茄子花药开裂相关基因SmDAD1启动子的克隆及功能分析

以茄子‘F142’为材料,通过染色体步移法克隆了花药开裂相关基因SmDAD1上游746 bp的启动子序列。通过生物信息在线软件预测,该启动子中含有多个与植物发育及逆境应答相关的顺式作用元件。为进一步分析SmDAD1启动子的功能,构建prSmDAD1::GUS融合表达载体,转化到拟南芥,并对T3代纯合转基因拟南芥进行GUS染色分析。结果表明,SmDAD1启动子在拟南芥幼苗的根部、叶片和花药均有较强活性,其中在根部活性最强,在茎中没有活性。检测转基因植株GUS基因的表达量发现,SmDAD1启动子受茉莉酸甲酯(MeJA)、脱落酸(ABA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA)、生长素(IAA)和1–氨基环丙烷–1–羧酸(ACC)诱导。因此推测SmDAD1可能在茄子发育和抗外界逆境胁迫中起重要作用。     

矮牵牛CHS基因启动子克隆、序列分析及植物表达载体构建

应用PrimerPremier5.0软件,根据GenBank数据库报道的查尔酮合成酶基因启动子序列(EF199747)设计1对特异性PCR扩增引物,以矮牵牛品种‘午夜蓝色’叶片总DNA为模板,用TaqDNA聚合酶成功扩增出1条约0.5kb的DNA片段,回收该片段并连接到pMD18-T载体上。结果表明:经测序该启动子片段长550bp;bl2seq分析结果表明该启动子与目标序列相似性高达100%;PLACE在线分析显示在克隆片段中含有TATAbox、CAATbox、capsite、antherbox、box1、box2、Gbox及TACPyAT-box等顺式元件;并构建了矮牵牛CHS基因启动子融合标记基因GUS的植物表达载体pPhCHS::GUS。     

梨糖转运相关基因PbTMT4启动子克隆及功能分析

以‘砀山酥梨’(Pyrus bretschneideri‘Dangshan Suli’)为材料,利用梨基因组数据库,通过PCR获得了糖转运相关基因PbTMT4(Pbr032130.1)2 211 bp的CDS序列及其编码起始位点上游长度为1 220 bp的启动子序列。使用农杆菌介导法将PbTMT4导入拟南芥,与野生型对照植株相比,转基因拟南芥植株的生长速度更快,抽薹、开花时间更早,叶片糖积累量更高。生物信息学分析表明,该启动子中含有多个与逆境应答、激素信号和光信号相关的顺式作用元件。为进一步分析PbTMT4启动子功能,构建了该启动子与GUS基因融合的植物表达载体并转化拟南芥。对T_3代转基因拟南芥各组织进行GUS活性染色和半定量分析,发现GUS基因在根、茎、叶、花和果荚中均有表达,NaCl、干旱、GA_3、MeJA以及光照处理均能一定程度上提高转基因拟南芥中GUS基因的转录水平。逆境处理发现,PbTMT4转基因株系较野生型植株受到的伤害小。研究结果初步表明,PbTMT4可促进转基因拟南芥发育并提高糖积累量,可能在抗非生物胁迫中起重要的调控作用。     

甘蓝Ogura 细胞质雄性不育相关基因BoMF1启动子的克隆及功能分析

 通过TAIL-PCR 染色体步移技术,从甘蓝（Brassica oleracea L. var. capitata L.）基因组中克 隆到胞质雄性不育（OguCMS）相关基因BoMF1 翻译起始位点上游521 bp 的启动子序列。软件分析预测 表明,该启动子序列中存在多个顺式作用元件,包括TATA-box、CAAT-box、MYB 结合位点、植物激 素响应单元等。为了研究该启动子的表达特性,亚克隆了BoMF1 转录起始位点上游521 bp 序列,将其置 换pBI121 中的CaMV35S 启动子,驱动其下游的GUS 基因,构建植物表达载体pBI121-BoMF1P,以pBI121 空载体作为阳性对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法转入拟南芥。结果表明,甘蓝BoMF1 启动子序列 能驱动GUS 基因在拟南芥花药发育晚期的花药和花粉中特异表达,表达具有组织特异性。     

杏CCD1和CCD4启动子克隆及顺式作用元件分析

以‘轮台小白杏’杏果实为材料，根据转录组数据库中的CCD1和CCD4基因片段，通过基因组步移法克隆了两个启动子pPaCCD1和pPaCCD4，获得了长度分别为2 233和1 838 bp的启动子序列。利用PlantCare数据库对启动子序列的顺式作用元件进行预测分析，结果表明两个启动子均含有多个光响应、脱落酸和茉莉酸甲酯等共有顺式作用元件，此外，PaCCD1启动子中含有刺激诱导和种子特异性调控等响应元件，PaCCD4启动子中含有赤霉素、低温和增强转录水平等响应元件，这暗示PaCCD1和PaCCD4的表达可能受光信号、激素和胁迫等多种信号的共同调节。为进一步确定其启动子核心区，基于基因结构特征与顺式作用元件的分布情况，分别构建两个不同长度缺失启动子与GUS基因融合的表达载体并瞬时转化烟草叶片。GUS活性检测发现，在PaCCD1的启动子上游–2 174 ~–1 700 bp、–1 700 ~–1 200 bp、–1 200 ~–600 bp区间内均包含影响启动子活性的顺式作用元件；PaCCD4启动子在上游–1 740 ~–1 200 bp和–1 200 ~–600 bp这两个区间内含有顺式作用元件，随着启动子片段的缺失，PaCCD1和PaCCD4的GUS活性逐渐减弱。PaCCD1的启动子核心区域在–1 200 ~ 2 174 bp区段内，PaCCD4的启动子核心区域在–1 200 ~ 1 740 bp区段内。     

百子莲脱水素基因ApSK_3对逆境与激素信号的应答模式与调控机制

克隆了百子莲(Agapanthus praecox)脱水素基因ApSK_3上游2 195 bp的启动子序列,对百子莲不同组织和多种非生物胁迫与ABA处理的样品进行基因定量分析,构建多个ApSK_3不同长度缺失的启动子片段与GUS基因融合的表达载体并转化拟南芥,以揭示ApSK_3基因对不同逆境与激素信号的应答模式及顺式作用元件的调控功能。结果表明:ApSK_3启动子序列包含多个与植物逆境、激素应答及生长发育相关的顺式作用元件,且ApSK_3的表达具有组织特异性,果实中表达量最高,叶、根次之,花中最低;ApSK_3对ABA信号与盐胁迫最敏感,其次为干旱、高渗和低温胁迫,对高温胁迫响应不明显。ApSK_3-P::GUS融合表达载体转化拟南芥,ApSK_3启动子在拟南芥的整个生长发育过程中均具有较强的表达活性,幼苗根部的表达活性强于叶片,且随着果实的发育成熟启动子的活性明显增强。ApSK_3不同长度缺失的启动子片段分析结果表明–2 175～–950 bp片段对启动子的活性起到重要的调控作用;多个顺式作用元件响应干旱胁迫;ApSK_3-P通过两个ABRE元件共同响应ABA信号;–526～–533 bp的ERE元件参与响应乙烯信号;–561～–567 bp的P-box元件响应了赤霉素信号,–2 175～–1 167 bp区域可以增强对GA的响应。研究结果证明ApSK_3启动子可积极响应干旱、渗透、盐、低温、ABA、GA和乙烯信号;启动子上存在多个顺式作用元件响应干旱胁迫,ApSK_3-P通过两个ABRE、ERE与P-box元件分别响应ABA、乙烯与赤霉素信号。     

银杏查尔酮合成酶基因启动子（GbCHSP）调控元件及功能分析

通过染色体步移方法从银杏（Ginkgo biloba L.）基因组中克隆到查尔酮合成酶基因（CHS）翻译起始位点上游1 711 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,该启动子片段中存在多个顺式作用元件,包括紫外/蓝光响应单元、植物激素响应单元、真菌诱导元件、MYB结合位点、TATA-box和CAAT-box等。亚克隆了CHS转录起始位点上游1 402 bp序列,将其与GUS基因构建融合表达载体pBI121 + CHSP,以pBI121-35S作为负对照,通过农杆菌（LBA4404）介导法分别转入烟草。结果表明,银杏CHS启动子序列能驱动GUS基因在烟草中的表达,表达具有组织特异性。GbCHSP的功能研究将有助于揭示银杏叶黄酮的积累与GbCHS基因表达的分子机理。     

番木瓜凝乳蛋白酶基因启动子的克隆及功能研究

 采用 PCR技术从番木瓜品种‘穗中红’克隆了木瓜凝乳蛋白酶基因的部分序列及其5'侧翼序列,构建含有两种长度启动子片段的植物表达载体,并用基因枪轰击番木瓜叶组织和农杆菌转化烟草叶盘。结果表明,克隆产物长719 bp,163 bp 3'侧翼序列与 GenBank中的番木瓜凝乳蛋白酶基因序列同源性为99%,556 bp的 5'侧翼序列有基础启动子区,转录起始位点位于ATG上游38bp的T。序列登录号为 AY803756。预测在启动子区存在 TATA-box、CAAT-box、WUN和HSE等顺式作用元件。两种启动子片段驱动的GUS基因瞬时表达和稳定表达结果表明,该启动子片段具有乳管特异表达活性。     

菜薹BcAMT1;4启动子的克隆及活性分析

以菜薹（Brassica campestris L. ssp. chinensis var. utilis Tsen et Lee）为材料，利用染色体步移法获得了铵转运蛋白基因BcAMT1;4的ATG上游长度为2 086 bp的启动子序列。生物信息分析表明，该启动子中包含多个光信号、激素信号、逆境应答、组织特异表达等顺式作用元件。构建该启动子与GUS基因的融合表达载体，并用农杆菌介导法转化拟南芥。通过对T3代转基因拟南芥植株GUS活性分析发现，GUS染色主要集中于叶片，而在根、茎、花中染色较浅。此外，不同氮源也影响BcAMT1;4启动子的活性，缺氮处理提高了转基因拟南芥GUS表达活性，而分别供0.25 mmol ? L-1 NO3-、NH4+和NH4NO3的处理在一定程度上抑制其表达活性。研究结果表明，BcAMT1;4可能对菜薹叶片铵态氮营养具有重要调控作用。     

柑橘CsTBL1启动子的克隆及其在转基因拟南芥中的活性分析

以奥林达夏橙[Citrus sinensis(L.)‘Olinda’]为材料,克隆了CsTBL1基因编码起始位点上游长度为2 361 bp的启动子序列。生物信息学预测表明,该启动子中含有多个与逆境应答相关的顺式作用元件。为进一步分析CsTBL1启动子的功能,构建了该基因启动子与GUS基因融合的植物表达载体,并用浸花法转化拟南芥,对T3代转基因拟南芥进行GUS活性染色。结果显示,CsTBL1启动子在1～3 d龄幼苗所有组织中的活性都非常强,在7～20 d龄幼苗的子叶和根中的活性仍然较强,但在下胚轴中基本检测不到活性。在50 d龄幼苗中,只在叶、茎的毛状体以及还在生长的根中检测到GUS活性。转基因植株的GUS表达受到1–氨基环丙烷–1–羧酸(乙烯合成前体,ACC)、脱落酸(ABA)、甲基茉莉酸(MeJA)和水杨酸(SA)诱导。上述结果表明CsTBL1可能在植物发育和抗外界逆境胁迫中起到非常重要的作用。     

芜菁花青素合成关键酶DFR基因启动子的克隆及功能分析

在已经克隆的‘津田’芜菁和‘赤丸’芜菁二氢黄酮醇4–还原酶（DFR）基因的基础上,通过染色体步移法从两种芜菁基因组中克隆了BrDFR1和BrDFR2基因上游1 296和1 297 bp的启动子序列。生物信息学分析表明,启动子片段中包含TATA box、CAAT box、光调控元件、ABA应答元件、伤害应答元件、低温应答元件、防御与胁迫应答元件、MeJA应答元件等多个顺式作用元件。启动子BrDFR1P和BrDFR2P仅在15个核苷酸位点存在差异。将BrDFR1P和BrDFR2P分别连接到pCAMBIA1301植物表达载体上,构建Promoter::GUS载体,通过农杆菌介导遗传转化烟草。GUS组织化学染色检测表明,BrDFR1P和BrDFR2P均能驱动GUS基因表达。构建BrDFR1P和BrDFR2P的一系列缺失体,融合GUS基因后遗传转化烟草。染色结果表明,BrDFR1P和BrDFR2P缺失片段均具有相应的起始下游基因转录的活性特征。     

香菇ras和gpd启动子的克隆与功能鉴定

以香菇基因组DNA为模板,利用PCR技术克隆了香菇1个ras启动子Lras,2个gpd启动子Lgpd1和Lgpd2.这3个启动子的大小分别为715bp、1056bp和611bp,与已报道的ras和gpd启动子的同源性很强.对这3个启动子的分析结果表明,它们都含有丰富的启动子顺式作用元件.将这些启动子片段分别与GUS基因连接构建了表达载体,并将这些表达载体导入草菇菌丝体中,检测其活性,最终显示3个片段都有启动GUS基因表达的能力,其中Lgpd1启动子活性最强,Lras启动子次之,Lgpd2最弱.     

CsWRKY22启动子的克隆及响应柑橘溃疡病菌侵染的表达特征

由柑橘黄单胞杆菌致病变种(Xanthomonas citri subsp. citri,Xcc)引起的柑橘溃疡病严重危害着柑橘产业的健康可持续发展。前期研究表明,CsWRKY22可能是溃疡病感病基因。从‘晚锦橙’(Citrus sinensis Osbeck)中克隆了CsWRKY22的两个等位启动子pCsWRKY22-1和pCsWRKY22-2,长度分别为1 428和1406bp。序列分析表明两个等位启动子序列一致性为91.76%。两个等位启动子含有多种参与植物防御反应和生长发育的顺式作用元件,相同元件的数量和位置基本一致,不同的是,在TATA-box下游,pCsWRKY22-1含有2个22 bp长的TA-rich转录增强序列,而pCsWRKY22-2只含有1个。构建CsWRKY22启动子控制GUS报告基因的植物表达载体pC sW RKY22::GUS,并用农杆菌介导法转化‘晚锦橙’,经GFP活性检测和PCR鉴定获得pCsWRKY22-1::GUS和pCsWRKY22-2::GUS转基因植株各8株和4株。GUS组织化学染色、GUS酶活性及定量PCR分析表明,CsWRKY22启动子具有较强的机械伤诱导活性和柑橘溃疡病病原菌诱导活性,同时具有一定水平的基础表达特性。pCsWRKY22-1机械伤诱导活性高于pCsWRKY22-2,而pCsWRKY22-2溃疡病菌诱导活性高于pCsWRKY22-1。     

苹果生长素运输基因MdABCB19的克隆及其在矮化砧木中的表达分析

以苹果矮化砧木M9和乔化砧木MM106为材料,克隆到一个3 753 bp的核苷酸序列,其编码1 250个氨基酸,含有两个ABC_membrance结构域,两个ABC_tran结构域,与梨、油菜和拟南芥的ABCB19基因高度同源,命名为MdABCB19。该序列在M9和MM106中存在一个非同义SNP,编码氨基酸由A突变为S,导致M9α螺旋少了一段。表达量分析表明,MdABCB19在砧木M9和MM106、长富2号/M9和长富2号/MM106均差异表达。启动子序列分析发现M9的MdABCB19启动子在起始密码子上游170 bp处有6个碱基(CTCTGT)缺失,导致缺失一个5'UTR Py-rich stretch motif。MM106的MdABCB19启动子活性高于M9,并且受光照调控。推测M9的MdABCB19启动子5'UTR Py-rich stretch motif缺失可能与其MdABCB19低表达有关;而氨基酸突变导致蛋白质三级结构α螺旋结构改变是否影响生长素运输,有待进一步研究。上述研究表明苹果MdABCB19可能通过调控生长素转运参与砧木苗矮化性状的调控。