湖南柑橘溃疡病菌的多态性鉴定及致病力分析

采集湖南省6个柑橘产区的呈现典型溃疡病症状的柑橘叶片、枝条或果实样品26份，分离溃疡病菌株，采用柑橘溃疡病特异性引物鉴定、细菌保守的16S rDNA序列分析及重复序列PCR基因指纹分析(Rep–PCR)方法，分析具有地域代表性的12个菌株间基因组多态性。结果显示，12个菌株在BOX–PCR和ERIC–PCR中扩增出相同数量的多态性条带，无法通过Rep–PCR对菌株进行区分；串联重复位点多态性分析表明，CCB–2、CCB–3和CCB–10 这3个菌株在GT1位点上出现片段大小多态性；通过活体注射接种方式，将12个溃疡病菌株接种至冰糖橙叶片，结果CCB–2和CCB–4菌株表现出较稳定致病力，综合病情指数达到75%以上，表明CCB–2相比其他11个菌株可能在基因组序列水平存在多态性，且影响菌株的致病力水平。     

利用CODEHOP设计简并引物克隆镰刀菌果胶酶基因片段

利用CODEHOP(Consensus-degenerate hybrid oligonucleotide primers)设计真菌果胶酶基因片段的简并引物,并对设计的多对引物进行筛选,比较了普通PCR和Touchdown-PCR(TD-PCR)程序的扩增效果,并对产物进行了测序、比对和分析。结果表明:利用CODEHOP设计简并引物可信性强,阳性率高,能够从供试菌株中获得与目的片段大小相近的产物。利用TD-PCR程序扩增比普通PCR扩增效果好。扩增产物序列BLASTX比对和分析结果表明,产物片段编码的氨基酸序列与镰刀菌属来源的果胶酶氨基酸片段相似性均超过90%,说明所扩增的序列即为镰刀菌果胶酶基因片段。     

台湾柠檬上柑橘溃疡病菌的分离鉴定

从送检台湾柠檬样品上发现疑似柑橘溃疡病病斑,对病原菌进行了分离纯化,并且通过形态学特征观察、致病性测定、特异性引物扩增和gyr B序列比对分析,对其进行了鉴定。结果显示,菌株6503在NA培养基上菌落呈黄色,圆形,全缘,有光泽,微隆起,黏稠;致病性测定结果显示,分离物6503能够导致柑橘叶片产生明显的溃疡病斑;柑橘溃疡病菌种特异性引物Xac01/Xac02从菌株6503的DNA中扩增得到581 bp的特异性条带;基于gyr B序列构建的系统发育树中6503和柑橘溃疡病菌处于同一分支,亲缘关系最近。根据试验结果,菌株6503被鉴定为柑橘溃疡病菌。     

草菇菌种退化相关分子标记的筛选

【目的】基于SRAP分子标记技术,筛选出与草菇(Volvariella volvacea)菌丝退化性状紧密连锁的分子标记,为进一步研究目标性状基因的克隆与功能奠定基础。【方法】以草菇正常生长菌株V51(对照)与其菌丝退化菌株(VNM1~10)为材料,采用群体分离分析法分别构建2种草菇的近等基因池。利用SRAP分子标记技术,寻找两类菌株的差异片段,回收差异片段后与pMD-18T载体连接,构建重组质粒pMD-VNMDF并转化E.coli DH5α感受态细胞,将筛选的阳性克隆测序。根据差异片段序列设计引物,将其转化成SCAR分子标记,并对草菇正常菌株V51及其菌丝退化菌株VNM进行扩增试验,验证该标记的真实性和可靠性。【结果】81对SRAP引物组合中有2对引物可扩增出稳定差异条带,其中引物对Me8-Em4PCR扩增出长度约300bp的差异条带(命名为VNMDF)存在于退化菌株中。对SRAP分子标记片段VNMDF回收、测序并进行序列分析发现,该片段长度为279bp,其核酸、氨基酸序列与编码26S蛋白酶体亚基的相似性分别达到81%和93%。利用SCAR特异引物对SCAR250可在菌丝退化菌株中稳定扩增出长度约250bp片段,与预期大小(279bp)一致,而在正常菌株中未扩增出此片段。【结论】获得了1条可能与草菇菌丝退化性状基因紧密连锁的SRAP分子标记,并将其成功转化为SCAR标记(SCAR250)。     

PCV2的PCR鉴定及其相关序列分析

设计合成了2条猪圆环病毒2型(porcine circovirus type2)PCR引物,对杭州地区发现的PCV2可疑病例进行PCR鉴定,并优化了PCR反应条件,进行了敏感性、特异性试验,对其扩增序列进行测序比较.结果显示,用所设计的2条引物成功扩增了PCV2基因片段,PCV2基因片段序列与参考序列相似性达到91.2%.说明所设计的引物用来检测临床病理中PCV2是准确可行的.对杭州地区的56份病料的检测结果:感染率为57%,表明杭州地区的感染已经比较严重.     

金针菇子实体颜色基因的分子标记

用群体分离分析法从200个随机引物中筛选出S375,其扩增片段与金针菇子实体白色基因连锁.对S375扩增片段两端测序,以该序列为依据合成一对特征序列扩增区域(SCAR)引物,它能对带有白色基因的菌株扩增出单一片段,多聚酶链反应(PCR)产物不需电泳、加EB后可在紫外灯下直接检测.     

猞猁GH基因部分序列及其5＇端调控区的克隆与分析

根据已报道的哺乳动物GH基因序列设计一对引物,利用PCR技术直接扩增猞猁GH基因部分序列和5＇端调控区序列,将PCR产物克隆到质粒pUC19的HincⅡ位点,重组子经HindⅢ/Eco R I双酶切鉴定和序列分析,扩增片段长度为783 bp.测序结果与其它报道的哺乳动物GH基因对应片段比较,5＇端侧翼序列和第一外显子高度保守,第一内含子和部分第二内含子存在89%同源性,且第二个外显子中突变多发生在密码子的兼并位点上.PCR结果和序列分析表明,GH基因在猞猁基因组中为单基因.     

一株高抗镉细菌KCd1的分离鉴定及其抗性基因初步研究

从北京凉水河床底泥中分离得到一株能在含450 mg/L CdCl2的LB平板正常生长的高抗镉细菌,编号为KCd1。16S rDNA序列分析结果显示,该菌株与Bacillus cereusATCC 14579T的序列同源性达99%;结合脂肪酸测定与生理生化测定结果,确定该菌株在分类上属于Bacillus cereus。根据GenBank中已发表的抗镉细菌cadA序列设计了巢式引物,以菌株KCd1基因组DNA为模板,扩增得到约500 bp的PCR产物,将该PCR产物克隆于pGEM T-Easy载体,测序结果显示其大小为468 bp,与已报道的Staphylococcus haemolyticus的cadA基因对应序列相似性达到99%,由此可知本实验所获得到468 bp基因片段为cadA基因的一段保守序列。该菌株cadA全长基因的获取工作还有待于进一步展开。     

核桃早实性相关SCAR标记(1-1500)基因末端序列的克隆

[目的]克隆SCAR标记的核桃早实性相关基因片段[1](AFLP早实分子标记转化成的SCAR标记)的末端序列,为验证其功能和早实核桃分子育种奠定基础.[方法]采用RACE技术对SCARE标记的核桃早实性相关基因片段设计特异性PCR引物,并扩增其末端序列.[结果]分别获得了长度为453 bp和463 bp的片段,通过与NCBI核酸数据库中已经发表的序列进行比对分析,发现该基因3'末端含有358个核苷酸非编码序列.其核酸序列与葡萄假定蛋白相应部位同源性为55.26;,与葡萄重叠群相应部位同源性为38.38;,与线虫枯粒Y38F2AR基因全序列相应部位相似性为40.86;,和野猪免疫球蛋白超家族成员相应部位的相似性为39.75;,具有poly(A)尾.5'末端含有248个核苷酸非编码序列,其核酸序列与葡萄重叠群基因组鸟枪全序列相应部位同源性为39.07;,与拟南芥基因组DNA 3号染色体相应部位的同源性为42.22;,与嗜热四膜虫假定蛋白基因序列相应部位相似性为44.53;,和斑马鱼DNA序列DKEY-120E17克隆2号连锁群全序列相应部位相似性为42.30;.[结论]试验采用的3'和5'末端快速扩增技术(3'RACE和5'RACE技术)能很好地扩增核桃早实性相关基因的末端序列.     

木薯细菌性枯萎病菌hrpG和hrpX基因的克隆和初步分析

根据黄单胞类病原菌hrpG和hrpX基因序列,设计简并引物,通过PCR扩增从我国木薯细菌性枯萎病菌中克隆到这2个基因.结果表明:10个菌株的hrpG基因编码区长度均为792 nt,编码263个氨基酸,相互之间最多有4个碱基和1个氨基酸的差异;而hrpX基因编码区长度均为1 431 nt,编码476个氨基酸,相互之间最多有4个碱基和3个氨基酸的差异.所获hrpG基因序列和辣椒斑点病菌等黄单胞菌同源基因相似性最高,核苷酸序列为95％,氨基酸序列为96％.所获hrpX基因核苷酸序列和辣椒斑点病菌等的相似性最高,为97％,而氨基酸序列和柑橘溃疡病菌等同源基因相似性最高,为99％.这2个基因的聚类分析结果表明,木薯细菌性枯萎病菌和豆褐色黄单胞菌、柑橘溃疡病菌和甘蓝黑腐病菌的亲缘关系最近.     

富贵竹中杆状DNA病毒湖北分离物的分子鉴定

 【目的】证明湖北发病富贵竹上是否存在杆状DNA病毒属（Badnavirus）病毒,分析来自富贵竹及其它作物Badnavirus病毒不同分离物间的分子差异。【方法】通过分段克隆测序的方法获得湖北富贵竹中 Badnavirus病毒基因组全序列,利用BLAST工具及其它生物学软件进行序列分析。【结果】富贵竹Badnavirus病毒湖北分离物基因组为环状结构,全长7 522 bp;基因组正链包含7个ORFs,推测其编码蛋白的分子量分别为17.58、14.93、214.77、11.86、11.31、16.12和11.00 kD。获得的基因组与福建富贵竹斑驳病毒（Dracaena mottle virus , DrMV）大小仅相差9个核苷酸,两者基因组核苷酸序列一致率为99.7％,ORFs 1～3编码氨基酸序列的一致率分别为99.3%、100%、99.2%,而与其它已报道的14种Badnavirus病毒分离物间的核苷酸全序列一致率为32.0%～44.0%。【结论】叶片表现褪绿斑驳等症状的湖北富贵竹中存在Badnavirus病毒,该病毒与DrMV为同种病毒,已报道的富贵竹中Badnavirus病毒分离物间分子差异非常小,这与已报道的其它作物中Badnavirus病毒不同分离物间存在非常大的分子差异不同。     

酸橙ACC氧化酶基因片段克隆及序列分析

1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶是植物乙烯合成的1个关键酶,乙烯作为一种内源激素,对植物生长、老熟过程有多方面的调节作用。根据已报道的各种植物ACC氧化酶氨基酸序列上前后两个保守区设计1对简并引物,以酸橙叶片总RNA为模板,通过RT-PCR扩增到1个834 bp的基因片段。克隆了酸橙1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)氧化酶基因cDNA片段,将片段序列在NCB I网站上进行同源性搜索,显示的皆为不同植物的ACC氧化酶基因,因而认为所克隆的片段就是酸橙ACC氧化酶基因;并运用DNAStar5.0软件进行序列分析,推导的氨基酸序列为278个残基;具有所有植物ACC氧化酶基因共有的保守区域;与多种植物的ACC氧化酶基因的核苷酸和氨基酸序列的同源性都在72%和70%以上。     

白桦MADS基因的克隆及序列分析

在分析了欧洲白桦MADS3与拟南芥AP1中的保守性后,设计了一对引物。以白桦雄花芽为材料,从总RNA中通过RT-PCR分离得到一个MADS基因,其cDNA长738bp,包含了基因完整的编码序列,白桦MADS基因与已发表的欧洲白桦MADS3基因仅相差6个碱基,同源性高达99％;推导氨基酸序列的差异为5个,同源性达97％。分析其氨基酸序列表明,存在典型的MADS MEF2转录因子结构域和K-box结构域。     

A common onc gene sequence transduced by avian carcinoma virus MH2 and by murine sarcoma virus 3611

A common cellular sequence was independently transduced by avian carcinoma virus MH2 (v-mht) and murine sarcoma virus (MSV) 3611 (v-raf). Comparison of the nucleotide sequences of v-mht and v-raf revealed a region of homology that extends over 969 nucleotides. The homology between the corresponding amino acids was about 95 percent with only 19 of 323 amino acids being different. With this example, 5 of the 19 known different viral onc genes have been observed in viruses of different taxonomic groups. These data indicate that (i) the number of cellular proto-onc genes is limited because, like other viruses of different taxonomic groups, MH2 and MSV 3611 have transduced the same onc gene-specific sequences from different cell species and (ii) that specific deletion and linkage of the same proto-onc sequences to different viral vector elements affect the oncogenic potential of the resulting viruses. The difference in transformation capabilities of MH2 and MSV 3611 serves as an example.     

山葡萄北冰红VvCOR413-I1基因克隆及生物信息学分析

[目的]从山葡萄北冰红中克隆耐寒基因COR413,并对其功能进行生物信息学分析。[方法]利用RT-PCR法克隆山葡萄北冰红基因COR413,并利用生物信息学对其进行分析。[结果]它包括630 bp完整的开放阅读框,推测编码210个氨基酸,蛋白的分子量(MW)为59.18 k D,等电点(p I)值为10.74。其蛋白结构以α-螺旋、延伸链为主,其次为无规则卷曲,β-转角所占比例最少,含有4个跨膜结构域。多重序列比对表明VvCOR413-I1与其他植物COR413的氨基酸序列相似性为63.00%~68.33%。[结论]该研究为深入了解VvCOR413-I1功能奠定了基础。     

猪伪狂犬病毒湖北株gE基因的克隆与序列分析

[目的]通过对从湖北省某猪场分离获得的伪狂犬病毒的gE基因克隆和测序,分析其遗传变化规律。[方法]参考GenBank中猪伪狂犬病病毒(Porcine pseudorabies Virus,PRV)gE基因的序列设计1对引物,对PRV湖北株gE基因进行PCR扩增和序列分析,PCR产物克隆到pMD 18-T载体。对重组质粒进行限制性内切酶分析和基因测序,与GenBank收录的国内外其他地区的标准参考毒株进行同源性分析和比较。[结果]与标准参考毒株的核苷酸序列同源性为95.0%~98.0%,进化树分析表明,PRVHBXS2014株与河南焦作株EU561349-China同属于一个分支,亲缘关系较近,但存在个别位点的基因突变。[结论]为有效防控该病提供参考。     

油菜脂肪酸延长酶基因fae1片段的克隆与SNP分析

 脂肪酸延长酶基因fae1是调控油菜芥酸合成的关键基因。本研究利用GenBank中的fae1基因序列AF490462为模板设计引物，通过多聚酶链式反应（PCR）从白菜、甘蓝和甘蓝型油菜（包括2个人工合成种）的12个不同品种中扩增出长1 007bp的fae1基因片段。PCR产物经与克隆载体pGEM-T vector连接和序列测定，获得12个品种的fae1基因片段的DNA 序列。对来自12个不同品种的fae1基因序列进行比较分析表明：fae1基因具有高度序列保守性，扩增长度均为1 007 bp，核苷酸序列相似度达98%以上，氨基酸序列的保守性更高。在1007 bp的区间内共发现23个SNP(single nucleotide polymorphism)位点，其中有11个单核苷酸变异导致了编码氨基酸的改变。人工甘蓝型油菜和天然甘蓝型油菜的fae1基因片段未发现明显差异。发现了高芥酸品种与低芥酸品种的fae1基因、以及A基因组与C基因组的fae1基因特有SNP位点。     

枯草芽孢杆菌新抗病基因aiiA的克隆

枯草芽孢杆菌内生亚种BS-1aiiA基因测序结果表明,该基因(GenBank登录号DQ000640)由753个碱基组成,其编码的蛋白质含有250个氨基酸残基,与10个已报道的具有减弱欧文氏菌胡萝卜亚种致病力的AiiA蛋白酶氨基酸序列总的相似性为82%.它们均含有相同的氨基酸序列保守区.Signal P分析结果显示,BS-1 AiiA没有信号肽序列,并利用Swiss-model预测、分析了BS-1 AiiA蛋白的三维结构.     

泥鳅和大鳞副泥鳅细胞色素P450c17-Ⅰ(CYP17-Ⅰ)基因的克隆及组织表达分析

采用3'-和5'-RACE法克隆了泥鳅和大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因的cDNA全长序列,通过实时荧光定量PCR技术分析其表达情况。结果表明,泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 706 bp,开放阅读框(open reading frame, ORF) 1 563 bp,编码520个氨基酸;大鳞副泥鳅CYP17-Ⅰ基因cDNA全长1 763 bp,ORF长1 545 bp,编码514个氨基酸。2种鳅CYP17-Ⅰ氨基酸序列都有1个信号肽、1个跨膜区、1个保守的蛋白结构域和3个功能保守区。相似度分析显示,2种鳅之间CYP17-Ⅰ相似度为99%,与其他鱼类的相似度也超过70%。系统进化分析显示,2种鳅之间关系最为接近,其系统发育关系基本符合传统的分类地位。qRT-PCR结果显示,CYP17-Ⅰ在2种鳅的肠、肌肉、心脏、胃、肝脏、精巢、卵巢、脾脏等8个组织均有表达,在精巢和卵巢中表达量相对较高。     

A/Grganey/SanJiang/160/2006(H5N2)分离株HA基因克隆及序列分析

应用RT-PCR方法,对从一只野生白眉鸭(Anas querquedula)中分离出的禽流感病毒分离株A/Grganey/SanJiang/160/2006(H5N2)的HA基因进行了序列的克隆和测定.测序结果显示,克隆的HA基因全长为1 731 bp,共编码565个氨基酸.核苷酸和氨基酸的最大同源性比较结果表明,该毒株的HA基因与其它31株H5N2亚型禽流感病毒HA基因的同源性为71.0%～98.2%,氨基酸序列同源性为84.0%～98.2%;遗传进化关系表明,该毒株属于欧亚群系.通过血凝素裂解位点的氨基酸序列分析可知,该毒株的HA切割位点上未见到典型的高致病力毒株H5、H7所具有的一系列碱性氨基酸,符合低致病力禽流感毒株的分子特征.