拟南芥抗病基因FLS2和LysM的亚克隆及其在番茄中的表达

 从拟南芥JAtYTAC基因组文库中完整地亚克隆了FLS2和LysM 两个抗病基因, 亚克隆的DNA 片段中分别包含各自的启动子、内含子和终止子。利用农杆菌介导的方法分别将这两个基因转化番茄品种‘Moneymaker’, 转基因植株经PCR 初步筛选后再分别提取总RNA 进行RT-PCR, 以验证其是否在‘Moneymaker’中表达。试验结果表明, FLS2和LysM 均能成功地在‘Moneymaker’中表达, 说明番茄的转录系统不仅能识别这两个抗病基因的启动子并起始转录, 还能正确识别并剪切这两个基因的外显子和内含子。据此推测, 拟南芥和番茄这两个远缘物种的转录机制存在相对保守的成份, 这为探索在这两个物种间R基因的功能及其下游信号通路的保守性提供了有价值的参考。     

苹果MdNAC9的克隆及其调控黄酮醇合成功能的鉴定

为了探究红肉苹果黄酮醇合成机理,分析通路相关基因,从成熟期红肉苹果中克隆了1个NAC转录因子基因Md NAC9。通过Real-TimePCR、酵母单杂交和荧光素酶报告试验,探究Md NAC9与苹果黄酮醇积累的相关性。结果表明,在苹果果实和过表达Md NAC9的愈伤组织(OENAC9)中Md NAC9表达量变化与黄酮醇合成相关基因Md FLS表达量变化趋势一致。酵母单杂交试验证明,Md NAC9具有转录激活功能,能够特异结合Md FLS基因启动子。荧光素酶报告试验显示,Md NAC9对Md FLS的启动子有激活作用,促进Md FLS的表达。Md NAC9可能通过激活Md FLS促进苹果黄酮醇积累。     

柑橘CsHB1启动子的克隆及功能分析

以‘伏令夏橙’叶片基因组DNA为模板,克隆了CsHB1启动子5′端转录起始位点上游分别为1 741 bp和1 613 bp的区域序列。序列分析表明这两个启动子区序列相似度为90.7%,存在141 bp的差异片段,该差异片段中含有2个Box4元件。通过PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测,结果表明CsHB1的不同启动子序列含有多种响应元件,如胚乳特异性元件、分生组织表达元件、光反应元件、热应激反应元件、MYB结合位点等。为进一步分析CsHB1启动子的功能,构建该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体prCsHB1::GUS,并用农杆菌介导法转化拟南芥,获得prCs HB1-1::GUS拟南芥纯合材料13株和prCs HB1-2::GUS拟南芥纯合材料10株。对转基因拟南芥进行GUS组织化学染色鉴定,结果表明两类启动子表达载体已成功转入拟南芥中并进行了表达,其表达部位主要集中于愈伤组织和花药中,而在种荚、叶片及幼苗中未检测到GUS蛋白的表达。     

芥菜开花整合子SOC1启动子的克隆及其与FLC、SVP蛋白互作的研究

为了深入研究芥菜开花整合子SOC1基因的表达调控机制,利用染色体步移法从芥菜‘QJ’中克隆了SOC1编码区上游782 bp的启动子,并构建SOC1基因启动子的酵母表达载体pAbAi-SOC1,与蛋白表达载体pGADT7-FLC、pGADT7-SVP共转化酵母Y1HGold菌株。酵母单杂交表明：芥菜FLC和SVP蛋白均能与SOC1的启动子相互作用。进一步分析发现：SOC1启动子含3个CArG-box表达调控基序。分别亚克隆这3个基因片段（SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3）,并再次构建酵母重组质粒pAbAi-SOC1-1、pAbAi-SOC1-2和pAbAi-SOC1-3,与pGADT7-FLC、pGADT7-SVP分别融合到Y1HGold菌株。融合菌株均能在相应SD/-Leu/AbA培养基上生长,说明SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3都能被芥菜FLC、SVP蛋白识别并结合。再次构建SOC1-1、SOC1-2、SOC1-3的CArG-box删除突变体及A-T互换突变体,则均不能与FLC、SVP蛋白互作。由此说明：SOC1-1、SOC1-2和SOC1-3的3个CArG-box基序确实能特异性识别FLC、SVP,发生DNA-蛋白相互作用。这为利用启动子调控SOC1基因的转录表达等深入研究奠定了理论基础。     

甘蓝Ogura 细胞质雄性不育相关基因BoMF1启动子的克隆及功能分析

 通过TAIL-PCR 染色体步移技术,从甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）基因组中克 隆到胞质雄性不育（OguCMS）相关基因BoMF1 翻译起始位点上游521 bp 的启动子序列。软件分析预测 表明,该启动子序列中存在多个顺式作用元件,包括TATA-box、CAAT-box、MYB 结合位点、植物激 素响应单元等。为了研究该启动子的表达特性,亚克隆了BoMF1 转录起始位点上游521 bp 序列,将其置 换pBI121 中的CaMV35S 启动子,驱动其下游的GUS 基因,构建植物表达载体pBI121-BoMF1P,以pBI121 空载体作为阳性对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法转入拟南芥。结果表明,甘蓝BoMF1 启动子序列 能驱动GUS 基因在拟南芥花药发育晚期的花药和花粉中特异表达,表达具有组织特异性。     

梨β–微管蛋白基因及其在矮生型与普通型梨茎尖中的表达差异

以模式植物拟南芥的β–微管蛋白为参考依据,通过电子克隆的方法,从西洋梨基因组中克隆了9个β–微管蛋白基因,并根据苹果和梨基因组间的保守性及共线性原理,实现了这些基因的染色体定位。序列分析显示,这组基因均含有3个外显子和两个内含子。起源于全基因组复制事件而形成的成对染色体上的基因不仅在外显子和内含子长度上具有较高的保守性,而且编码的氨基酸残基也有更高的序列相似性。对9个β–微管蛋白基因在矮生梨与普通梨杂种群体中的荧光定量表达分析表明,有7个基因在茎尖组织中表达,其中定位于chr16上的转录本号为PCP044487.1的基因在矮生型和普通型梨茎尖中的转录水平出现极显著差异,推测该基因可能与梨矮生性状形成的分子调控有重要关系。     

中国李pgip启动子的克隆及调控元件分析

 在已克隆中国李pgip序列的基础上, 通过染色体步行法获得了该基因上游1 869 bp的启动子 序列, 联合生物信息学中的进化印记法和启动子扫描法对克隆的启动子序列进行了调控元件识别。结果报道了3个调控元件: 1个TGA1结合位点( TGACG) 和2个WRKY结合位点(TGAC) 。这为全面揭示pgip表达的转录调控机制提供了遗传基础。     

番茄20S蛋白酶体基因家族鉴定及生物信息学分析

20S蛋白酶体能够通过自身或泛素—蛋白酶体系统特异性降解细胞质和细胞核中的蛋白质,维持细胞蛋白质稳态。本研究中鉴定出21个番茄（Solanum lycopersicum L.）20S蛋白酶体基因家族成员,并对其进行生物信息分析。结果表明,番茄20S蛋白酶体大多数基因含有相似的启动子和内含子,其中,编码α亚基的基因保守性较好,而编码β亚基的基因保守性较差;亚细胞定位发现,绝大多数基因在细胞质中发挥功能;染色体定位和基因复制分析发现,21个20S蛋白酶体基因不均匀地分布在12条染色体上,存在2对片段复制基因对;进化分析表明,编码α亚基和编码β亚基的基因被划分在不同的类群或亚群;多物种共线性分析发现,番茄与辣椒（Capsicum annuum L.）和马铃薯（Solanum tuberosum L.）之间的同源基因对较多,而与拟南芥[Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.]、水稻（Oryza sativa L.）和玉米（Zea mays L.）同源的基因对较少。SlPRA1-01、SlPRA10-04、SlPRA11-05和SlPRA16-09这4个基因在3个物种中均形...     

番茄AP2/ERF超家族重鉴定及过表达SlERF.D.3株系表型分析

基于番茄基因组数据库的更新，系统地对番茄AP2/ERF超家族成员进行了更新，并对其进行了染色体定位、保守基序、基因结构和对灰霉菌及生长素胁迫响应的分析。共鉴定出141个ERF家族基因，其中新鉴定出的ERF亚家族成员42个；随机分布在12条染色体上，大都只含有外显子而无内含子，部分基因不同程度的受到灰霉菌和生长素处理的诱导表达。作为拟南芥AtERF109在番茄中的同源基因，SlERF.D.3的表达可被灰霉菌抑制且可迅速强烈地响应生长素处理。为进一步明确SlERF.D.3的生物学功能，以番茄‘Ailsa Craig’为材料克隆了此基因的编码区，构建过表达载体并转化番茄，获得了3个T0代过表达株系。与野生型相比，转基因株系的叶片较细长、向下卷曲，且果实出现乳状突起。这为研究SlERF.D.3在调节番茄的生长发育和胁迫响应过程中的作用奠定了基础。     

苹果MdFT基因对番茄的遗传转化

 通过RT2PCR扩增, 从苹果叶片cDNA中克隆了^FT基因的同源基因^MdFT, 构建了花椰菜病毒35S启动子驱动的MdFT植物表达载体35S: : MdFT, 并利用根癌农杆菌介导法将其导入番茄栽培品种‘中蔬四号’; 同时转化拟南芥A tFT基因作为阳性对照。从添加卡那霉素的筛选培养基上再生了抗性植株,PCR扩增证明, 外源基因MdFT和AtFT已经整合到转基因番茄的基因组, 半定量RT-PCR则证明它们已经在转基因番茄中得到异位过量表达。形态鉴定发现, 转基因番茄植株比非转基因对照植株开花早, 表明成功地从苹果中克隆了成花素基因MdFT, 该基因具有通过转基因缩短苹果树童期的潜在价值。     

超表达MdFLS2的拟南芥fls2突变体识别细菌鞭毛蛋白,提高对轮纹病菌的抗性

以红肉苹果‘紫红3号’愈伤组织为试材,克隆了细菌鞭毛蛋白受体基因MdFSL2,研究了其与拟南芥AtFLS2对细菌鞭毛蛋白敏感性差异以及对苹果轮纹病抗性的影响。进化树分析表明,MdFLS2与拟南芥AtFLS2亲缘关系较远,处于不同的进化树分支,与梨PbFLS2的亲缘关系最近。时空表达特异性研究表明,在苹果叶片中MdFLS2表达不随组织衰老而产生差异,能够被外源SA处理诱导,不受IAA、ACC处理影响;在根系中表达量最高,而在花与果实中表达量较低。在拟南芥中异源过表达MdFLS2,显著抑制植株生长,并出现叶片边缘枯死或细胞死亡的表型。在转基因拟南芥中受SA诱导的病程相关基因AtPR1、AtPR2和AtPR5,及衰老相关基因AtORE1和AtNAP的表达水平均显著高于野生型。为研究MdFLS2是否具有感知细菌鞭毛蛋白的能力,进行拟南芥根系生长抑制试验,MdFLS2超表达恢复了细菌鞭毛蛋白N端22个保守氨基酸肽段(flg22)对拟南芥fls2突变体根系生长的抑制作用,但flg22分别处理30和60 min,或20和40 min,flg22诱导的标志性基因表达水平及MAPK激酶活化水平在过表达MdFLS2的fls2突变体中显著低于同样处理的野生型。超表达MdFLS2提高了拟南芥叶片对轮纹病菌的抗性,并增强了拟南芥突变体fls2对假单胞菌DC3000的抗性。研究结果说明苹果MdFLS2是一个有功能的免疫相关基因,MdFLS2与AtFLS2在具体执行功能与作用机制上可能存在差异。     

小分子热激蛋白基因在番茄花药中的转录

 选择8 个耐热性不同的番茄品种种植在地处亚热带的日本最南部石垣市, 测定夏季高温环境下花粉粒的败育率, 并据此将其分成耐热型和热敏型品种, 分析高温胁迫下花药中4 类小分子热激蛋白的转录。结果表明, 番茄花药中含有组成性的细胞质小分子热激蛋白和线粒体小分子热激蛋白mRNA; 高温季节细胞质小分子热激蛋白和线粒体小分子热激蛋白基因转录明显; 热敏型番茄花药中小分子热激蛋白基因的转录高峰温度低于耐热型花药。     

矮牵牛PDS基因的克隆及其在shRNA介导的基因沉默中的应用

以矮牵牛(Petunia hybrida)自交系‘Mitchell Diploid’(MD)为材料,通过3′RACE和5′RACE获得了其八氢番茄红素脱氢酶基因(PhPDS)的cDNA序列,进而通过PCR扩增出编码区的基因组序列。分析结果显示,PhPDS的cDNA序列全长2 182 bp,编码区序列1 746 bp,编码582个氨基酸。推测的蛋白质序列具有类胡萝卜素脱氢酶的保守结构域特征。编码区的基因组序列长7 609 bp,结构与番茄和拟南芥等PDS基因相似,具有14个外显子和13个内含子。利用博德研究所的小发夹RNA(shRNA)设计程序设计了两个针对PhPDS的shRNA,构建植物表达载体转化矮牵牛后,从其中一个载体的转化子中获得白色愈伤组织和幼枝,对白色幼枝的RT-PCR检测表明,其PDS基因的cDNA累积量减少,表明shRNA基因沉默技术能在矮牵牛中应用。以PDS基因为靶基因比用花色素合成基因研究基因沉默技术能更快地分析基因沉默的效果,全长序列的获得将有助于PDS基因在矮牵牛基因沉默技术研究中的应用。     

马铃薯抗晚疫病基因R3a、R1和RB在番茄中的表达

 晚疫病由疫霉菌( Phytophthora infestans) 引起, 主要侵染番茄和马铃薯等茄科作物, 造成巨大的经济损失。马铃薯已有5个抗晚疫病基因被克隆。为了研究已克隆的马铃薯抗晚疫病基因是否在番茄中起作用, 将马铃薯的抗晚疫病基因R3a、R1和RB 通过农杆菌介导法分别导入番茄品种Moneymaker中。筛选得到的再生植株经PCR检测结果表明, 目的基因已整合入番茄基因组; 转基因番茄离体叶片接种验证结果表明, 接种马铃薯晚疫病菌株8914829 (即小种0) , 转基因番茄产生了抗病的过敏反应(HR反应) 。为了验证转基因番茄是否对番茄晚疫病菌株产生抗性, 用番茄晚疫病的主流小种和强致病力菌株共5个菌株接种转基因番茄植株, 结果表明转R3a和R1 基因的番茄对部分番茄晚疫病菌株能够产生抗性, RB转基因植株叶片对5个番茄晚疫病菌株均产生抗性。该研究为番茄抗晚疫病的基因工程育种开辟了新的途径。     

树体休眠期前苹果花芽对低温早期响应的转录组分析

【目的】从总体上了解苹果花芽早期响应低温信号的基因表达情况,以期了解苹果休眠期花芽早期反应的分子网络,从而为苹果抗冷性研究提供理论依据。【方法】于树体休眠前收集花芽,低温(4℃)处理45 min(T1)、90 min(T2)和240 min(T3),常温处理为对照(T0),利用转录组技术分析了树体休眠前苹果花芽响应低温信号早期的基因表达情况,利用实时荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,qRT-PCR)进行数据验证。【结果】与对照相比,T1、T2和T3分别获得237、508和990个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs)。GO富集分析表明:处理前期的DEGs主要涉及碳水化合物有关的代谢、单体碳水化合物代谢过程,而后期主要涉及刺激反应、胁迫响应和DNA的转录等生物学过程。KEGG富集分析表明DEGs主要参与了"植物-病原菌互作","植物激素信号转导"等。其中,在响应低温信号后,参与钙调素/钙调素类蛋白(Ca2+–CaM/CML)代谢的基因MDP0000808334、MDP0000263349等及参与脱落酸(Abscisic acid,ABA)、油菜素内酯(Brassinosteroid,BR)和赤霉素(Gibberellin,GA)信号代谢的基因MDP0000189486、MDP0000122792和MDP0000287039等上调表达显著。【结论】Ca2+信号通路可能主要参与了苹果花芽的冷响应过程。此外,ABA、BR和GA等激素可能在苹果花芽响应低温信号中也起重要的调控作用。     

番茄SELF-PRUNING基因家族及株形调控功能研究进展

番茄SP（SELF-PRUNING）基因调控植株的有限型生长习性，其与金鱼草CEN（CENRORADIALIS）基因和拟南芥TFL1（TERMINAL FLOWER 1）基因同源，属于调控植物生长习性和开花的同一类基因。目前已报道了番茄SP基因家族8个成员（SP、SP9D、SP2I、SP3D、SP5G、SP6A、SIGI和SPGB），该基因家族能直接或间接调控番茄植株的生长习性，影响其株形。对番茄SP家族基因结构特征、亲缘关系、表达特性以及株形调控功能等研究进展进行综述，以期为调控番茄生长习性，获得紧凑型株系、实现均一化和现代机械化采收提供有效的技术支撑。