东亚砂藓类萌发素蛋白基因RjGLP的克隆及表达分析

以东亚砂藓转录组测序获得的类萌发素蛋白基因序列为基础,采用PCR技术克隆得到该基因的cDNA全长序列,命名为RjbZIP。该序列全长为726 bp,包含669 bp的开放阅读框,编码222个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,该蛋白的相对分子质量为23 397.9,等电点(pI)为6.82,不稳定系数为14.41,为稳定蛋白。序列预测分析表明,该蛋白疏水性强,具有信号肽序列,是一种胞外基质分泌蛋白。多序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GLPs家族的典型特征。实时荧光定量PCR研究表明,在干旱胁迫处理过程中,东亚砂藓RjGLP基因的表达量高于正常生长的材料(CK),被诱导表达,推测该基因可能参与对干旱胁迫的应答。     

东亚砂藓类萌发素蛋白基因RjGLP的克隆及表达分析

以东亚砂藓转录组测序获得的类萌发素蛋白基因序列为基础,采用PCR技术克隆得到该基因的cDNA全长序列,命名为RjbZIP。该序列全长为726 bp,包含669 bp的开放阅读框,编码222个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,该蛋白的相对分子质量为23 397.9,等电点(pI)为6.82,不稳定系数为14.41,为稳定蛋白。序列预测分析表明,该蛋白疏水性强,具有信号肽序列,是一种胞外基质分泌蛋白。多序列比对分析结果显示,该基因编码的蛋白具有GLPs家族的典型特征。实时荧光定量PCR研究表明,在干旱胁迫处理过程中,东亚砂藓RjGLP基因的表达量高于正常生长的材料(CK),被诱导表达,推测该基因可能参与对干旱胁迫的应答。     

东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的克隆及序列分析

[目的]对东亚砂藓(Rhacomitrunm japonicum)的Cu/Zn SOD基因进行克隆,并对其序列进行分析。[方法]利用RT-PCR技术获得东亚砂藓Cu/Zn SOD基因的cDNA,同时对该序列进行生物信息学分析。[结果]东亚砂藓Cu/Zn SOD基因cDNA长565 bp,包含一个长为465 bp的ORF,编码154个氨基酸残基,预测的该蛋白的分子量为15.5 kD,理论等电点为5.77,负电荷残基(Asp+Glu)总数为18个,正电荷残基(Arg+Lys)总数为12个,不稳定系数是13.36;其编码的氨基酸序列包含了5个蛋白保守区,均为铜锌超氧化物歧化酶超家族所有;Blastn比对表明东亚砂藓Cu/Zn SOD基因与毛尖紫萼藓、小立碗藓相关基因的同源性高达99%和82%。[结论]该研究为进一步研究紫萼藓科植物的抗旱性及苔藓Cu/Zn-SOD在抗非生物胁迫方面的功能提供了理论依据与基础。     

大豆GmTIP1-1基因克隆及功能研究

[目的]本研究通过对大豆水通道蛋白基因GmTIP1-1的克隆及其在不同胁迫处理下的差异表达分析,探究水通道蛋白在大豆耐受非生物胁迫中的作用机制。[方法]从大豆品种‘天隆1号’中克隆出GmTIP1-1的CDS序列,采用生物信息学方法对该基因及其编码蛋白进行分析。采用实时荧光定量PCR检测在不同逆境处理下GmTIP1-1在大豆根、茎、叶等组织的表达情况。利用基因枪轰击法对GmTIP1-1蛋白全长及不同跨膜结构域进行亚细胞定位分析。通过酵母双杂试验确定GmTIP1-1蛋白的互作蛋白,并利用实时荧光定量PCR检测在干旱处理下与GmTIP1-1互作蛋白基因的表达情况。[结果]GmTIP1-1的CDS序列全长为753 bp,编码250个氨基酸,等电点为6.51。系统进化分析发现,GmTIP1-1与苜蓿(Medicago truncatula)和黄瓜(Cucumis sativus)的亲缘关系十分相近。亚细胞定位结果显示,GmTIP1-1定位在细胞膜上。实时荧光定量PCR结果显示:GmTIP1-1在根中的表达量最高,在茎中次之,叶中最低;在干旱、ABA处理下均能诱导GmTIP1-1基因在大豆根、茎、叶中的表达;在干旱和ABA处理下,GmTIP1-1基因在根中的表达水平均高于在茎和叶中的表达水平。酵母双杂试验表明,GmTIP1-1与参与非生物胁迫调节的Gm SNARE蛋白以及响应逆境胁迫相关蛋白Gm F-box均存在互作。在干旱处理下,大豆根和茎中Gm SNARE和Gm F-box基因都会受到干旱诱导表达。[结论]GmTIP1-1蛋白定位于细胞膜,通过与参与非生物胁迫调节的Gm SNARE蛋白以及响应逆境胁迫相关蛋白Gm F-box互作来增强大豆对非生物胁迫的抗性。     

茄子SmNTF3基因的克隆及其表达模式分析

[目的]本文旨在克隆茄子(Solanum melongena L.)促分裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因SmNTF3,阐明其在盐和干旱胁迫处理下的表达特性。[方法]以茄子‘苏崎1号’为试验材料,克隆SmNTF3的全长序列,对其基因结构和序列同源性进行分析,通过烟草叶片瞬时表达系统进行SmNTF3蛋白的亚细胞定位,采用实时荧光定量PCR检测SmNTF3基因在不同组织及盐和干旱胁迫下的表达情况。[结果]SmNTF3基因开放阅读框长度为1 119 bp,编码1个含372个氨基酸残基的蛋白。生物信息学分析表明,该蛋白具有保守的S_TKc结构域,富含α-螺旋和无规则卷曲。系统发育分析表明,SmNTF3属于MAPK家族C组成员,其氨基酸序列具有高度保守性,与番茄和马铃薯亲缘关系最近。亚细胞定位发现,SmNTF3蛋白在烟草叶片的细胞核和细胞质膜上表达。SmNTF3基因具有组织特异性,在茎中表达量最高。盐和干旱胁迫能够显著诱导SmNTF3基因的上调表达。[结论]从茄子中克隆了1个MAPK家族C组成员SmNTF3,该基因受盐和干旱胁迫诱导表达,可能参与茄子对盐和干旱胁迫的响应过程。     

番茄水通道蛋白基因SIAQP的克隆与序列分析

[目的]通过分析克隆得到的番茄水通道蛋白SIAQP基因的cDNA全长序列特征、编码蛋白的细胞定位及其在番茄材料Mirco Tom中经干旱胁迫后的表达模式,为进一步研究番茄在逆境下的抗逆机制及加快番茄抗逆育种积累资料.[方法]采用RACE技术克隆番茄水通道蛋白基因的cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因的编码蛋白特性;利用基因枪转化法将S1AQP基因与GFP融合的瞬时表达载体(S1AQP::GFP)转入洋葱表皮细胞,对该基因进行亚细胞定位;利用Real time-PCR分析该基因在番茄品种Mirco Tom中经干旱胁迫下的表达机制.[结果]S1AQP基因(GenBank登录号:HQ433337)cDNA全长为1 107 bp,编码区含852 bp,共编码283个氨基酸.生物信息学软件分析表明,SIAQP基因含有6个跨膜区,2个NPA单元,其氨基酸残基与MIP家族蛋白保守区序列完全一致,且该基因氨基酸序列与其它物种PIP类质膜型水通道蛋白氨基酸序列具有很高的同源性.11个物种间的聚类分析表明,S1AQP基因编码的蛋白与马铃薯质膜型水通道蛋白遗传距离最近.细胞定位结果确认S1AQP基因编码蛋白在细胞质膜上发挥生物学作用.Southern杂交结果显示,S1AQP基因在番茄基因组DNA中呈单拷贝.Real time-PCR分析结果证实,干旱胁迫下该基因表达量总体呈下降趋势.[结论]对番茄水通道蛋白S1AQP基因在干旱胁迫后的表达模式分析,预示该基因表达受逆境条件的影响,为今后进一步探讨其在干旱胁迫中发挥的作用提供了重要信息.     

毛尖紫萼藓GpAPX的克隆和信息学分析及其在植株干旱与复水下的表达分析

以毛尖紫萼藓(Grimmia pilifera)为试材,采用RACE技术克隆获得1个抗坏血酸过氧化物酶基因(APX)的cDNA序列,命名为GpAPX(GenBank登录号:GU989311)。该基因全长1 115 bp,编码区为771 bp,编码256个氨基酸,5’非翻译区为116 bp,3’非翻译区为228 bp。序列分析表明:该基因属于过氧化物酶基因家族,与其他植物抗坏血酸过氧化物酶的同源性为70.2%～89.7%。实时定量PCR检测结果显示,GpAPX在干旱及复水条件下均能表达,表明GpAPX蛋白可能与抗旱性相关,在毛尖紫萼藓响应干旱胁迫过程中发挥作用。     

马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长克隆及序列分析

[目的]分离克隆马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长.[方法]根据其他松科植物α-蒎烯合成酶基因保守区域设计引物,扩增出基因的部分片段,再结合RACE技术分别扩增出基因3’端和5’端序列,通过序列拼接获得cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因编码蛋白的特性.[结果]马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长为2 103 bp,编码区1 980 bp,编码629个氨基酸,含有1个N端结构域、1个金属结合结构域和1个天冬氨酸富集基序（DDMYD）.[结论]该方法成功克隆了马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长序列,具有单萜烯合成酶基因的典型特征,序列提交至GenBank,获得登录号KF547035.     

油棕EgNAC33基因的克隆与逆境响应表达分析

应用RT-PCR及RACE技术,克隆了油棕抗逆相关基因EgNAC33的全长cDNA;应用生物信息学方法对其氨基酸序列进行了分析,同时采用qRT-PCR分析了低温、干旱及高盐胁迫处理后EgNAC33的响应表达情况。结果表明:克隆获得的基因EgNAC33的cDNA全长为1952 bp,含1个长约735 bp的开放阅读框,编码245个氨基酸,该基因编码的蛋白与椰子NAC蛋白的同源性最高;EgNAC33基因受低温及高盐胁迫的诱导,其中,在8℃条件下胁迫8 h时的表达量最高,在高盐条件下胁迫24 h时的表达量最高;但在干旱胁迫下,EgNAC33的表达量基本上不受影响。     

陆地棉干旱胁迫响应基因GhGR的克隆及特征分析

【目的】克隆陆地棉干旱胁迫谷胱甘肽还原酶基因（GhGR）,并对其序列进行生物信息学分析和表达分析。【方法】利用RACE和RT-PCR技术克隆陆地棉谷胱甘肽还原酶基因的全长序列,应用生物信息学软件对获得的基因序列及编码的蛋白序列进行分析;通过基因枪转化和实时荧光定量PCR表达对该基因表达部位和表达模式进行分析。【结果】从陆地棉（Gossypium hirsutum L.）中克隆了谷胱甘肽还原酶基因GhGR,cDNA全长1 035 bp,其中,ORF为792 bp,编码263个氨基酸。氨基酸序列比对和同源性分析显示该基因与杨树（XP_002299276.1）、蓖麻（XP_002518118.1）、葡萄（CAN74593.1）同源性最高,分别为90%、91%和91%。系统发育树结果显示,GhGR与葡萄中该蛋白的亲缘关系最近。基因枪转化和实时荧光定量PCR分析表明GhGR定位于洋葱的细胞膜和细胞核膜,并且其表达量受干旱胁迫诱导上调表达。【结论】从陆地棉克隆得到谷胱甘肽还原酶基因GhGR,初步认为该基因对干旱胁迫有一定响应。     

绵羊QM基因的电子克隆及其生物信息学分析

[目的]为研究绵羊QM基因的生物学功能奠定基础。[方法]利用EST数据库和电子克隆等技术克隆绵羊QM基因,通过生物信息学分析预测其序列结构,检测其在绵羊不同组织中的表达情况并分析其与其他14物种QM基因的同源性。[结果]首次成功克隆了绵羊QM基因,全长771 bp,含有1个最长为645 bp ORF,编码的蛋白分子量为24.61 kD,为碱性蛋白质。QM蛋白的二级结构含有6个α-螺旋和10个β-折叠,其余为无规卷曲。QM基因在绵羊脾脏、脑组织和骨组织中较好表达,在其余7种组织中也均有表达。QM基因在病变组织中表达量比正常组织高。在14个物种中绵羊QM基因与牛的进化距离最短。[结论]QM基因与肿瘤抑制、细胞生长、分化、发育和凋亡等有关,且有极高保守性。     

大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体的构建

[目的]构建大豆疫霉多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因毕赤酵母表达载体。[方法]利用PCR方法从大豆疫霉菌cDNA中扩增多聚半乳糖醛酸酶pspg1基因。用限制性内切酶EcoRI和Not1分别酶切此基因和毕赤酵母表达载体pPIC9K,然后用T4连接酶将目的基因克隆到pPIC9K载体中构建此载体。[结果]扩增的大豆疫霉菌pspgl基因成熟肽片段大小为1250bp。用基因特异性g}物扩增阳性重组子,可得到大小为1200bp的片段。而用载体特异性引物扩增阳性重组子,可得到大小为1200和1700bp两条带,多出来的400bp恰好符合载体部分的大小。将此特异性片段PCR扩增回收,序列测定发现大豆疫霉pspg1基因已经成功地插入到表达载体中。[结论]该研究为进一步研究大豆疫霉菌pspg1基因在毕赤酵母中高效表达奠定了基础。     

鸡新城疫病毒F基因部分片段克隆表达及其抗体制备

[目的]为进一步研究新城疫病毒的分子结构和基因疫苗奠定基础。[方法]用自行设计的l对引物,通过RT-PCR从接毒的SPF鸡胚的尿囊液中克隆了新城疫病毒F基因部分片段,将该基因片段插入含谷胱甘肽(GST)基因的质粒pGEX-4T-1,构建了重组质粒,对提取的融合蛋白进行亲和层析纯化和琼扩、ELISA及W estern-blot检测。[结果]通过克隆和PCR扩增获得新城疫病毒F基因的部分片段,大小为509 bp;对构建的重组质粒pGEX-4T-1-F509经诱导表达,获得分子大小约为44 000 bp的融合蛋白,其中F基因的部分片段大小约18 000 bp;经亲和层析,获得纯化GST-F509融合蛋白,进一步用该蛋白免疫小鼠,制备了鼠源抗鸡新城疫病毒F蛋白抗体。[结论]琼脂扩散试验、ELISA及W estern-blot检测表明,该融合蛋白中的F片段具有良好的抗原性。     

人雌激素相关受体α配体结合域的原核表达载体构建·表达及鉴定

[目的]构建含人雌激素相关受体α配体结合域区段的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。[方法]用Trizol试剂提取人肺腺癌A549细胞总RNA,逆转录为cDNA;应用PCR扩增人EERα-LBD基因片段,插入表达载体pET-30a-c(+)中;转化大肠杆菌BL2 l(DE3)PLysS,经IPTG诱导后表达并鉴定。[结果]应用PCR方法扩增出约687 bp的基因片段,酶切、纯化、连接至载体后,经测序与GenBank中的一致,表达蛋白相对分子质量约32 kD,纯化后用生物大分子相互作用系统鉴定为目的蛋白。[结论]已成功获得人EERα-LBD融合蛋白,为进一步的研究和应用奠定了基础。     

人泛素基因原核表达载体构建、表达及鉴定

[目的]构建含人泛素(Ubiquitin,Ub)基因的原核表达载体,并在大肠杆菌表达系统中表达。[方法]应用PCR扩增人Ub基因片段,插入表达载体pGEX-4T-1中,转化大肠杆菌BL21(DE3)PLysS,经诱导表达及鉴定。[结果]PCR扩增出约228bp的基因片段,克隆至载体后,经测序与GenBank中的一致,表达蛋白相对分子质量约34000,纯化后鉴定为目的蛋白。[结论]已成功获得人Ub蛋白,为进一步的研究和应用奠定了基础。     

广西巴马小型猪SP1基因克隆测序及其真核表达载体的构建

[目的]克隆广西巴马小型猪特异性蛋白1(SP1)基因,并构建其真核表达载体,为揭示其对猪生长发育的调控机理打下基础.[方法]利用RT-PCR从广西巴马小型猪背最长肌组织中扩增SP1基因,采用DNASTAR、TMHMM等分别进行基因生物信息学分析;以pEGFP-N1质粒构建真核表达载体pEGFP-N1-SP1并转染293T细胞,于转染48 h后在倒置荧光显微镜下观察并拍照.[结果]克隆获得的广西巴马小型猪SP1基因与GenBank中野猪(Sus scrofa)的参考序列(XM_005652569.3)一致,未发现碱基突变位点;其编码序列(CDS)全长2340 bp,编码779个氨基酸.广西巴马小型猪SP1蛋白不存在跨膜结构,也不存在信号肽,不属于分泌型蛋白;其二级结构中α-螺旋占17.84%,延伸链占21.31%,β-转角占9.76%,无规则卷曲占51.09%.构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能成功转染至293T细胞中并表达出绿色荧光蛋白.[结论]广西巴马小型猪SP1基因CDS序列编码蛋白主要参与细胞内活动,而非外分泌型蛋白,以SP1基因构建的真核表达载体pEGFP-N1-SP1能转染293T细胞并成功表达,可直接用于后期SP1基因功能探索及干扰表达等研究.     

凡纳滨对虾ATG6基因克隆及其在WSSV感染中的表达

[目的]克隆获得凡纳滨对虾自噬相关基因Lv ATG6 cDNA全长,揭示其组织表达特征及其在白斑综合症病毒(WSSV)感染后的表达变化。[方法]利用PCR方法克隆Lv ATG6,半定量PCR方法检测Lv ATG6在对虾10种组织中的表达情况及WSSV侵染后Lv ATG6在对虾鳃和肝胰脏2种组织中的基因表达变化。[结果]克隆获得Lv ATG6 cDNA全长1 275 bp,编码424个氨基酸,预测蛋白分子量大小为51.5 k D;Lv ATG6基因在凡纳滨对虾10种组织中均有表达,无组织表达特异性;Lv ATG6在病毒感染不同时间的对虾鳃和肝胰脏组织中均出现明显的表达变化。[结论]凡纳滨对虾Lv ATG6及参与的细胞自噬可能在WSSV病毒感染增殖过程中发挥了重要作用,该研究为深入揭示凡纳滨对虾细胞自噬与WSSV病毒作用关系奠定了基础。     

铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛Dendrobium officinale可溶性酸性转化酶基因SAI,分析该基因生物学信息及时空表达特异性。【方法】基于同源序列克隆铁皮石斛SAI基因c DNA全长,采用生物信息学方法进行序列分析,并采用qRTPCR进行组织特异性表达分析。【结果】铁皮石斛SAI基因全长为1 595 bp,c DNA编码区1 368 bp,Genbank登录号为KU598852。该基因编码455个氨基酸,蛋白相对分子质量为50 700。NCBI BLASTx分析表明,该基因氨基酸序列与柑橘Citrus unshiu酸性转化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高,达77%,与其他植物酸性转化酶基因的相似性均高于68%。聚类分析表明,铁皮石斛SAI基因与玉米Zea mays液泡转化酶基因、甘蔗Saccharum officinarum SAI基因亲缘关系最近。该基因编码的蛋白质属于非跨膜结构的亲水性热稳定蛋白,定位于液泡中。SAI基因在2年生铁皮石斛的茎中表达量最高,3年生的叶中表达量最低。【结论】成功克隆铁皮石斛液泡酸性转化酶基因,该基因在铁皮石斛不同组织不同生育时期的表达量差异较大。     

家蚕生物钟基因Bmtim2的克隆与序列分析

[目的]为进一步研究家蚕生物钟基因的功能提供依据。[方法]从家蚕品种p50未受精卵提取总RNA,利用快速扩增cDNA末端(RACE)技术克隆家蚕生物钟基因Bmtim2cDNA序列。最后运用实时定量RT-PCR对该基因在家蚕不同发育时期的表达情况进行初步分析。[结果]利用RACE扩增,获得长度为1867bp、包括完整3'非翻译区的家蚕生物钟基因timeless2(Bmtim2)cDNA序列。经推导,获得该基因序列编码的584个氨基酸残基的蛋白质序列。该蛋白序列具有TIM蛋白的C末端保守区,与黑腹果蝇、尖音库蚊的TIM2基因具有近缘进化关系。Bmtim2基因在家蚕生活周期各时点均有表达。[结论]该结果对研究Bmtim2基因在家蚕发育过程的时空表达差异及其与日周节律的关系具有参考价值。     

猪细小病毒(PPV)SD1株NS1基因的克隆与原核表达

[目的]为建立猪细小病毒的快速诊断方法提供理论依据。[方法]根据GenBank上猪细小病毒基因组序列和原核表达质粒pET30a(+)多克隆位点序列设计1对引物,应用PCR技术扩增出猪细小病毒SD1株NS1基因全序列,对阳性重组质粒进行测序和同源性比较。构建原核表达重组质粒pET 30a/NS1,并在大肠杆菌中进行诱导表达。[结果]通过PCR扩增获得2 208 bp目的片段。所克隆NS1基因与已报道的PPV相应基因的核苷酸同源性为97.3%~99.4%,表明NS1基因具有高度保守性,但在偏3′端连续缺失12个碱基。所克隆的PPVNS1基因在原核细胞中成功表达,其表达产物主要以包涵体形式存在。[结论]SDS-PAGE检测结果表明PPVNS1蛋白的分子量为86 kD。