猪丹毒丝菌SpaA基因原核表达及表达蛋白质的免疫原性分析

旨在克隆表达猪丹毒丝菌SpaA蛋白,分析其免疫原性,为猪丹毒新型疫苗的研发奠定基础。运用PCR扩增SpaA基因,连接至pGEX-6P-1载体,将阳性重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达,SDSPAGE分析表达产物,GST亲和层析纯化融合蛋白质,Western blot鉴定;纯化SpaA蛋白免疫小鼠,间接ELISA检测血清中IgG和Th1、Th2相关细胞因子;不同致病力猪丹毒丝菌攻击免疫小鼠,观察病理组织变化及其免疫保护率。结果显示,猪丹毒丝菌SpaA基因在大肠杆菌中实现表达,获得大小为75ku的纯化目的蛋白质。该蛋白质能特异性识别猪丹毒丝菌抗血清,可诱导小鼠产生较高水平的特异性抗体IgG,并使TNF-β、IFN-γ、IL-5、IL-10含量显著升高,对攻毒菌的免疫保护率均为100%,病理组织变化与攻毒对照组之间差异明显。可见成功获得的重组SpaA蛋白具有良好的免疫原性,能激发机体的体液免疫和细胞免疫,产生较强的免疫保护力,可以作为研发猪丹毒亚单位疫苗的候选抗原。     

猪丹毒疫苗效力检验攻毒冻干培养物的制备与应用研究

为提高猪丹毒疫苗效力检验结果的稳定性、一致性及工作效率,冻干制备了效力检验攻毒用猪丹毒丝菌培养物,对性状、纯粹、真空度、剩余水分、活菌计数、均一性等进行检测,测定在不同温度下短期存放的活菌数,监测在低温下长期保存的活菌数和毒力,并将其应用于猪丹毒活疫苗和灭活疫苗的效力检验。结果显示,该攻毒培养物性状良好,纯粹生长,真空度合格率98.2%,剩余水分小于3.5%,活菌数均值为3.8×10~9 CFU/瓶,瓶间活菌数变异系数(C.V)为10.0%,37℃以下温度存放2.5～3.0 h活菌数稳定,变异系数(C.V)为4.9%,-20℃保存36个月活菌数为3.0×10~9 CFU/瓶,每只小鼠注射6 CFU活菌5/5死亡,应用于猪丹毒灭活疫苗和活疫苗效力检验结果与常规方法一致。结果表明,该猪丹毒丝菌冻干培养物状态良好,活菌数和毒力较为稳定,能够满足猪丹毒疫苗效力检验攻毒使用,且提高了检验结果的一致性、稳定性及工作效率。     

猪丹毒杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立

为建立一种检测猪丹毒杆菌血清抗体的ELISA方法,本研究将猪丹毒杆菌(1a型)云南分离株ZY15074的超声裂解的全菌蛋白作为包被抗原,通过反应条件的优化,建立了猪丹毒杆菌抗体间接ELISA检测方法。特异性试验结果显示该方法与猪其它10种常见病原阳性血清均无交叉反应。该方法对阳性血清的敏感性为1/256。重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于10%。对160份临床血清样品比对试验结果显示该方法与国外间接ELISA方法的符合率为90.6%。本研究建立的间接ELISA方法具有较好的特异性、敏感性和重复性,可以用于猪丹毒杆菌血清抗体检测和流行病学调查。     

猪丹毒丝菌CbpB蛋白对小鼠的免疫效果分析

探究猪丹毒丝菌（ER）CbpB蛋白的免疫原性和保护作用,为深入研制ER基因工程亚单位疫苗提供新的思路和技术储备。以表达的ER重组蛋白CbpB、SpaA、CbpB+SpaA以及ER灭活全菌体（V-AEr21）、商品化弱毒疫苗、商品化灭活疫苗分别免疫小鼠。利用间接ELISA检测小鼠血清中IgG抗体,血清杀菌试验测定功能性抗体水平,攻毒试验测定免疫保护率,组织荷菌数试验测定ER定植情况,并采集小鼠组织脏器（脾、肺、肝、肾）制备切片,观察病理变化。结果显示：与免疫原性最优的商品化弱毒疫苗相比,CbpB和SpaA虽产生的IgG抗体均仅为1∶6 400,但血清杀菌效果强;对小鼠的免疫攻毒保护率与商品化弱毒疫苗相同,均为100%,且在脾、肺、肝、肾组织中均无细菌定植,病理组织学观察与空白对照无明显区别。CbpB重组蛋白具有良好的免疫原性和保护作用,能刺激机体产生体液免疫和细胞免疫,可以作为猪丹毒基因工程亚单位疫苗的候选抗原。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。     

猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

为检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)特异性分泌性Ig A (PEDV SIg A)抗体,本研究以纯化的PEDV粒子作为包被抗原,以待检初乳或直肠拭子处理样品为检测样品,以HRP标记的鼠抗猪SIg A分泌成分(SC)的单克隆抗体(MAb)为酶标二抗,经过各条件优化,建立了检测初乳和直肠黏膜中PEDV SIg A的间接ELISA方法。并对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,PEDV粒子的最佳包被浓度为5.8 ng/孔,HRP标记的鼠抗猪SC抗体的最佳稀释度为1∶3 000。该方法与TGEV、Po RV感染的初乳样品无交叉反应,特异性较强。当初乳的稀释度在1∶6 400时,该ELISA方法检测结果仍为阳性,敏感性较高;批内和批间重复试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。该方法的建立为研究猪群感染PEDV和PEDV疫苗免疫后特异性SIg A水平及黏膜免疫评价提供了有效的技术手段,具有很好的应用前景。     

基于单克隆抗体的O型口蹄疫病毒抗体固相竞争ELISA检测方法的建立

为建立评价O型口蹄疫病毒(FMDV)疫苗免疫水平的方法,本研究以单克隆抗体(MAb)3D9为捕获抗体,以HRP标记的MAb 8E8作为检测MAb,经过条件优化建立了基于MAb的检测O型FMDV抗体的固相竞争ELISA(SPCE)方法。对该方法进行了特异性、敏感性、重复性试验。结果显示,MAb 3D9的最佳稀释度为1:25 000,灭活O型FMDV抗原的最佳稀释浓度为1:3,HRP标记的MAb 8E8的最佳稀释度为15 000,当血清1:32稀释时,检测的临界值确定为45%。该方法分别检测A型FMDV抗体阳性参考血清以及牛冠状病毒、牛轮状病毒以及猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒、猪圆环病毒、猪瘟病毒的标准阳性血清,检测结果均为阴性,未出现交叉反应。经检测,当阳性标准血清的抗体稀释度在1:512时,该方法仍具有较好的敏感性;批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,表明其重复性较好。并将该方法与液相阻断ELISA(LPBE)方法和病毒中和试验(VNT)的相关性进行了比较,结果显示该方法与LPBE和VNT的相关性分别为0.896和0.923。本研究为国内评价O型FMDV疫苗免疫水平建立了一种新的方法。     

用冻干菌液进行猪丹毒、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗效力检验的研究

在猪丹毒、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗的效力检验中,需要进行动物攻毒保护试验。传统方法使用的是2~8 ℃保存的新鲜菌液对试验动物进行攻毒。本研究中使用的是低温保存的冻干菌液,并对冻干保存的菌数进行了测定和优化。结果表明,冻干保存的菌液能达到新鲜菌液同等的检验结果。同时,对冻干菌液保存期进行试验验证,发现细菌存活状态稳定。因此,在猪丹毒、多杀性巴氏杆菌病二联灭活疫苗效力检验中,可将新鲜的攻毒菌液冻干保存,用于攻毒保护试验,以避免每次繁重的新鲜菌液前期准备工作,并克服活菌数衰减所造成的检验结果不准确等问题。     

狂犬病毒G蛋白原核表达及间接ELISA检测方法的建立

目前狂犬病疫苗的效力检验采用NIH法,需要使用狂犬病毒CVS-24毒株进行攻毒试验,具有一定的生物安全风险。为寻求替代NIH法中脑内攻毒试验的方法,研究扩增狂犬病毒G蛋白基因,并将其克隆至大肠杆菌pET-32a载体上进行表达,以该蛋白作包被抗原,摸索试验条件,建立了检测小鼠血清抗体效价的间接ELISA方法。使用此方法与国际公认的荧光抗体病毒中和试验(FAVN)法比较,两者检测结果曲线相关系数为0.986,表明相关性较好,但ELSIA方法更加快捷、简便。本试验建立的间接ELISA方法可用于检测小鼠血清中狂犬病抗体,为狂犬病毒血清抗体测定和单克隆抗体筛选提供依据。     

猪丹毒丝菌SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立和评价

为建立猪丹毒丝菌的快速检测方法,本研究根据猪丹毒丝菌荚膜多糖的保守区域设计特异性引物,通过优化反应体系建立了检测猪丹毒丝菌SYBR Green I荧光定量PCR方法。并对人工感染小鼠和临床病例样品进行检测。结果显示,质粒标准品在5.52×10~8拷贝/μL～5.52×10~2拷贝/μL范围内呈良好的线性关系;该方法与其它6种猪常见细菌均无交叉反应;最低可检测到20拷贝/μL的阳性质粒标准品,比普通PCR方法敏感性高100倍;批内和批间变异系数均小于3%。本研究建立的SYBR Green I荧光定量PCR方法特异性强、灵敏度高、稳定性好,可以用于猪丹毒的早期诊断和生产实际中大批量临床样品的猪丹毒丝菌检测。     

猪毛色遗传的研究进展

本文概述了猪的毛色类型、猪的毛色遗传模式,着重综述了猪毛色基因分子基础的研究进展,指出存在问题并就未来发展方向做了思考。     

鸡败血支原体垂直传播模式及其阻断方法

以国际标准强毒Ｒ株人工感染非免疫产蛋鸡,定时扑杀,分别从鼻窦、眶下孔、气管、肺、气囊、卵巢和输卵管分离ＭＧ,并收集感染鸡所产蛋分离ＭＧ。结果表明,人工感染４８小时后上、下呼吸道及肺已被全面感染,９６小时气囊已被感染,１２０小时输卵管已能分离到ＭＧ,卵巢始终分离不到ＭＧ。人工感染鸡自１４４小时便能在其所产蛋中分离出ＭＧ。药物治疗能在７２小时内消除感染,油乳剂苗则需２４天后逐渐降低蛋内ＭＧ分离率,药物卵内注射、种蛋药浴、高温处理均能杀死卵内ＭＧ,但以研制的种蛋浸泡剂药浴效果为最好。     

不同样本商品蜂蜜中硒含量的测定

用硝酸和高氯酸消化蜂蜜,使硒游离出来,在微酸性环境下,硒和2,3-二氨基萘(DAN)生成有较强荧光的物质,用环己烷萃取,在激发波长378nm,荧光波长518nm处测定其荧光强度。蜂蜜中硒含量范围:0.10～0.82μg/g。表明:蜂蜜应视为天然富硒营养品。     

两种绿头鸭肌肉营养成分分析及评价

本试验旨在研究两种绿头鸭（白羽绿头鸭和绿头鸭）肌肉营养组成和价值,为绿头鸭肉产品的开发利用提供基础数据和理论依据。选择白羽绿头鸭和绿头鸭60只（每个品种各30只,公母各半）,依照国家标准测定胸肌粗蛋白质、粗脂肪、胆固醇含量及氨基酸、脂肪酸、微量元素和维生素的组成和含量,并对胸肌进行氨基酸评价及脂肪酸营养价值评价。结果显示,白羽绿头鸭肌肉粗蛋白质含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;两种绿头鸭肌肉中均检测到17种含量大于0.01%的氨基酸,其中白羽绿头鸭肌肉苏氨酸、组氨酸、丝氨酸和脯氨酸含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,赖氨酸、谷氨酸和精氨酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到13种含量均大于0.01%的脂肪酸,其中白羽绿头鸭硬脂酸和油酸含量显著低于绿头鸭（P<0.05）;检测到9种矿物质元素（钠、镁、钾、钙、锰、铁、铜、锌和硒）,两种绿头鸭差异不显著（P>0.05）;检测到8种维生素,白羽绿头鸭肌肉维生素B₁含量显著高于绿头鸭（P<0.05）,维生素D和维生素E含量显著低于绿头鸭（P<0.05）。两种绿头鸭肌肉氨基酸比例接近世卫组织推荐的理想模式,富含人体所需的矿物质元素和维生素,具有广阔的开发利用前景。     

乳酸杆菌益生作用机制的研究进展

乳酸杆菌作为益生菌广泛用于人和动物。本文综述了乳酸杆菌改善宿主健康的机制。乳酸杆菌可通过产生抗菌物质如乳酸、过氧化氢、细菌素,或者通过竞争营养或肠道黏附位点来抑制致病菌;通过诱导黏附素的分泌或阻止细胞凋亡而增强肠道的屏障功能,从而保护肠道。文章重点讨论了乳酸杆菌表面成分（表面蛋白、脂磷壁酸和肽聚糖）与肠道受体（Ｃ型凝集素受体、Ｔｏｌｌ样受体和 Ｎｏｄ样受体）,阐述了他们结合后启动免疫调节信号,调控肠道免疫功能以发挥改善健康作用的机制。     

Comparison of four techniques of arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint of the horse

Reasons for performing study: Clinical experiences indicate that centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint is often unsuccessful. Objective: To determine the accuracy of 2 published and 2 unpublished techniques of centesis of the lateral compartment of the femorotibial joint. Hypothesis: It was hypothesised that a drug can be administered into the lateral compartment of the femorotibial joint via a diverticulum of this joint that surrounds the medial aspect of the long digital extensor tendon and that this technique is more accurate than described techniques of centesis of this compartment. Methods: Twenty‐four stifles of 12 horses were divided equally into 4 groups and a radiocontrast medium injected into the lateral compartment of the femorotibial joint of each group using a hypodermic needle inserted: 1) caudal to the lateral patellar ligament and proximal to the tibial plateau, 2) caudal to the long digital extensor tendon and proximal to the tibial plateau, 3) between the long digital extensor tendon and bone of the extensor groove of the tibia or 4) directly through the long digital extensor tendon until it contacted bone. Twelve veterinary students who had no experience using any of these techniques performed the injections. Accuracy of each technique was determined by examining radiographs obtained after injecting the contrast medium. Results: The most successful technique for arthrocentesis was by inserting a needle through the long digital extensor tendon. This approach was successful in all attempted cases, whilst other techniques had lower rates of success. Conclusions: The lateral compartment of the femorotibial joint can be accessed accurately by inserting a needle through the long digital extensor tendon as it lies within the extensor groove. Other techniques may not be as accurate for clinicians inexperienced in arthrocentesis of the lateral compartment of the femorotibial joint.     

商会自治的基石——商会自治规范研究

在现代法律秩序中,商会自治规范是制定法的基础和必要的补充,甚至在某些方面替代了制定法;商会自治规范主要包括商会组织规范、行为规范、惩罚规范以及争端解决规范等;其效力仅及于其内部成员;商会自治规范和制定法之间存在冲突,但也存在整合的基础。     

Prevalence of diseases of the spinal cord of cats

A retrospective review of records of 205 cats with histologically confirmed disease of the spinal cord was performed to identify the prevalence of disease in this nonrandomly selected population of cats. Clinical records were reviewed, and age, duration of neurologic illness, and clinical and histopathologic findings in cats with spinal cord disease were abstracted. Disease processes were classified into 7 categories and 23 groups. The most common diseases affecting the spinal cord of cats were feline infectious peritonitis (FIP), lymphosarcoma (LSA), and neoplasia of the vertebral column secondarily affecting the spinal cord. Information on age, onset and duration of clinical signs, and lesion localization at the postmortem examination in cats belonging to the 7 categories of disease were analyzed to create a practical list of differential diagnoses. Cats were also subcategorized into 3 groups based on their age at death. FIP was the most common disease of cats younger than 2 years of age. LSA and vertebral column neoplasia were the most common diseases affecting cats between 2 and 8 years of age. Vertebral column neoplasia was the most common disease affecting cats older than 8 years of age. Results of this histopathologic study showed that FIP and LSA were the most common disease processes affecting the spinal cord of cats. However, at least 21 other groups of diseases and their relative prevalence were identified.     

高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留量的不确定度评定

根据JJF1059-1999《测量不确定度评定与表示》建立了高效液相色谱法测定鸡肉中土霉素残留测量的不确定度评定方法,评定过程包括建立测量程序、分析不确定度来源、对不确定度分量进行量化。将不确定度归类为两大类。随机效应导致的不确定度可以通过一系列具有统计意义的重复观测值进行A类评定;系统效应导致的不确定度通过各测量器具、设备的说明书、校准证书提供的参数进行B类评定。本方法鸡肉中土霉素残留量的相对合成标准不确定度约为3.9%。     

几个柑橘品种实生苗的抗旱性评价研究

以5个金柑属品种、枳壳、软枝酸橘及广西土柠檬实生苗为材料,进行复水成活率、旱害指数、叶片相对含水量、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、脯氨酸等生理指标及隶属函数的综合分析,为柑橘抗性砧木品种选育提供参考。结果表明：胁迫20d复水后的成活率融安滑皮金柑和长寿金柑最高,为100%,软枝酸橘最低,为88.9%;随着干旱胁迫加剧,各品种的旱害指数呈上升趋势,长寿金柑的旱害指数最低,为0.25,软枝酸橘的旱害指数最高,为0.61;从叶片相对含水量的结果来看,长寿金柑的变化幅度最小,软枝酸橘的变化幅度最大,在第18d时分别为61.19%和37.85%;3种保护酶之间相互协同作用减轻植株受害程度,其活性变化幅度与丙二醛和脯氨酸的含量变化相似。利用隶属函数法综合分析,得出各品种的抗旱性强弱依次为长寿金柑>枳壳>融安滑皮金柑>融安金柑>山金柑>广西土柠檬>金枣>软枝酸橘。