．7％，从而为肠炎沙门氏菌的检测提供了一种快速、敏感、特异的检测方法。     

检测肠炎沙门氏菌ELISA方法的建立与应用研究

从已建立的抗沙门氏茵单抗中筛选出适用于肠炎沙门氏菌ELISA检验的3—47—26单抗．采用筛选强阳性杂交瘤细胞株制备了高效价的3—47—26单抗．改进用辣根过氧化物酶标记高效价单抗的方法，进行了HRP标记单抗的免疫生物学特性的鉴定。确定了包被浓度和酶标抗体的工作浓度：HRP-3—47—26为1：100；LPS的包被浓度为400ng／mL。试验中采用LPS与多聚赖氨酸的结合，解决了包被过程中的解吸附作用，增强了包被的稳定性，同时也减少了假阳性反应，优化了包被过程。建立了检测肠炎沙门氏菌的抗原竞争ELISA方法，利用样品中的LPS抑制酶标抗体与包被的LPS结合，以降低底物反应的颜色从而达到检测的目的。通过对210份肠炎沙门氏菌感染鸡泄殖腔棉拭子、羽毛和组织样品先筛选后鉴定的方法进行检测具有明显的抑制作用，通过与国标法对大量的样品检测结果比较表明，竞争ELISA方法的检出率为18．09％；检出阳性样品36份，国标法检出率为17．14％；两者符合率为97．14％。竞争ELISA敏感性和特异性分别为94．4％和97．7‰从而为肠炎沙门氏菌的检测提供了一种敏感、特异的检测方法。     

肠炎沙门氏菌SEF14菌毛研究进展

1 SEF14菌毛的发现 Feutrier等1986年首次在临床分离的一株人源肠炎沙门氏菌中发现一种菌毛(后来被称为SEF14菌毛),具有甘露糖敏感血凝反应(MSHA),形态上与肠杆菌科细菌的Ⅰ型菌毛难以分辨,蛋白质亚单位为14.4 kD,比伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛亚单位(22.1 kD)小,N-末端18个氨基酸残基与大肠杆菌和伤寒沙门氏菌Ⅰ型菌毛同源[1].Müller等在同一株人源肠炎沙门氏菌分离株上鉴定了甘露糖敏感且形态和生化特性上不同于之前报道的SEF14的典型Ⅰ型菌毛[2].1990年Tahorns等通过单克隆抗体(MAb)介导方法在肠炎沙门氏菌表面鉴定出这一菌毛样结构,蛋白质亚单位为14.3 kD,直径小于5 nm,没有凝集红细胞能力[3].     

布鲁氏菌外膜蛋白16单克隆抗体的制备及初步应用

旨在制备布鲁氏菌外膜蛋白16(OMP16)单克隆抗体，建立OMP16抗体竞争ELISA方法，为布病临床防控提供免疫血清学检测手段。本研究选取保守性高、免疫原性良好的布鲁氏菌OMP16,经原核表达获得携带GST或His标签的重组OMP16(rOMP16)。利用杂交瘤技术筛选可稳定分泌OMP16特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株，经亚型鉴定、细胞核型分析和抗体交叉反应性试验分析单抗性质。制备小鼠腹水并纯化，方阵滴定法建立布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法。结果表明，成功构建OMP16原核表达系统，经表达、纯化获得rGST-uOMP16和rHis-OMP16。筛选到1株遗传稳定的OMP16特异性杂交瘤细胞株，命名为B7;经鉴定，该抗体亚型为IgM-κ型，可识别目的蛋白，与标签蛋白无交叉反应。建立了布鲁氏菌OMP16抗体竞争ELISA方法，该方法与试管凝集试验检测结果相比总体符合率为90.53%,显示出良好的一致性。本研究有望为布鲁氏菌病的临床防控提供特异性高、敏感性好的免疫血清学检测方法。     

鸡传染性支气管炎病毒特异性单克隆抗体的制备与鉴定

为获得鸡传染性支气管炎病毒(Avian infectious bronchitis virus, IBV)N蛋白的单克隆抗体,通过原核表达IBV N蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得3株杂交瘤细胞株,命名为1#、18#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示：制备的3株单克隆抗体亚型均为IgG1,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与IBV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。本研究成功制备了IBV单克隆抗体,为进一步建立IBV检测方法和深入研究IBV的生物学特性奠定了基础。     

禽脑脊髓炎病毒单克隆抗体的制备、鉴定与初步应用

为获得禽脑脊髓炎病毒(Avian Encephalomyelitis virus,AEV)VP1蛋白的单克隆抗体,通过原核表达AEV VP1蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,并按常规方法制备杂交瘤细胞。经ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,经过3次亚克隆获得2株杂交瘤细胞株,命名为4#、19#,并进行了抗体亚类的鉴定、Western-blot和IFA检测。结果显示：制备的株单克隆抗体亚型分别为IgG2b、IgG2a,Western-blot和IFA试验结果表明单克隆抗体均能与AEV发生特异性反应而与其他禽病常见病毒均无交叉反应。运用建立的IFA对单抗进行了初步运用,在外源病毒检测方面与经典方法符合率高。本研究成功制备了AEV单克隆抗体,为进一步建立AEV检测方法和深入研究AEV的生物学特性奠定了基础。     

鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的原核表达和单克隆抗体制备

本试验旨在研制鸭疫里默氏杆菌GroEL蛋白的单克隆抗体。将鸭疫里默氏杆菌WJ4菌株的groEL基因进行原核表达,重组蛋白经过纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠。经过3次免疫后,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,用间接ELISA筛选阳性细胞株并进行3次亚克隆后制备小鼠腹水单克隆抗体。共获得2株稳定分泌鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为1G2B6和1G2F10。2株单克隆抗体均为IgG1亚类。腹水单克隆抗体ELISA效价达到1:102 400。Western blot检测结果表明2株单克隆抗体均能与鸭疫里默氏杆菌血清1、2和10型菌株发生特异性结合,而与禽致病性大肠杆菌、沙门氏菌和禽巴氏杆菌菌株无反应性。本研究成功制备了稳定性好、特异性强的鸭疫里默氏杆菌GroEL单克隆抗体,为进一步研制基于抗体检测鸭疫里默氏杆菌抗原的试剂盒奠定了基础。     

苦马豆素单克隆抗体的制备与鉴定

本试验采用苦马豆素（swainsonine,SW）人工抗原SW-OVA免疫接种BALB/c小鼠,通过杂交瘤技术建立了1株能稳定分泌SW单克隆抗体的杂交瘤细胞1F10,杂交瘤细胞染色体数目为45~50对。经间接ELISA检测,该株细胞培养上清中抗体效价为1：25 600,诱生腹水效价为1：80 000。单克隆抗体的亚型为IgG1,亲和力解离常数为1.14×10¹⁰,腹水抗体纯化后纯度可达98%,回收率80%,SDS-PAGE凝胶电泳可见单克隆抗体的轻链、重链分子质量分别为25和50 ku,Western blotting检测抗体能特异性的识别SW。其线性检测范围为4~128 μg/mL（R²=0.9969）,与BSA、明胶、多聚赖氨酸、α-甘露糖苷等无交叉反应。本试验制备的SW单克隆抗体为免疫学检测SW和免疫学防制家畜疯草中毒奠定基础。     

绵羊肺腺瘤病毒衣壳蛋白杂交瘤细胞系的建立

为了制备特异性的抗绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV) 内蒙株衣壳蛋白(CA)的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞系,以原核表达CA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞经杂交瘤技术进行融合,同时以表达蛋白作为包被抗原进行特异性ELISA检测,共筛选到6株阳性杂交瘤细胞株。经过3次亚克隆后,最终得到了5株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株;再利用CA真核表达蛋白以间接免疫荧光法,对此5株杂交瘤细胞进行进一步的特异性鉴定。结果显示,有3株具有特异性强荧光反应,也能检测到目的基因的表达产物。本试验获得了3株稳定分泌抗JSRV-NM株CA蛋白McAb的杂交瘤细胞系,为建立检测病原的特异性诊断方法、分析JSRV-NM株CA蛋白的功能及鉴定B细胞抗原表位等奠定基础。     

牛细小病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立

为建立一种快速检测牛细小病毒(BPV)的方法,本研究通过PCR扩增BPV VP2基因,构建pProHTa-BPV-VP2重组表达载体,转化后获得重组大肠杆菌,通过诱导表达获得VP2重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠(100μg/只),经细胞融合、克隆和筛选共获得了5株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为5G9、2B5、6A3、7E8和2B6。经鉴定,其分泌抗体亚型分别为IgG2a、IgG2b、IgM、IgM和IgA。间接免疫荧光结果显示,5株单克隆抗体(MAb)与BPV均可发生特异性反应。同时,将纯化后的BPV VP2重组蛋白免疫新西兰兔,制备兔抗BPV VP2多抗。利用制备的2B5作为检测抗体,BPV VP2多抗作为捕获抗体,初步建立检测BPV的双抗体夹心ELISA方法。该方法的特异性试验结果显示,除BPV外,与牛轮状病毒、猪伪狂犬病毒、猪传染性肠炎病毒、猪流行性腹泻病毒、牛病毒性腹泻病毒均不发生反应。敏感性试验结果显示,该方法对BPV最低检出量为3.125×10~(2.8)TCID50/mL。重复性试验结果显示,该方法批内、批间变异系数均小于10%。利用该方法对269份临床猪腹泻病料样品进行检测,检出BPV阳性样品14份,与PCR方法符合率达100%。综上,本研究利用抗BPV VP2蛋白的MAb和兔抗BPV VP2多抗建立了双抗体夹心ELISA方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,为BPV感染的快速诊断提供一种有效的检测方法,并为流行病学研究和疫病防控提供一种可靠的手段。     

抗山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞的构建及其单克隆抗体的制备

本研究旨在以纯化的山羊痘病毒P32蛋白为免疫原,构建杂交瘤细胞株,制备P32蛋白单克隆抗体。用纯化的P32蛋白免疫BALB/C小鼠后,按常规方法进行细胞融合,构建抗山羊痘病毒P32蛋白的杂交瘤细胞,制备P32蛋白单克隆抗体,获得4株能识别重组蛋白且特异性强无交叉反应的杂交瘤细胞株,腹水抗体效价均在105以上。山羊痘病毒P32蛋白杂交瘤细胞株的构建及单克隆抗体的制备为进一步开展检测方法研究提供了材料。