木薯块根总RNA提取方法的比较和改进

[目的]为更好地利用基因操作手段改良木薯品质和提取高质量的木薯总RNA提供科学依据。[方法]采用4种方法提取木薯块根RNA,筛选一种最简单、有效的方法,并利用RT-PCR技术克隆木薯淀粉分支酶,分析所提取RNA的质量。[结果]结果表明,用改进的CTAB法和plant RNAReagent kit均能提取高质量的RNA,用plant RNAReagent更能节省时间,而且纯度比较高。对plant RNAReagent提取的RNA进行RT-PCR克隆,克隆出了与木薯淀粉合成有关的SBEII基因。[结论]plant RNAReagent kit提取的RNA,其质量可以满足基本的试验要求。     

木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆

[目的]克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据.[方法]根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列.运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析.[结果]克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566 bp,其中包括1566 bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽.其理论蛋白质分子量57.01 kDa,等电点6.1,呈酸性.多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87％、87％和86％.结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性.蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角.[结论]木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性.     

何首乌查尔酮合成酶基因的克隆及序列分析

[目的]克隆何首乌查尔酮合成酶基因并作序列分析。[方法]以cDNA序列的保守区域设计引物,以何首乌 （ Polygonum multiflorum Thunb.）为材料,根据其他植物查尔酮合成酶（Chaleone synthase,CHS）基因eDNA序列的保守区域设计引物,利用RT-PCR和3＇-RACE进行克隆。[结果]从何首乌叶cDNA中克隆出了长度为1258bp的基因片段。序列分析表明,该片段具有典型的CHS基因家族的结构域,为何首乌的CHS基因片段,命名为PmCHS。将得到的序列提交GenBank,序列号为FJ601685。对获得的PmCHS的氨基酸序列进行比较分析,发现PmCHS含有Phe215,推测其能够催化聚酮的合成反应。何首乌CHS与其他植物CHS的氨基酸序列的进化分析表明,其与同为蓼科的虎杖和掌叶大黄的同源性较近。[结论]何首乌查尔酮合成酶基因的成功克隆为蓼科植物中蒽醌的基因工程等研究打下了良好的基础。     

马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长克隆及序列分析

[目的]分离克隆马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长.[方法]根据其他松科植物α-蒎烯合成酶基因保守区域设计引物,扩增出基因的部分片段,再结合RACE技术分别扩增出基因3’端和5’端序列,通过序列拼接获得cDNA全长,结合生物信息学软件分析该基因编码蛋白的特性.[结果]马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长为2 103 bp,编码区1 980 bp,编码629个氨基酸,含有1个N端结构域、1个金属结合结构域和1个天冬氨酸富集基序（DDMYD）.[结论]该方法成功克隆了马尾松α-蒎烯合成酶基因cDNA全长序列,具有单萜烯合成酶基因的典型特征,序列提交至GenBank,获得登录号KF547035.     

紫杉醇合成途径中紫杉烯合成酶cDNA的克隆

从南方红豆杉（Taxus chinensis var. mairei）愈伤组织提取总RNA，根据已发表的中国红豆杉紫杉烯合成酶cDNA序列设计两对引物，通过RT-PCR技术扩增出该酶5’端长度为1201bp和3’端长度为1388bp的两个cDNA片段，将其克隆到pGEM-T Vector上并转化到E. coli DH5α中， 5’端片段经XbaⅠ和BglⅡ双酶切鉴定，3’端片段经BglⅡ和SacⅠ双酶切鉴定后，对阳性克隆进行序列测定，证实确为紫杉烯合成酶基因。将这两个cDNA片段拼接到一起，得到全长2589 bp的紫杉烯合成酶基因，编码862个aa，与中国红豆杉紫杉烯合成酶基因具有98%的同源性。两片段与双元载体pCAMBIA1300以T4 DNA连接酶连接并转化到E. coli DH5α中，经XbaⅠ和SacⅠ双酶切鉴定，证实紫杉烯合成酶cDNA全长连接成功并插入到pCAMBIA1300中，为下一步的转基因工作做好了准备。     

从Raji细胞克隆IL-10基因

[目的]探索一种简便可行的白细胞介素-10(IL-10)基因的克隆方法。[方法]以人Burkitt’s淋巴瘤细胞系Raji细胞为材料,提取培养的Raji细胞中的总RNA。根据GenBank中人IL-10基因序列设计1对特异性引物,用RT-PCR方法扩增人IL-10基因的编码cDNA。回收目的片段,将其与pMD18-T载体连接并转化到大肠杆菌感受态细胞DH5α,构建该基因的重组质粒。重组质粒经PCR和双酶切鉴定后进行测序。[结果]以骨髓细胞组织总RNA为模板进行RT-PCR,可从Raji细胞中获得了预期的约550bp特异性条带。成功构建了IL-10基因的重组质粒,PCR扩增和双酶切的鉴定结果说明该插入片段可能为IL-10cDNA。从获得的阳性克隆中挑选1个菌落来分析重组质粒的插入DNA片段序列。序列分析结果证实其与报道的IL-10基因的序列一致。[结论]该研究为IL-10的重组表达及其生物学活性分析奠定了基础。     

木薯MeSSSⅣ基因启动子克隆及序列分析

木薯是热带典型的高淀粉、抗逆、抗旱作物。可溶性淀粉合成酶（SSS）是植物淀粉合成过程中的关键酶之一。根据已发表的拟南芥SSS郁基因序列,通过同源比对从木薯AM560、KU50基因组中获得木薯MeSSS郁基因的cDNA序列以及该基因部分启动子序列,设计特异引物,从木薯栽培种KU50基因组DNA中克隆了MeSSS郁基因系列1068bp（该序列包含978 bp的启动子调控序列及90bp的基因编码序列）。序列分析表明,启动子调控序中除含有典型的真核生物核心启动子区域外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与脱水、激素和光响应相关的顺式作用元件,特别是发现CGACGOSAMY3、DOFCOREZM尧SREATMSD、SURE等与糖信号相关的重要顺式元件,这些元件预示MeSSS郁基因的表达可能与糖信号相关遥以上结果说明,MeSSS可能参与木薯多种代谢过程,其表达可能受多种调控因子的调节。     

索式桃花水母全长cDNA文库的构建

[目的]构建索式桃花水母的全长cDNA文库,为桃花水母的生长、发育、衰老过程功能基因的进一步筛选、克隆和表达奠定基础。[方法]利用RNAiso试剂盒提取桃花水母的总RNA,采用SMART技术合成全长cDNA,经SfⅠi酶切消化后,将cDNA克隆到质粒载体pDNR-LIB,并对cDNA文库进行质量评价。[结果]经鉴定,原始文库的滴度为7.9×10^5cfu/ml,库容量约为1.0×10^6cfu。随机挑取28个克隆,经PCR快速鉴定,插入片段大小在0.5～2.5kb,平均大小在1.0kb左右,重组率达94%,表明获得了高质量的桃花水母cDNA文库。[结论]该试验成功构建了桃花水母cDNA文库,其cDNA原始文库的库容,根据真核生物能够满足建库的要求,同时文库的cD-NA插入片段序列是完整的,从而证实构建的文库质量较好,可以用于桃花水母目的基因的筛选。     

木薯MeSSSIV基因启动子克隆及序列分析

木薯是热带典型的高淀粉、抗逆、抗旱作物.可溶性淀粉合成酶(SSS)是植物淀粉合成过程中的关键酶之一.根据已发表的拟南芥SSSⅣ基因序列,通过同源比对从木薯AM560、KU50基因组中获得木薯MeSSSⅣ基因的cDNA序列以及该基因部分启动子序列,设计特异引物,从木薯栽培种KU50基因组DNA中克隆了MeSSSⅣ基因系列1068 bp(该序列包含978 bp的启动子调控序列及90 bp的基因编码序列).序列分析表明,启动子调控序中除含有典型的真核生物核心启动子区域外,还含有多个TATA-box、CAAT-box等启动子元件以及多种与脱水、激素和光响应相关的顺式作用元件,特别是发现CGACGOSAMY3、DOFCOREZM、SREATMSD、SURE等与糖信号相关的重要顺式元件,这些元件预示MeSSSⅣ基因的表达可能与糖信号相关.以上结果说明,MeSSSⅣ可能参与木薯多种代谢过程,其表达可能受多种调控因子的调节.     

牛脂联素cDNA全基因序列的克隆

[目的]体外克隆牛脂联素基因的编码全序列。[方法]以成牛尾部脂肪的总RNA为模板,通过RT-PCR扩增获得牛脂联素基因cDNA的全序列,将其克隆到原核表达载体PMD18-T中,筛选出阳性克隆,提取重组质粒,通过限制性内切酶酶切鉴定和重组质粒PCR鉴定后对其进行测序。[结果]从牛尾部脂肪组织总RNA中扩增得到671bp的目的条带,该cDNA序列与GenBank中牛脂联素基因序列同源性为100％,其氨基酸同源性也达到100％,确定为目的基因。[结论]该研究为进一步研究牛脂联素基因的功能和研究牛脂联素基因的表达与育肥牛的脂肪代谢的关系提供了试验基础。     

元宝枫CHS基因片段的克隆及序列分析（英文）

[目的]对元宝枫叶片查尔酮合成酶(CHS)基因片段进行克隆及序列分析。[方法]以元宝枫的红叶新品系1~6号为试材,采用CTAB法提取其夏季与秋季叶片总RNA,搜索Gen Bank数据库中已报道的CHS基因序列,BLAST比对,然后用DNAMAN、Primerpremier5软件设计兼并引物来扩增其目的片段,采用RT-PCR方法扩增CHS基因片段并连接到p MD18-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序。[结果]得到一段1 365 bp的序列,序列分析表明,该片段编码365个氨基酸,与鸡爪槭、毛果槭的查尔酮合成酶(CHS)基因核苷酸序列同源性在90%以上。[结论]该研究首次从元宝枫中克隆出了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础。     

薄壳山核桃MADS-box基因保守片段的克隆与序列分析

[目的]克隆薄壳山核桃MADS-box基因的保守片段,进行系统发育分析,为研究薄壳山核桃花发育相关MADS-box家族基因及其发育的分子机理奠定基础.[方法]以薄壳山核桃品种‘马罕’雄花花序为材料,提取总RNA反转录cDNA,采用RT-PCR克隆MADS-box基因的保守片段,并将其推导氨基酸序列与已知拟南芥的MADS-box家族基因进行系统发育分析.[结果]分离获得28条MADS-box基因的cDNA片段,片段长度均为137 bp,包含基因起始密码子,核苷酸序列同源性为65.7%~98.5%,其推导氨基酸序列中有11个存在差异.系统发育树分析结果表明,这些基因片段分别归入拟南芥MADS-box基因不同亚家族中,包含ABCDE模型中的各类基因.[结论]薄壳山核桃中存在多种MADS-box家族基因,克隆的片段包含ABCDE模型中的各类花发育基因.     

中华补血草Syntaxin基因的克隆(英文)

[目的]对中华补血草Syntaxin基因进行克隆。[方法]以中华补血草叶片为材料,提取总RNA并进行反转录反应。依据已知Syntaxin基因5’端EST序列信息设计巢式引物,以反转录得到的cDNA为模板,利用2轮PCR扩增cDNA3’末端(3’RACE),获得Syntaxin基因3’端序列。[结果]获得1090bp的DNA片段。分析表明,该片段编码LsSyntaxin全长基因,其中开放阅读框长816bp,编码271个氨基酸。该基因编码的Syntaxin蛋白相对分子量为30254.3Da,理论等电点为5.55。[结论]为研究Syntaxin基因在补血草中的功能及其在补血草泌盐过程的作用奠定了基础。     

中华补血草Syntaxin基因的克隆

[目的]对中华补血草Syntaxin基因进行克隆。[方法]以中华补血草叶片为材料,提取总RNA并进行反转录反应。依据已知Syntaxin基因5'端EST序列信息设计巢式引物,以反转录得到的cDNA为模板,利用2轮PCR扩增cDNA3'末端(3'RACE),获得Syntaxin基因3'端序列。[结果]获得1090bp的DNA片段。分析表明,该片段编码LsSyntaxin全长基因,其中开放阅读框长816bp,编码271个氨基酸。该基因编码的Syntaxin蛋白相对分子量为30254.3Da,理论等电点为5.55。[结论]为研究Syntaxin基因在补血草中的功能及其在补血草泌盐过程的作用奠定了基础。     

元宝枫CHS基因片段的克隆及序列分析

[目的]对元宝枫叶片查尔酮合成酶(CHS)基因片段进行克隆及序列分析.[方法]以元宝枫的红叶新品系1～6号为试材,采用CTAB法提取其夏季与秋季叶片总RNA,搜索GenBank数据库中已报道的CHS基因序列,BLAST比对,然后用DNAMAN、Primerpremier5软件设计兼并引物来扩增其目的片段,采用RT-PCR方法扩增CHS基因片段并连接到pMD18-T载体上,阳性克隆经PCR检测后进行测序.[结果]得到一段1 365 bp的序列,序列分析表明,该片段编码365个氨基酸,与鸡爪槭、毛果槭的查尔酮合成酶(CHS)基因核苷酸序列同源性在90％以上.[结论]该研究首次从元宝枫中克隆出了CHS基因,为有效利用该基因奠定了基础.     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆与过表达载体的构建

【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米（Waxycorn）新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。     

猪Ghrelin基因真核表达载体构建(英文)

[目的]为研究转生长相关基因对猪的作用。[方法]采用RT-PCR方法,从13/17罗伯逊易位杂合子猪小肠组织中提取总RNA,将其纯化后作为PCR扩增模板,参考GenBank公布的猪Ghrelin的mRNA序列设计合成具有Nhe I和Hind III双酶切位点引物,扩增获得Ghrelin基因cD-NA全长序列。将准确的Ghrelin基因片段克隆于 pMD19-T simple Vector后进行序列分析,获得猪Ghrelin基因cDNA全长基因片段。经Nhe I和Hind III双酶切,将 Ghrelin基因cDNA片段连接到真核表达载体pEGFP-N1,获得真核表达载体的重组质粒pEGFP-Ghrelin。重组质粒转染猪成纤维细胞,观察标记基因荧光蛋白的表达。[结果]13/17罗伯逊易位杂合子猪的Ghrelin基因与已发表的序列相同,并成功获得具备猪Ghrelin基因全长cDNA序列的真核表达载体pEGFP-Ghrelin。[结论]构建的真核表达载体可以用于转基因猪的进一步试验,同时也为研究Ghrelin的调节机制奠定基础。     

简并引物设计与大戟科3种植物WAX基因片段的克隆

在大戟科3种重要经济植物木薯、蓖麻、小桐子中,扩增WAX基因片段。利用CODEHOP方法设计简并引物,同时在3种植物中提取高质量的总RNA并反转录为cDNA,结果扩增在3种植物中得到特异性片段,克隆测序,并采用生物信息学技术进行序列分析。结果证明CODEHOP简并引物设计科学。同时证明WAX基因的保守性较高,在大戟科3个物种中同时得到了WAX基因片段序列信息,具有较高同源性。为以后WAX基因研究奠定重要基础。     

峨边花牛肌肉生长抑制素基因cDNA克隆及序列分析

[目的]为改良峨边花牛地方品种、提高产肉率及种质资源的保存奠定基础和提供技术依据。[方法]以从乐山峨边花牛骨骼肌中提取总RNA为模板,利用RT-PCR技术扩增获得肌肉生长抑制素基因(MSTN)cDNA片段,将其克隆到T载体上,通过PCR鉴定阳性克隆并对其进行测序鉴定。[结果]通过PCR扩增,得到峨边花牛MSTN基因cDNA的全序列,全长1 135 bp,包含全部的MSTN编码序列,共有3个外显子。将峨边花牛MSTN基因在GenBank上与比利时双肌牛及皮埃蒙特双肌牛比较后发现,峨边花牛在上述2种品种双肌牛的突变位点碱基未发现异常。[结论]成功地克隆峨边花牛的MSTN基因并对其进行测序对于后期表达载体的构建奠定了基础。     

刺梨RNA的有效提取及Actin基因片段的克隆

[目的]为刺梨的分子生物学研究奠定技术基础。[方法]分别采用改进的CTAB-LiCl法和CTAB法提取刺梨果实中的总RNA和基因组DNA。对刺梨总RNA进行反转录,生成cDNA第1链。根据GenBank上的蔷薇科肌动蛋白(Actin)基因保守序列设计1对跨内含子引物Actin1和Actin2,以cDNA第1链和基因组DNA为模板进行RT-PCR扩增。将含有目的片段的凝胶进行回收纯化,克隆到PMD18-T载体上,转化大肠杆菌TG1感受态细胞,选取带有目的片段的重组质粒进行测序和序列分析。[结果]将目的片段回收后克隆于T载体,可获得298 bpActin基因的cDNA序列。克隆所得核苷酸序列与蔷薇、桃和葡萄的核苷酸序列相似性达83%,与富士苹果、甜菜等的相似性也超过80%。刺梨Actin基因编码的氨基酸序列与梨的相似性最高(达97%),其次是葡萄、花生、大豆、棉花和马铃薯,而与水稻、拟南芥等的相似性也达90%以上。[结论]Actin基因跨内含子,用该Actin基因片段作内标可以减少DNA污染。