叶下珠抗新城疫病毒活性成分的筛选

[目的]筛选中草药叶下珠中的抗病毒活性成分,为开发治疗禽类病毒性疾病的新药提供条件。[方法]分别用75％乙醇（E）和纯净水（PF）煎煮叶下珠全草,再分别以石油醚（PE）、乙酸乙酯（EA）、正丁醇（BU）萃取其活性成分。将萃取物分别接种鸡胚成纤维细胞（CEF）,观察其对NDV病变的抑制作用;分别接种鸡胚,观察其对NDV血凝效价的影响;分别接种鸡,统计鸡群的死亡率,评价其免疫保护效果。[结果]E-PE、E-BU组萃取物均能明显抑制NDV在CEF细胞上的病变和显著抑制NDV在鸡胚内的增殖（P〈0.05）,以E-BU较好;E-PE、E-BU组的鸡只存活率均极显著高于利巴韦林对照组和生理盐水对照组（P〈0.01）,以E-PE组保护率较高。[结论]叶下珠水提取物效果较差;醇提取物E-PE组和E-BU组能有效抑制NDV病毒病变及其在鸡胚内增殖,对NDV的免疫保护效果较好。     

转化型桔梗皂甙抗IBDV、AIV和NDV的研究

为探索中药桔梗的主要活性成分桔梗总皂甙及其转化型桔梗皂甙的生物学活性和抗IBDV、A IV(H9)、NDV的作用,采用M TT法和间接免疫荧光检测试验,分别研究桔梗总皂甙与转化型桔梗皂甙的细胞毒性、对CEF生长和活性的影响以及抗病毒活性。结果表明:桔梗总皂甙和转化型桔梗皂甙对细胞毒性作用的IC50分别为128.74和53.48μg.mL-1,对CEF细胞生长和活性具有最大促进作用的浓度分别为80和25μg.mL-1。桔梗总皂甙阻断IBDV、A IV(H9)、NDV感染CEF细胞的作用分别为66.3%、55.4%和36.9%,抑制三者增殖的作用分别为69.4%、60.8%和26.2%;转化型桔梗皂甙阻断三者感染CEF细胞的作用分别为84.7%、63.5%和45.5%,抑制三者增殖的作用分别为77.8%、63.5%和41.9%,表明桔梗总皂甙经化学处理转变成转化型桔梗皂甙,可明显提高其生物学活性和抗病毒用。     

红景天多糖体外抑制IBDV感染CEF活性试验

[目的]探讨红景天多糖（Rhodiola sachalinensis polysaccaride,RSP）体外抑制鸡传染性法氏囊病毒（Infectious brusal disease virus,IBDV）感染鸡胚成纤维细胞（Chick Embryo Fibroblast,CEF）活性,为筛选抗IBDV活性物质奠定基础。[方法]采用四甲基偶氮唑盐（MTT）法检测RSP对IBDV感染CEF的抑制作用。[结果]RSP抑制IBDV感染CEF的半数抑制浓度（50%concentration of inhibition,IC50）为0.38 mg/ml,治疗指数（Treatment Index,TI）为4.34。[结论]红景天多糖体外有较显著的抑制IBDV感染CEF活性。     

芝芪菌质多糖对CEF的增殖和抵抗NDV感染的研究

[目的]明确芝芪菌质多糖是否是芝芪菌质提高动物免疫力的有效成分。[方法]用不同浓度的乙醇对芝芪菌质水提物进行分级沉淀,得到3种芝芪菌质多糖(GAP30、GAP60和GAP90),采用中性红染料吸收法,研究其对鸡胚成纤维细胞(CEF)增殖的影响及抵抗NDV感染的效果。[结果]GAP30、GAP60、GAP90的得率分别为0.37%、0.70%、1.04%,表明乙醇分级沉淀已将芝芪菌质中的多糖成分提取完全。GAP30、GAP60在浓度为1×10-1、1×10-2mg/ml时能显著促进CEF增殖,GAP90在浓度为1×10-3mg/ml时即能显著促进CEF增殖。GAP30、GAP60在浓度为1×10-2mg/ml时能显著抵抗NDV感染,GAP90在浓度为1×10-1、1×10-2mg/ml时能显著抵抗NDV感染。[结论]芝芪菌质多糖能不同程度地促进CEF增殖、抵抗NDV感染,以GAP90的效果最好。     

香椿叶提取物抗氧化活性研究

[目的]为了研究香椿叶提取物的抗氧化活性。[方法]用热水、95%乙醇及75%丙酮分别提取香椿叶中的抗氧化物质,比较了3种溶剂的提取物对O2-.、OH.、亚油酸、DPPH自由基的清除作用。[结果]香椿叶提取物对O2-.、OH.、DPPH自由基具有直接清除作用,对亚油酸脂质过氧化反应也有抑制作用。随着提取物浓度的增加,其清除、抑制作用也增强,并呈现明显的量效关系。95%乙醇的香椿叶提取物对O2-.、OH.、亚油酸、DPPH4种体系的抗氧化活性显著高于热水及75%丙酮的提取物(P<0.05)。[结论]香椿叶提取物有一定的抗氧化活性,其添加浓度与抗氧化活性呈正相关。95%乙醇提取香椿叶中的抗氧化物质效果较好。     

多重PCR同时检测鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG方法的建立和临床应用

通过建立针对鸡AIV、NDV、IBV、ILTV和MG的多重PCR鉴别诊断技术,并进行了特异性、敏感性试验和临床应用。结果表明：设计的5对引物对同一样品中的RNA（AIV、NDV、IBV）和DNA（ILTV、MG）进行多重PCR扩增,均同时得到5条片段大小与设计相符的特异性片段,即268bp（AIV）、321bp（NDV）、457bp（IBV）、662bp（ILTV）和732bp（MG）。说明该多重PCR技术具有较强特异性和较高敏感性,能检测出1pgAIV、1pgNDV、10pg IBV的RNA和1pg ILTV、10pgMG的DNA。对自然感染鸡临床样品检测的结果则证明,该技术在临床诊断方面具有广阔的应用前景。     

番石榴叶有机溶剂提取物清除过氧自由基能力及抑制酪氨酸酶活力研究

[目的]研究番石榴叶不同有机溶剂提取物对自由基清除能力以及对酪氨酸酶活力的抑制作用,可为番石榴叶在抗氧化抗衰老方面的应用奠定基础。[方法]采用乙醇、乙酸乙酯、石油醚和丙酮4种不同有机溶剂并采取超声、浸提及萃取的方法提取番石榴叶粗提物。采用邻苯三酚自氧化法和L-DOPA法分别测定粗提物对过氧自由基的清除作用和酪氨酸酶活性的抑制作用。[结果]乙醇、丙酮和乙酸乙酯番石榴叶提取物清除过氧自由基的IC_(50)值分别为47.1、35.5和21.2μg/mL;而丙酮提取物和乙酸乙酯提取物抑制酪氨酸酶活性的IC_(50)值分别为165.3和115.9μg/mL。[结论]番石榴叶提取物具有开发作为抗氧化抗衰老药物以及酪氨酸酶抑制剂的应用前景。     

中药复方抗鸡新城疫病毒作用研究

[目的]探讨中药复方抗鸡新城疫病毒（NDV）的作用机理,为临床合理使用抗病毒性药物提供科学的理论依据。[方法]以白花蛇舌草、金银花、黄芪和甘草组成中药复方,制备成中药复方流浸膏并配制成不同浓度梯度的药液;测定中药复方对鸡成纤维细胞（CEF）最大无毒浓度,并测定NDV在CEF上半数感染力（TCID50）;设中药复方不同浓度组,正常细胞和NDV感染细胞对照组,采用3种不同的作用方式作用于各组以检测中药复方抗NDV活性,采用四甲基偶氮唑蓝微量酶反应比色法（MTT法）测定OD值,以治疗指数为评价指标。[结果]中药复方对CEF的最大无毒浓度为2-6g/ml,NDV对CEF的TCID50为10-7.3;第①种作用方式中药复方的最小有效浓度是2-10g/ml,第②种作用方式为2-8g/ml,第③种作用方式为2-7g/ml。[结论]第①种作用方式对病毒的灭杀作用最强,第②种作用方式次之,第③种对病毒的灭杀作用最弱。表明中药复方不仅具有细胞外直接杀灭病毒作用,而且还具有抑制病毒吸附、穿入、复制和成熟的某一环节,为研究中药抗病毒的作用机理及临床应用提供了可靠的试验依据。     

PFT-α对鸡传染性喉气管炎病毒侵染宿主细胞的影响

[目的]研究抑癌基因p53小分子抑制剂PFT-α对ILTV侵染宿主细胞的影响。[方法]用PFT-α处理LMH(鸡肝癌细胞),通过结晶紫染色技术检测细胞感染ILTV 24 h后的细胞死亡情况,通过流式细胞术检测PFT-α对ILTV吸附、进入LMH细胞的影响,通过倒置荧光显微镜和高内涵细胞筛选系统检测PFT-α对ILTV在细胞间扩散的影响。[结果]结晶紫染色表明,PFT-α促进了ILTV感染后的细胞死亡,流式细胞术结果表明,PFT-α对ILTV吸附细胞没有影响,但是促进了ILTV进入细胞。同时,倒置荧光显微镜和高内涵细胞筛选系统检测结果表明,PFT-α对ILTV在细胞间扩散没有影响。[结论]研究初步检测了PFT-α对ILTV侵染LMH细胞过程的影响,为进一步研究ILTV与宿主互作过程提供了理论补充。     

核桃皮·马齿苋和辣蓼草乙醇提取物对玉米蚜触杀活性的比较

[目的]研究不同条件下核桃皮、马齿苋和辣蓼草乙醇提取物对玉米蚜触杀活性的影响。[方法]采用单因素试验和正交试验,研究不同浓度、温度和时间条件下核桃皮、马齿苋和辣蓼草乙醇提取物对玉米蚜校正死亡率的影响。[结果]马齿苋乙醇提取物对玉米蚜触杀活性校正死亡率为96.20%,核桃皮乙醇提取物对玉米蚜触杀活性校正死亡率为93.64%,辣蓼草乙醇提取物对玉米蚜触杀活性校正死亡率为67.99%。[结论]马齿苋乙醇提取物触杀活性最强,其次是核桃皮乙醇提取物,辣蓼草乙醇提取物对玉米蚜触杀活性较低。     

鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感三联灭活疫苗的制备及检验

[目的]制备鸡新城疫-传染性支气管炎-H9亚型禽流感[ND-IB-AI（H9亚型）]三联灭活疫苗。[方法]以NDV La Sota株、IBVM41株、AIV（H9亚型）WD株为毒种,分别接种鸡胚,制备NDV、IBV及AIV（H9亚型）抗原液;采用病毒超滤系统浓缩病毒抗原液,并用甲醛溶液进行灭活;将浓缩灭活后的3种抗原液按一定比例混合（1∶1∶1）,以司本80及吐温80为乳化剂,10号白油为佐剂,乳化制成ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗;对制备的疫苗进行无菌检验和物理性状观察。[结果]共制备了3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗实验室制品,经无菌检验为阴性,外观为乳白色,剂型为油包水型（W/O型）,粘度6.36.8 s,离心和37℃放置21 d均不分层。[结论]所制备3批ND-IB-AI（H9亚型）三联灭活疫苗均无细菌污染,其物理性状均能达标。     

鸡人工感染传染性喉气管炎病毒后气管病理组织学观察

[目的]观察鸡人工感染传染性喉气管炎病毒后气管病理组织学变化,为人工制造鸡传染性喉气管炎病例模型方法研究提供参考。[方法]以健康鸡为对照,应用滴鼻、点眼及气管滴入方式同时进行感染,每只鸡接种100 TCID50传染性喉气管炎病毒液0.5 m l,研究感染鸡的病理组织学变化。[结果]结果表明,按上述方法对鸡进行人工感染后,鸡能够产生所报道的病理变化。[结论]该研究的人工感染方式所引起发病的鸡可以作为患传染性喉气管炎鸡的模型。     

鸡传染性喉气管炎病毒PCR快速检测方法的建立

根据GenBank发表的传染性喉气管炎病毒(ILTV)TK基因序列(EF552578),设计合成了1对特异性引物,通过优化反应条件,成功地从ILTV疫苗株中扩增出329 bp特异性片段,而传染性支气管炎病毒、新城疫病毒及马立克病毒基因组均未扩增为出相应的片段。回收的PCR产物经EcoRⅠ酶切和测序鉴定,证实了该扩增片段的特异性。PCR检测ILTV DNA的最小检测量为30 pg。经临床初步应用表明,该方法的建立使传染性喉气管炎病毒的检测更为快速、简便、经济和实用。     

广谱型鸡传染性支气管炎病毒N蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

【目的】制备出广谱型鸡传染性支气管炎病毒(IBV)N蛋白单克隆抗体,为后续N蛋白保守区域表位鉴定及IBV通用型快速检测方法的建立打下基础。【方法】通过原核表达IBV广西优势血清型代表株GX-YL5的N蛋白,纯化后免疫BALB/c小鼠,选取血清效价在104以上的免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,经间接ELISA筛选后通过小鼠腹水诱生法制备单克隆抗体,采用Western blotting、IFA及间接ELISA等进行效价、亚型、反应特异性、交叉反应谱鉴定,并将制备获得的单克隆抗体应用于免疫组化检测,检测SPF鸡人工感染4株IBV代表变异株(GX-NN130048、GX-NN160421、GX-QZ171023和GX-QZ170728)后不同时段内气管和肾脏中的带毒情况。【结果】制备获得的单克隆抗体N2D5效价大于217,其亚型为IgG2b;Western blotting和IFA鉴定结果表明单克隆抗体N2D5只与IBV发生阳性反应,与新城疫病毒(NDV)、传染性喉气管炎(ILTV)、禽偏肺病毒(a MPV)、传染性法氏囊病(IBDV)、禽白血病病毒(ALV)及马立克氏病毒(MDV)的反应结果均呈阴性;单克隆抗体N2D5能与国内流行的多种基因型及广西目前流行的7种血清型IBV发生交叉反应,包括常用标准株、疫苗株和野毒株。将制备获得的单克隆抗体N2D5应用于免疫组化检测,结果发现在3株鸡源IBV代表性变异株及1株鸭源分离株人工感染SPF鸡后不同时段内的气管和肾脏中均能检测到病毒信号,进一步证明其广谱性。【结论】基于杂交瘤技术制备获得的IBV单克隆抗体N2D5属于IgG2b亚型,具有特异性高、反应谱广的特点,且与IBV的结合能力强,可作为特异性诊断抗体应用于IBV临床诊断及病毒分布规律研究。     

鸡传染性支气管炎病毒豫北株的分离与鉴定

[目的]分离与鉴定鸡传染性支气管炎病毒。[方法]从豫北某蛋鸡场疑似鸡传染性支气管炎的病鸡中采集气管分泌物、肾脏等组织分离病毒,进行血凝试验、NDV干扰试验,采用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对HN07的纤突蛋白S1基因进行扩增、克隆和序列测定。[结果]结果表明,分离到1株病毒,经连续鸡胚传代后,出现侏儒胚和蜷缩胚;血凝试验中,尿囊液无血凝性,而经胰酶处理后有血凝性;NDV干扰试验中,分离的尿囊液明显干扰NDV的增殖;病毒回归试验中病毒可引发接种鸡37.5%死亡;RT-PCR检测试验中,扩增到了约为1.7 kb的目的片段。DNAstar软件分析表明,测定基因具有IBVS1基因的共有分子特征,而且分离株HN07和HD株S1的同源性最高,核苷酸同源性为93.6%。[结论]分离的病毒株HN07为鸡传染性支气管炎病毒。     

RT- PCR检测鸡传染性支气管炎病毒方法的建立

根据Genbank中鸡传染性支气管炎病毒(IBV)核蛋白(NP)基因序列,设计了1对引物,通过鸡胚繁殖IBV,纯化鸡胚尿囊液中的IBV,提取病毒RNA,建立了检测传染性支气管炎病毒的RT-PCR方法。对IBV各毒株(M41,H52,H120,Aust-T以及野毒株等)检测,结果均为阳性,而对鸡的其他病毒性疾病病毒(IBDV,AIV,NDV)进行检测,结果均为阴性。初步结果表明所建立的RT-PCR技术可用于鸡传染性支气管炎病毒各血清型毒株的检测。     

几种中药在鸡胚上对鸡常见病毒的作用效果试验

为筛选抗病毒中药,提取桑叶、菌陈蒿、马齿苋、野菊花等4种中药的有效成分,并以其为实验药物,观察在10～12日龄鸡胚上对禽流感病毒(AIV)、新城疫病毒(NDV)和鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的作用效果.结果表明,在安全浓度范围内,几种中药对以上病毒均具有一定的阻断和抑制作用.其中,菌陈蒿全成分提取液对AIV和NDV的阻断和抑制作用较为突出.     

Characteristics of Monoclonal Antibody Against Infectious Bursal Disease Virus

Thirteen strains of monoclonal antibodies(McAbs) against infections bursal disease virus(IBDV) were obtained by using hydridoma technique and their characteristics were studied by double immunodiffusion,enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA),virus neutralization test(VNT) and Western-blotting assay (WBA).The result showed that nine of the thirteen McAbs belonged to IgG class and four of them belonged to IgM class.No crossreactions were detected betwween the McAbs and Newscastle disease virus (NDV),infectious bronchitis virus(IBV) and Marek‘s disease virus(MDV).All of McAbs were positively specific reactive with IBDV and five of them can neutralize viral infectivity.Their recognized epitopes of the neutralizing McAbs were all presented on VP2 of the IBDV.