SLT-IIeA基因在原核系统中的克隆与表达及其鉴定

PCR扩增并克隆在pUC18质粒中的类志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）A亚单位基因片段切出，按预定阅读框架插入到原核性表达载体pGEX-6p-1的谷胱甘肽S－转移酶（GST）基因的下游，获得重组质粒ppGEX-A。重组粒导入大肠杆菌BL21，用IPTG进行诱导表达，通过对重组大肠杆菌的菌体裂解物的SDS－PAGE电泳分析及Western-blot鉴定，表明重组菌能大量表达融合蛋白形成的SLT-ⅡeA，即SLT-ⅡeA蛋白与谷胱甘肽转移酶相连组成的蛋白质。本实验的研究结果，为进一步研究SLT-Ⅱe的生物学特性及研制仔猪水肿病业单位苗提供了有效的生物材料。     

猪水肿病大肠杆菌基因突变株的构建

应用定点突变技术将野生型猪水肿病大肠杆菌(O_(139))主要毒力基因SLT-Ⅱe A亚基中第167位谷氨酸和第170位精氨酸,分别突变为谷氨酰胺(E1670)和亮氨酸(R170L)后,获得突变基因SLT-Ⅱe~*。通过同源重组,将野生菌中的毒力基因SLT-Ⅱe替换为SLT-Ⅱe~*,构建了一株毒力基因突变株(SLT-Ⅱe~*)。实验结果显示,该突变菌株对Vero细胞的毒性是野生菌毒性的1/500。     

志贺样毒素Ⅱ型变异体对大鼠肠黏膜微血管内皮细胞分泌IL-8 IL-6和PGI2的影响

志贺样毒素Ⅱ型变异体[1](SLT-Ⅱe)是猪水肿病大肠杆菌导致仔猪形成水肿病的主要致病因子.研究证明,SLT-Ⅱe能损伤小肠上皮细胞和血管内皮细胞[2],引起细胞分泌功能障碍,进而导致微血管舒缩和通透性发生变化,最终形成猪水肿病.本试验通过研究SLT-Ⅱe作用大鼠肠黏膜微血管内皮细胞(MVECs)后,其培养上清液中IL-8、IL-6和PGI2的浓度变化,以期从SLT-Ⅱe影响微血管内皮细胞分泌功能方面,探讨SLT-Ⅱe对大鼠肠黏膜MVECs的损伤机制.     

表面表达猪水肿病毒素保护性抗原重组大肠杆菌激发仔猪黏膜免疫反应的研究

以菌体表面表达猪水肿病毒素保护性抗原(SLT-ⅡeB)的重组大肠杆菌(PZBSPAX),对1日龄、15日龄仔猪口服免疫,用ELISA法对口服免疫后10 d、15 d、30 d仔猪肠黏液中特异性SIgA和血清中特异性IgA、IgG进行检测,结果显示口服免疫猪能产生较高水平的肠黏液特异性SIgA及血清特异性IgA和IgG,证明该重组菌能有效激发肠道黏膜免疫反应,同时也能激发全身性体液免疫反应.     

致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86SLT-ⅡeA基因的克隆与表达

为了克隆与表达致猪水肿病大肠杆菌标准菌株F107/86类志贺毒素Ⅱ型变异体A亚单位(SLT-ⅡeA)基因,试验以F107/86为模板,PCR扩增去掉信号肽的935 bp的SLT-ⅡeA亚单位基因,将其克隆到原核表达载体pGEX-6p-1的EcoRⅠ与SalⅠ位点之间并测序,在大肠杆菌中经IPTG诱导表达,并对表达产物进行SDS-PAGE和Western-blot分析。结果表明:对筛选出的阳性重组质粒pGEX-SLT-ⅡeA-4测序并与GenBank登录的M36727序列比较,证明插入序列及读码框正确;表达产物GST-SLT-ⅡeA经SDS-PAGE分析其大小为58.3 ku;Western-blot检测证实表达产物具有良好的免疫原性。说明试验所构建的原核表达载体可大量表达抗原蛋白。     

鹅细小病毒单克隆抗体的制备与鉴定

为制备鹅细小病毒（goose parvovirus,GPV）单克隆抗体（monoclonal antibody,McAb）,利用浓缩的GPV免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术,经间接ELISA方法筛选和有限稀释法克隆后获得一株抗GPV单克隆抗体杂交瘤细胞株4B4。经鉴定,其McAb的重链为IgG1亚型,轻链为κ链。ELISA和Western blotting试验结果表明,获得的4B4株McAb可特异性的识别GPV和GPV-VP3蛋白,表明4B4株McAb识别的表位可能位于GPV VP3蛋白的保守区域。为进一步鉴定GPV的表位和GPV诊断试剂的研究奠定了基础。     

SLT-Ⅱe对PIMVECs分泌炎症反应相关细胞因子的影响

本试验旨在探究大肠杆菌志贺样毒素Ⅱ型变异体（SLT-Ⅱe）处理后,猪小肠微血管内皮细胞（PIMVECs）分泌的肿瘤坏死因子α（TNF-ɑ）、P选择素（P-selectin）、一氧化氮（NO）、细胞间黏附分子1（ICAM-1）和内皮素（ET）水平的变化。采用超速离心法提取SLT-Ⅱe,采用BCA试剂盒测定其质量浓度,使用SDS-PAGE及Western blotting验证蛋白纯度;用WST-1法从0.1、0.5、1、5、10 μg/mL SLT-Ⅱe和0、2、4、8、12、24 h中筛选出SLT-Ⅱe对PIMVECs最佳作用浓度与时间;ELISA法检测对照组（0 μg/mL SLT-Ⅱe）和试验组（1 μg/mL SLT-Ⅱe）细胞上清中TNF-ɑ、P-selectin、NO、ICAM-1和ET含量的变化。结果表明：所提蛋白为SLT-Ⅱe,蛋白含量为721.75 μg/mL;1 μg/mL的SLT-Ⅱe作用8 h后可极显著降低PIMVECs的活性（P<0.01）;1 μg/mL的SLT-Ⅱe作用9和12 h时PIMVECs的TNF-ɑ分泌量显著升高（P<0.05）,NO/ET的值显著高于对照组（P<0.05）,作用6、9、12 h时P-selectin的含量显著升高（P<0.05）,作用12 h时的ICAM-1分泌量显著升高（P<0.05）。综上所述,SLT-Ⅱe浓度为1 μg/mL时可以诱导PIMVECs分泌的TNF-ɑ、P-selectin、ICAM-1以及NO/ET上升,为研究仔猪水肿病发病机制提供参考。     

2拷贝SLT-ⅡvB在猪霍乱沙门氏菌C500crp~-/asd~-缺失株中的表达及小鼠免疫试验

为研制仔猪副伤寒—猪水肿病新型二联疫苗,从pMDSLT-Ⅱ中扩增去信号肽后的SLT-ⅡvB基因,将2拷贝SLT-ⅡvB与pYA3493连接。阳性质粒pYA2B电转化C500crp-/asd-缺失株,进行SDS-PAGE电泳和Western blotting,重组菌C500crp-/asd-(pYA2B)口服免疫小鼠,腹腔攻10 LD50的猪霍乱沙门氏菌强毒C78-1和2 LD50的猪水肿大肠杆菌强毒ED3株,计算攻毒保护率。结果显示,2 SLT-ⅡvB在C500crp-/asd-缺失株中获得了表达。C500crp-/asd-(pYA2B)免疫组对ED3的攻击能提供60%保护,而对照组不能提供任何保护。2组对C78-1攻击均提供100%保护,为研制仔猪副伤寒—猪水肿病二联疫苗及进一步提高免疫效果提供依据。     

施马伦贝格病毒核衣壳蛋白的表达及单克隆抗体制备

为表达与纯化具有天然构象的施马伦贝格病毒(Schmallenberg virus,SBV)核衣壳(N)蛋白,并制备其单抗(McAb),本研究在SBV-N基因的N端加入6个组氨酸(6×His)标签后,将其克隆至杆状病毒表达载体pFastBac~(TM)1中,构建重组供体质粒pFastBac-His-SBV-N。将pFastBac-His-SBV-N转化DH10Bac E.coli,通过蓝白斑筛选获得重组杆粒rBacmid-His-SBV-N。将rBacmid-His-SBV-N转染Sf9昆虫细胞制备表达His-SBV-N融合蛋白的重组杆状病毒,借助Ni-NTA琼脂糖纯化重组杆状病毒感染Sf9细胞中的His-SBV-N蛋白。以纯化的HisSBV-N免疫BALB/c小鼠制备McAb,利用ELISA叠加试验检测McAb抗原识别位点的异同,并采用高碘酸钠法对识别不同抗原表位的McAb进行辣根过氧化物酶(HRP)标记。最终获得了4株识别不同抗原表位的McAb(2A11、2E1、4H11和6E12)并进行了HRP标记;亚型鉴定表明,2A11为IgG1亚型,2E1、4H11和6E12均为IgG2b亚型;间接免疫荧光试验证实,4株McAb均能够识别稳定表达SBV-N蛋白的BHK-21细胞系;Western blot进一步表明,HRP标记的4株McAb均与His-SBV-N蛋白发生特异性反应。His-SBV-N融合蛋白及其McAb的成功制备,为施马伦贝格病血清学检测方法的建立提供了良好的生物材料。     

高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的克隆表达及其单克隆抗体的制备方法

研制高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2基因的克隆表达及其特异性单克隆抗体(Mabs)的制备方法.本研究以HP-PRRSV为研究对象,参照已发表的PRRSV基因组序列,设计一对PCR引物,并在其上下游分别添加BamHI和SalI酶切位点,获得的PCR产物用BamHI和SalI酶切后与经同样处理的pET-28a原核表达载体质粒连接,转化DH5a感受态细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后,转化至E.coli BL21(DE3)中,经IPTG于37℃诱导表达不同时间点后,取细菌菌体用SDS-PAGE分析.结果表明,Nsp2在大肠杆菌中得到表达.经包涵体的提取,用猪抗PRRSV血清抗体进行Western-bolt鉴定,结果表明,融合表达的pET28a-dNsp2蛋白能被PRRSV阳性血清特异性识别.取纯化的pET28a-Nsp2蛋白按每只100μg的剂量与等量弗氏完全佐剂进行乳化,并作为免疫原采取常规皮下多点注射免疫6-8周龄BALB/c小鼠.取其脾细胞与SP2/0的骨髓瘤细胞融合,经间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选,采用有限稀释法进行克隆.经过3次克隆后获得了一株抗PRRSV-Nsp2蛋白的单克隆抗体的杂交瘤细胞,命名为A2F1.Western-blot和间接免疫荧光结果显示这株单克隆抗体株能与Nsp2蛋白和PRRSV JXA1株发生特异性反应,而不与PRRSV CH1A株发生反应,证明获得的McAb为针对PRRSV JXA1株的McAb.抗体亚类鉴定结果表明,重链为IgG1型,轻链为κ链.采用间接ELISA法测得单抗的细胞培养上清抗体效价为1:800,腹水效价分别为1:12800.这株单抗的获得为进一步研究pET28a-Nsp2基因的功能及建立准确快速PRRSV的诊断方法提供了强有力的手段.     

乳牛L-选择素单克隆抗体的制备与亚类鉴定

以乳牛L-选择素为免疫抗原免疫BALB／c小鼠1只，相隔14d进行3次免疫，抗原用量每次30big，首次免疫后第116d进行尾静脉加强免疫，抗原用量10μg。免疫脾细胞与骨髓瘤细胞融合后接种12块96孔板。以L-选择素包被酶标板，间接ELISA检测阳性孔，有限稀释法克隆阳性孔，筛选出6株杂交瘤细胞。小鼠腹腔注射杂交瘤细胞株制备McAb，并对其分别进行Ig亚类测定。结果，6株杂交瘤细胞7810、10F6、10E2、5C6、12G7和llA3的Ig亚类分别是IgG2a、IgG2a、IgG2b、IgG1、IgG1和IgG1。     

一株混合O血清型猪水肿病大肠杆菌的分离与鉴定

从具有典型临床症状和病理剖检变化的病死猪肠系膜淋巴结中分离到的1株革兰阴性细菌,通过菌体形态观察,染色、生化试验、SLT-Ⅱ e基因检测、O血清型鉴定、动物试验,其结果证明分离菌为O26、O139、O142混合血清型,产SLT-Ⅱ e大肠埃希氏杆菌.SLT-Ⅱ e基因序列与GenBank上发表的参考序列(序列号为AY368993)的同源性达100%.用粗提的毒素经腹腔注射小鼠后引起小鼠后肢麻痹、死亡和胃肠水肿.     

麋鹿重组朊蛋白单克隆抗体的制备及初步鉴定

为研制鹿慢性消耗性疾病(chronic wasting disease,CWD)单克隆抗体,本研究以原核表达后经纯化的麋鹿重组成熟朊蛋白(PrP^c)为免疫原免疫PrP^c基因敲除小鼠(PrP^c-null mice)。两次加强免疫后,利用淋巴细胞杂交瘤技术,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合,间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞,采用3次有限稀释法实现杂交瘤细胞的亚克隆,筛选出5株能稳定分泌针对麋鹿重组成熟朊蛋白特异性单克隆杭体(McAbs)的杂交瘤细胞株5A5、3B2、6D12、5E3、1F5,其腹水ELISA效价均达到1∶10000以上。经鉴定,5株单抗均为IgG抗体,5A5、6D12、5E3株为IgG1亚类,3B2、1F5株为IgG2a亚类。Western blotting鉴定结果表明,获得的McAbs均能特异性识别麋鹿重组成熟朊蛋白和健康麋鹿脑组织匀浆中的PrP^c。本研究制备了CWD腹水McAbs,同时也为CWD的研究及其诊断方法的建立奠定了基础。     

志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位单抗的制备

将表达志贺样毒素Ⅱ型变异体A亚单位重组蛋白的菌株ppSLT-ⅡeA在含氨苄青霉素的2×YTA培养基中培养,至对数生长期时加入IPTG诱导,诱导的重组菌超声波裂解后,经聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其已表达重组蛋白.用谷胱苷肽活化的Sepharose4B亲和层析柱纯化重组蛋白,测定纯化蛋白的浓度,免疫BALB/c小鼠,细胞融合后经ELISA检测,得到一株阳性杂交瘤细胞,命名为A2-D3,制备的单抗腹水ELISA效价为24log2,免疫印迹结果表明此单抗仅与重组蛋白反应,而与载体蛋白不反应.利用此单抗检测13株水肿病菌株,发现均产志贺样毒素Ⅱ型变异体.     

绵羊肺腺瘤病毒衣壳蛋白杂交瘤细胞系的建立

为了制备特异性的抗绵羊肺腺瘤病毒(jaagsiekte sheep retrovirus,JSRV) 内蒙株衣壳蛋白(CA)的单克隆抗体(McAb)杂交瘤细胞系,以原核表达CA蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,经4次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞经杂交瘤技术进行融合,同时以表达蛋白作为包被抗原进行特异性ELISA检测,共筛选到6株阳性杂交瘤细胞株。经过3次亚克隆后,最终得到了5株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株;再利用CA真核表达蛋白以间接免疫荧光法,对此5株杂交瘤细胞进行进一步的特异性鉴定。结果显示,有3株具有特异性强荧光反应,也能检测到目的基因的表达产物。本试验获得了3株稳定分泌抗JSRV-NM株CA蛋白McAb的杂交瘤细胞系,为建立检测病原的特异性诊断方法、分析JSRV-NM株CA蛋白的功能及鉴定B细胞抗原表位等奠定基础。     

猪繁殖与呼吸综合征病毒CH-1a株核衣壳蛋白单克隆抗体的制备

本研究是利用我国PRRS病毒分离株CH-1a株浓缩的病毒抗原免疫BALB/c小鼠,经3次免疫后,取脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合,同时以PRRS病毒作为抗原进行间接ELISA检测,共筛选到22个阳性细胞株.分别经过3轮单克隆后,最终得到了16株能稳定分泌抗体的单细胞克隆株.利用IDEXX-ELISA检测试剂盒和IFA试验对16株单克隆抗体进行鉴定,结果证实所获得的16株细胞分泌的抗体都是针对PRRSV的特异性抗体.将此16株单克隆抗体分别与用原核系统表达的PRRSV N蛋白、rtM和rtGP5蛋白进行特异性ELISA检测试验,结果表明16株单克隆抗体都仅识别表达的N蛋白,而与其它两种蛋白不发生反应,说明所获得的16株单克隆抗体均为抗PRRSV核衣壳蛋白的.单克隆抗体亚型鉴定试剂盒的鉴定结果显示,除01MAb为IgG2b、N1H11为IgG2a外,其余的单克隆抗体均为IgG1,而且所有单克隆抗体的轻链均为к链.至此证实我们获得了16株PRRV N蛋白单克隆抗体,这将为今后建立更为灵敏的检测PRRS病原的特异性诊断方法、分析PRRSV核衣壳蛋白的功能及鉴定B细胞抗原表位奠定重要基础.     

致猪水肿病大肠杆菌毒力因子二重PCR检测方法的建立及应用

本试验分别针对志贺样毒素Ⅱ型变异体(SLT-Ⅱe)B亚基和F18ab茼毛fedA亚基保守序列设计2对引物,扩增长度分别为230 bp和510 bp,通过条件优化,建立了一种快速鉴定致猪水肿病大肠杆菌同时确定其致病因子的二重聚合酶链式反应(PCR)检测方法,对阳性扩增产物测序,结果都有很高的保守性.特异性试验和灵敏性试验表明:与其他6种猪常见致病菌(产毒多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、波氏杆菌、副猪嗜血杆菌、沙门菌和链球菌)无交叉反应,菌体直接扩增法最低检出量为101cfu(D600为0.002).通过该二重PCR检测方法对2004-2006年自猪肺、脑组织中分离的216株大肠杆菌进行鉴定,得到6株致猪水肿病大肠杆菌,其中3株既具有菌毛又产水肿毒素,另外3株仅产水肿毒素;菌毛阳性菌株占毒素阳性菌株的50%.     

类志贺毒素Ⅱ型变异体A亚单位基因缺失株的构建及表达

采用PCR方法分别对类志贺氏菌毒素A亚单位基因第298～805序列、818～1201序列进行了扩增，使其第806～817序列的碱基(编码167～l70位氨基酸)缺失，并将两片段连接后克隆至质粒载体pGEX-6P-1中，获得了含有重组质粒pGEX-Ade。的重组大肠埃希氏菌；经SDS-PAGE以及使用特异性抗SLT-Ⅱ eA单克隆抗体的Western-blotting，证明该重组大肠埃希氏菌在IPTG诱导条件下可表达SLT-Ⅱ eA。     

产气荚膜梭菌ε毒素原核表达及其单克隆抗体的制备

以大肠杆菌表达的D型产气荚膜梭菌点突变的ε毒素蛋白作为免疫原,免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体,经过ELISA方法筛选,获得2株稳定分泌抗ε毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株2C3-D7和5H6-B8,单抗均为IgG1型。Western blot鉴定结果显示:2株单抗均能与重组ε毒素蛋白及D型产气荚膜梭菌ε毒素蛋白发生特异性结合。本试验为进一步研究产气荚膜梭菌ε毒素的生物学特性及建立产气荚膜梭菌的快速检测方法提供了基础。     

猪水肿病的成因及发病机制

猪水肿病(ED)由肠毒血症大肠杆菌(ETEEC)引起.在母源抗体IgA下降、饲料中蛋白质含量过高、缺硒和过食等诱因的刺激下,猪肠道内大肠杆菌迅速繁殖,依靠定植因子粘附到肠粘膜细胞上,并产生SLT-Ⅱe毒素.SLT-Ⅱe是一种热不稳定蛋白质,它能与血管内皮细胞和平滑肌细胞上的受体结合,阻碍细胞内蛋白质合成,造成血管损害而致水肿.