农杆菌介导冷调节基因（Cbcor15a）遗传转化甘蔗体系的建立

【目的】利用农杆菌介导法,将外源冷调节基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织,建立快速、高效的甘蔗遗传转化体系,为培育具抗寒性甘蔗品种奠定基础。【方法】以新台糖22号（ROC22）为材料,通过对愈伤组织诱导、分化、生根等培养基进行优化,筛选出外源基因转化甘蔗的适合激素种类与用量、PPT用量、抗生素种类与用量;利用甘蔗转基因二元植物表达载体pCambia1300-Cbcor15a-bar,通过农杆菌介导法将目的基因Cbcor15a导入甘蔗愈伤组织。【结果】当农杆菌菌液OD600为0.4、侵染20 min时有利于愈伤组织分化;甘蔗愈伤组织诱导和分化培养阶段的最佳PPT为0.50mg/L。侵染后在共培养中添加500.00 mg/L抗生素Cef能有效抑制农杆菌,添加300.00 mg/L抗生素Cef能促进愈伤组织分化成苗,添加200.00 mg/L抗生素Cef能促进幼苗生根。MS培养基中添加低量NAA更有利于甘蔗愈伤组织的分化;在促进细胞分裂时KT的效果明显优于6-BA。MS培养基中添加5.00 mg/LNAA和70.00g/L蔗糖能有效促进分化苗生根。利用建立的遗传转化体系可获得286株转冷调节基因Cbcor15a的甘蔗转化植株;选取83株通过PPT抗性筛选后长势良好的转化植株进行阳性检测,其中有4株呈阳性。【结论】利用农杆菌介导的Cbcor15a基因转化甘蔗的遗传转化体系能成功将Cbcor15a基因整合到甘蔗基因组。     

番茄纳豆激酶基因转化的初步研究

纳豆激酶是一种具有强烈溶栓作用的蛋白激酶.本研究采用农杆菌介导法将质粒pCAMBIA-nk导入番茄外植体,通过潮霉素筛选获得大量抗性愈伤组织,并通过进一步分化、生根培养获得7株转基因植株.PCR检测表明外源纳豆激酶基因已在番茄转基因植株中表达.     

抗虫Cry2Ab基因的原核表达及玉米的遗传转化

玉米的产量深受虫害的影响,抗虫Cry2Ab基因对玉米黏虫抗性有重要意义。利用外源抗虫基因Cry2Ab构建到原核表达载体pET-22b中,对其进行SDS-PAGE检测和抗黏虫性鉴定。SDS-PAGE检测结果表明,Cry2Ab基因编码的杀虫蛋白在大肠杆菌BL21中得到正确的表达,条带大小为70.68 kD;抗黏虫性鉴定结果表明,当Cry2Ab蛋白浓度为100μg/g时,对东方黏虫致死率达到86.66%。同时构建pCAMBIA3301-Cry2Ab-Bar植物表达载体,通过农杆菌介导法将外源抗虫基因Cry2Ab转入玉米自交系GSH9901愈伤组织中,利用除草剂筛选及PCR技术检测得到T₁转基因阳性植株4株。获得的转基因抗虫玉米植株为抗虫转基因玉米的研发及抗虫玉米新种质的创制奠定了基础。     

白桦抗虫基因转化的初步研究

用根癌农杆菌介导法对白桦（Betula platyphylla)进行转化，获得了转化再生植株。卡那霉素抗性愈伤组织产生率达10%-22%，抗性不定枝的生根率达80%以上。经分子生物学检测，在卡那霉素抗性转化植株中，有34%检测出GUS活性，76.5%的卡那霉素抗性植株的Southern斑点杂交呈阳性反应。初步证明，抗虫基因已转入白桦中。     

双价抗虫基因共转化烟草叶绿体的研究

 分别构建苏云金芽孢杆菌晶体毒蛋白基因 [BtCryIA(C) ]和水稻巯基蛋白酶基因 (Oryzacystatin ,OC)叶绿体转化载体 ,其中Bt基因叶绿体转化载体以烟草叶绿体基因trnH psbA trnK为同源片段 ,以水稻 (OryzasativaL .)叶绿体 psbA基因启动子和终止子为调控基因 ;OC基因叶绿体表达载体以烟草叶绿体基因片段 psbA ORF5 12为同源片段 ,以烟草叶绿体 16S启动子和终止子为调控基因 ;两载体均以壮观霉素抗性基因 (aadA)为筛选基因。利用基因枪方法 ,共转化烟草叶片 ,获得壮观霉素抗性植株。经Southern、Western检测、表达蛋白活性测定证明 ,双价抗虫基因己整合到烟草叶绿体中并得到表达。转基因植株抗棉铃虫试验表明 ,转基因植株具有显著杀虫活性     

融合杀虫基因植物表达载体的构建及转基因烟草的获得

 构建了人工合成的 GFM Cry IA杀虫基因和经过修饰的 Cp T 基因的融合杀虫基因高效植物表达载体p GBIF4 ABC。通过农杆菌介导的叶盘法转化烟草 ,获得 4 2株卡那霉素抗性植株 ,经棉铃虫杀虫试验表明 ,3株表现高抗 ,14株表现中抗 ,2 5株感虫。对其中 7株烟草植株进行 PCR和 Southern印迹 ,4株烟草基因组中有融合杀虫基因的整合 ,为转基因植株。其中 2株的抗虫性为高抗 ,1株中抗 ,1株不抗     

双价抗虫转基因水稻的育成及初步鉴定

[目的]构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,为选育广谱、高抗转基因抗虫水稻提供技术参考.[方法]构建半夏凝集素基因(pta)和苏云金杆芽孢菌基因(Bf)两个抗虫基因的双价表达载体pCAMBIA 1301-Bt-pta,利用大肠杆菌DH5α和根癌农杆菌LBA4404转化水稻恢复系辐恢838,同时对转化植株进行GUS染色及PCR鉴定.[结果]以构建的双价植物表达载体pCAMBIA 1301-Bt-pta为模板,PCR扩增到pta基因的部分片段,大小为807 bp,且该载体经Hind Ⅲ酶切后,能得到15854 bp的中间载体pCAMBIA 1301-Bt片段和2046 bp的pta基因片段.对转化植株进行GUS染色,得到3株转基因阳性植株,经PCR鉴定结果显示外源基因已成功导入水稻.[结论]通过构建双价抗虫基因表达载体并转化水稻,成功获得的转基因植株可用于水稻抗虫转基因恢复系及组合的研究,以提高其抗病虫害能力.     

橡胶树乳管特异性启动子连接HbHMGR1基因的易碎胚性愈伤组织转化

[目的]以3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶1基因(HbHMGR1)乳管表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化橡胶树易碎胚性愈伤组织,获得抗性转基因材料,为研究HbHMGR1基因的乳管特异性表达及提高橡胶产量打下基础.[方法]用根癌农杆菌EHA105介导表达载体pCAMBIA2301-PHEV2.1-HbHMGR1转化橡胶树品种热研8-79花药易碎胚性愈伤组织,经卡那霉素筛选数月后,对抗性愈伤组织进行GUS染色和分子检测.[结果]经过对根癌农杆菌侵染的易碎愈伤组织进行4~6个月筛选,得到5个GUS检测呈阳性的抗性愈伤组织系;取其中的2号和11号抗性愈伤组织系进行PCR鉴定,均能扩增出与阳性对照相同的特异片段,uidA、NPTⅡ和PHEV2.1-HbHMGR1序列的目的片段大小分别为829、797和3592bp.2号和11号抗性愈伤组织系经反向PCR鉴定,发现2号抗性愈伤组织系未扩增出目的条带,而11号抗性愈伤组织系扩增获得一条约2000 bp的条带,包含T-DNA序列和一段未知的DNA序列,其中未知DNA序列是橡胶树品种热研8-79基因组的一段连续序列.[结论]将植物表达载体的T-DNA整合到抗性愈伤组织系基因组DNA中,可获得一个含35S-NPTⅡ-PHEV2.1-HbHMGR1-35S-uidA的转基因愈伤组织系.     

Hi-Ⅱ玉米的NGc抗虫基因遗传转化研究

为促进转基因抗虫玉米研究,通过农杆菌介导的玉米幼胚遗传转化法将目的基因转入玉米材料Hi-Ⅱ中,通过外植体侵染、共培养以及分化筛选,培养具有CryNGc抗虫基因的玉米植株,并研究外源基因在后代的遗传表达及抗性情况.结果表明:玉米幼胚大小在1.2～1.8mm时侵染效果最好,并成功获得了10株具有Cry NGc抗虫基因的阳性...     

超级稻DAD1基因正反义植物表达载体的构建及转化菊花的研究

将水稻DAD1基因插入Ti质粒,构建成该基因的正反义植物表达载体pWM-DAD1,pWM-antisense DAD1,转入根癌农杆菌LBA4404后,利用农杆菌介导的叶盘法转化菊花,经Hyg抗性筛选,并诱导愈伤组织和分化成苗,得到转基因菊花植株,通过PCR检测,从部分转基因植株中检测出预期的目的基因的存在.     

Trehalose Synthase Gene Transfer Mediated by Agrobacterium tumefaciens Enhances Resistance to Osmotic Stress in Sugarcane

Trehalose synthase gene (TSase) from Grifola frondosa was transferred into sugarcane (Sac-charum hybrid L. ) using Agrobacterium-mediated method to improve sugarcane drought-tolerance. The re-sults indicated that embryogenic callus of sugarcane was sensitive to A. tumefaciens EHA105 strain in thetransformation system employed. The high frequency PPT-resistant plants were obtained from transformatedwith 3 weeks callus after incubation, which reached 4.5 % on average. The transgenic plants were confirmedby PCR and Southern analysis. Some transgenic plants showed multiple phenotypic alterations and some plantsdemonstrated improvement tolerance to osmotic stress.     

AtNHX1提高烟草耐盐性的研究

[目的]探讨利用AtNHX1基因提高烟草耐盐性的效果。[方法]利用农杆菌侵染的方法对烟草的叶盘进行遗传转化,将拟南芥的液泡膜Na＋/H＋逆向转运蛋白基因AtNHX1成功地转入了烟草中,对获得的28株潮霉素抗性转基因植株中的6株进行了Southern检测,并用200mmol/LNaCl对转基因植株进行盐分胁迫与耐盐性鉴定。[结果]分子检测表明,AtNHX1已经整合到烟草的基因组中,并得到了表达。在盐分胁迫下,各转基因株系具有较高的光合速率和PSⅡ活性,光合速度和Fv/Fm值均显著高于野生型对照,株系T1、T5的SOD酶活分别是野生型的1.8和2.1倍,各转基因株系GR活性也均显著高于野生型,而MDA含量则低于野生型。[结论]转At-NHX1基因的各株系的耐盐性较野生型对照有了较大程度的提高。     

豌豆MAR的分离及其功能分析

从3个不同品种豌豆中分离获得3个具有MARs序列特征的DNA片段MMAR、DMAR、HMAR。根据GenBank同源性搜索结果,发现这些片段均为未注册的DNA序列。经转化烟草并测定其GUS活性,结果发现两侧顺式重复连接MAR对外源基因的表达具有明显的增强作用,MMAR、HMAR和DMAR均不同程度提高了GUS的表达,分别为载体对照植株的4.16、3.66和2.08倍,但不同转化体间表达水平差异仍比较明显。     

甘蔗根癌农杆菌介导转化海藻糖合酶基因获得抗渗透胁迫能力增强植株

 由双拷贝CaMV35S启动子驱动担子菌灰树花 (Grifolafrondosa)的海藻糖合酶基因 (TSase)构建植物表达载体 pBBBT ,通过三亲交配法将 pBBBT导入根癌农杆菌EHA10 5菌株 ,经根癌农杆菌介导转化甘蔗 (Saccha rumhybrid)栽培品种 ,以增强甘蔗的抗旱能力。结果表明 ,甘蔗胚性愈伤组织对EHA10 5菌株敏感 ,甘蔗外植体开始大量形成胚性愈伤组织时是感染的适宜时期 ,用膦丝菌素 (PPT)筛选 ,抗性植株发生频率平均为 4 .5 %。经PCR及dot Southern检测证明 ,TSase已经整合到甘蔗基因组中。部分转化植株根叶畸形、株型异常、生长缓慢。移栽到含PEG80 0 0 17.4 % (w/v)的MS培养基后 ,观察到转基因植株抗渗透胁迫能力增强     

蝴蝶兰转绿色荧光基因研究

[目的]研究蝴蝶兰转绿色荧光基因GFP导入技术。[方法]利用农杆菌菌株GV3101（质粒pBI121）,对绿色荧光蛋白基因GFP导入技术进行了研究。[结果]在20.0 mg/L卡那霉素（Kan）选择培养基上获得了蝴蝶兰原球茎分化和生根的健壮植株129株。经PCR检测,其中59株是转基因植株。[结论]该研究为蝴蝶兰分子育种提供了参考。     

农杆菌转化花粉愈伤组织获取纯合的转基因水稻植株

应用农杆菌介导法成功地将玉米转座子Ds导入粳稻(OryzasattvaI.subsp.japontca)中花11的花粉愈伤组织中,基因转化以对除草剂PPT有抗性的Bar基因和潮霉素抗性基因Hpt为选择标记.共获得了18个独立的转基因绿苗,其中单倍体11株,二倍体7株.转基因植株均抗除草剂BASTA.考查了二倍体植株种子后代(T1)对BASTA的抗性,7个株系的所有植株均抗BASTA,而未发生感抗分离,表明外源基因在转基因植株中是纯合的.PCR和Southernblotting的研究支持上述结果.对获得纯合转基因株系的各种方法做作了比较和讨论.     

核基质结合区与转基因植物的基因表达

核基质结合区(matrixattachmentregions,MARs)是真核细胞染色质中能与核基质结合的一段DNA序列.当MARs位于外源基因两侧时,能够使转基因植株高效、稳定表达,说明MARs是消除植物转基因沉默的一条可行途径.本文综述了MARs的研究进展,认为MARs的研究与利用对获得高效、稳定的转基因禾谷类作物具有重要的意义.     

NaCl胁迫对转甜菜碱醛脱氢酶基因美丽胡枝子生理的影响(英文)

[Objective] The aim of this study was to explore the effects of exogenous gene introduction on osmotic adjustment of plants.[Method] After pot culture with same time,the transgenic plants expressing betaine aldehyde dehydrogenase gene(BADH)and non-transgenic plants of Lespedeza formosa were treated with different concentrations(0,0.5%,1.0%,2.0%)of NaCl solution for 30 h and some physiological indices including proline,betaine,soluble sugar,malondialdehyde(MDA)contents and superoxide dismutase(SOD)activity were assayed.[Result] There was no significant difference on the indices mentioned above between transgenic plants and non-transgenic plants under the salt-free treatment.With the increase of NaCl concentration,the transgenic plants accumulated much higher level of proline,betaine,soluble sugar and lower level of MDA than non-transgenic plants.But the differences of SOD activity increase degrees between transgenic and non-transgenic plants were not significant.Performances of the three transgenic lines were different to some extent.[Conclusion] The introduction of exogenous BADH gene enhanced the osmotic adjustment ability of L.formosa,furthermore;different transgenic lines performed differently.     

芥菜cry2基因RNAi载体的构建与遗传转化研究

[目的]研究芥菜Cry2基因RNAi载体的构建与遗传转化,为后期对两者关系的进一步研究提供参考。[方法]在克隆芥菜类茎瘤芥Cry2基因的基础上,构建该基因的RNAi载体,并导入根瘤农杆菌GV3103,获得工程菌株后,通过农杆菌浸染茎瘤芥子叶外植体进行植物体转化,并验证转化结果。[结果]成功构建了茎瘤芥Cry2基因的RNAi载体,并建立了茎瘤芥遗传转化体系,获得了转基因植株。[结论]茎瘤芥Cry2 RNAi的构建及遗传转化体系的建立为后期深入研究茎瘤芥熟期相关基因的功能及基因工程应用奠定了基础。