转GbVe1基因在棉花基因组中的整合与定位分析

【目的】明确转GbVe1基因棉花的插入位点序列特征。【方法】Southern杂交筛选低拷贝基因插入的转基因棉花株系,以hiTAIL-PCR(Polymerase chain reaction)获取其T-DNA侧翼序列,然后根据获得的T-DNA侧翼序列设计特异PCR引物,验证插入位点的准确性。【结果】Southern杂交候选了T-DNA低拷贝插入的3个转基因棉花株系,hiTAIL-PCR分离到RB端侧翼序列(119~1 018 bp)、LB端侧翼序列(243~516 bp);侧翼序列的AT碱基含量在63%以上。转基因株系7/100826-152和12/100826-393插入位点都位于Gohir.D01G157600.1内含子上。转基因株系1/w-ch14插入位点分别位于Gohir.D01G157600.1内含子和A12染色体的基因间隔区中。T-DNA在Gohir.D01G157600.1内含子的插入事件造成了21 bp碱基的基因组序列缺失。T-DNA到侧翼序列的PCR产物证明Gohir.D01G157600.1上的插入位点真实可靠。【结论】hiTAIL-PCR获取了转GbVe1基因棉花的T-DNA侧翼序列,提供了T-DNA插入位点位于Gohir.D01G157600.1基因内含子的特异性检测引物。     

转epsps-G6基因棉花的Southern杂交及遗传特性分析

为鉴定epsps-G6基因成功导入棉花基因组并分析转基因抗草甘膦棉花的拷贝数和遗传特性,以花粉管通道法获得的8个转epsps-G6基因抗草甘膦棉花株系(G6-1、G6-4、G6-5、G6-7、G6-11、G6-19、G6-20、G6-25)为材料,通过Southern点杂交、双酶切和单酶切的Southern杂交后进行分析,结果表明,外源epsps-G6基因已成功整合到棉花基因组上,且其中4个转化株系含有单拷贝插入的epsps-G6基因。选用其中3个单拷贝插入、自交纯合且草甘膦抗性强的株系G6-1、G6-5、G6-19,分别与转基因遗传背景材料(中棉所49)和陆地棉标准系(TM-1)进行正反交,遗传分析结果表明,这3个转基因株系均符合3∶1的孟德尔分离规律,不受细胞质效应的影响。     

大丽轮枝菌致病缺陷型T-DNA插入突变体的筛选与鉴定

【目的】从大丽轮枝菌T-DNA突变体库中筛选鉴定致病缺陷型突变体并分析致病相关基因。【方法】将落叶型大丽轮枝菌菌株Vd991的294个T-DNA插入突变体在寄主棉花上进行致病力测定。利用Southern杂交和hiTAIL-PCR(High-efficiency thermal asymmetric interlaced PCR)技术分别对筛选获得的9个致病力显著降低的突变体进行拷贝数和侧翼序列分析。【结果】与接种野生型Vd991的棉花相比,接种突变体的棉花的病情指数极显著降低。Southern杂交表明其中1个突变体中T-DNA为双拷贝插入,其余8个突变体均为单拷贝插入。生物学特性分析发现T-DNA的插入导致这些突变体在生长速率和产孢量等方面与野生型Vd991相比均有不同程度的降低。Blast比对分析明确了这些突变体中T-DNA的插入位置和在基因组上的分布,并从野生型菌株Vd991中成功克隆得到了这些可能影响大丽轮枝菌致病力的相关基因。【结论】筛选和鉴定T-DNA插入突变是在全基因组范围内快速获得致病相关基因信息的1种有效方法,极大的促进了大丽轮枝菌的致病分子机制等研究,为进一步培育抗病棉花品种奠定了基础。     

转Bt+Sck双价基因棉花的遗传稳定性研究

外源基因在转基因植物中遗传和表达的稳定性,直接关系到转基因材料的应用前景。本研究以转Bt+Sck双价基因棉花纯合株系312-5T2、332-2T2的T0,T1,T2和T3及T4连续世代为材料,Southern杂交进一步证明外源基因已经整合到棉花的基因组,并稳定地遗传给后代;RT-PCR以及抗虫性测定表明,外源抗虫基因在各个转基因世代稳定的表达,为该材料的育种应用打下了基础。     

富含多糖的转基因石斛基因组DNA提取方法(英文)

在石斛兰转基因研究中,需通过PCR和Southern杂交等手段检测外源基因是否转入并整合到转化植株基因组.由于转化石斛植株生长缓慢,且含有多糖,因此从转化植株中提取高质量的基因组DNA以尽快对转基因苗进行分子检测存在较大困难.本研究旨在通过改良现有的DNA提取法(CTAB法或SDS法1,克服转化石斛植株基因组DNA提取中碰到的产量低,纯度不高而导致难以进行PCR或酶切等问题.在本研究所用的3种改良法中,方法Ⅱ能从少量的转化石斛苗中提取出高产量和高纯度的基因组DNA.研究结果表明方法Ⅱ提取的基因组DNA完全适用于转基因石斛的外源基因PCR扩增,限制性酶切和Southern杂交分析.     

转基因水稻BarKasalath-01事件特异性检测

利用hi TAIL-PCR方法研究了转基因水稻Bar Kasalath-01中外源基因在基因组上插入位点的序列特征,获得了外源基因T-DNA右边界旁侧序列511 bp,与水稻基因组数据库比对发现,外源基因插入位点位于水稻基因组第8号染色体的第3 326 720处。根据整合位点水稻基因组序列和外源基因T-DNA左边界序列设计引物,扩增得到了左旁侧序列783 bp。基于左右旁侧序列,建立了转基因水稻Bar Kasalath-01的事件特异性定性PCR检测方法,扩增片段分别为783 bp和411 bp。该方法特异性强、灵敏度高,能够在Bar Kasalath-01基因组DNA含量为0.1%的模板中检测出转基因成份。依据旁侧序列,还建立了快速鉴定转基因后代植株基因型的3引物PCR检测方法。这些方法的建立,实现了对转基因水稻Bar Kasalath-01转化事件的特异性检测。     

尖孢镰刀菌T-DNA插入突变体的筛选及插入基因分析

在建立T-DNA插入突变体库的基础上,为筛选出致病力明显下降的突变体并明确其插入位点信息,对突变体的培养表型和致病性差异进行测试,研究结果为进一步阐明尖孢镰刀菌致病分子机制奠定基础。在前期构建的T-DNA插入突变体库中,采用PCR检测筛选了300株T-DNA插入突变体,观察和测定菌落形态、生长速率、产孢量、遗传稳定性等生物学性状,用海棠胚根接种法比较突变体致病力差异,对筛选到的致病力明显减弱的突变体进行插入位点侧翼序列分析及Southern杂交分析。结果显示,283个供试突变体都已插入目的基因,并伴有绿色荧光。将T-DNA插入突变体连续转接培养5代后,在含潮霉素B的培养基上能稳定遗传,且菌落形态和颜色无明显改变;在对283株突变体进行致病性测定中,87.9%的突变菌株致病力减弱,在致病力减弱的突变体中,HS2-520、HS2-1016和HS2-2109几乎丧失了致病性。选取8株致病力明显减弱的突变体进行Southern杂交分析,结果显示,其中6株突变体为单拷贝插入菌株,1株为双拷贝插入菌株。对这8株突变体进行了TAIL-PCR侧翼序列扩增,经公司测序,与野生菌株HS2基因组序列比对后获...     

转基因玉米MON88017旁侧序列分析及定性PCR检测

采用基因组步移法和巢式PCR方法研究转基因玉米MON88017外源基因插入位点旁侧序列特征,获得了外源基因插入位点的左边界旁侧序列504bp,包括336bp的插入载体序列和168bp的玉米基因组序列。根据此旁侧序列,设计MON88017转化事件特异性引物并进行定性PCR扩增,扩增片段为446bp,建立了转基因玉米MON88017转化体特异性检测方法。该方法特异性强、灵敏度高(0.1%),为转基因玉米品种MON88017进出口检测和标识检测提供了技术基础。     

转cry1Aa基因抗虫棉整合结构解析及转化体特异性检测方法的建立

【目的】cry1Aa基因是2011年本实验室在我国棉花商品种子中发现的1种未经批准的转基因成分,本研究旨在通过整合结构解析,建立特异性检测方法,对市售棉种进行初测,明确该外源基因在我国棉种中的存在情况。【方法】通过Genome walking、长链PCR分离获得了转cry1Aa基因棉花转化体(定名为NN6转化体,简称NN6)的外源基因整合结构,同时基于插入位点基因组及外源DNA连接区,建立了NN6转化体特异性的定性聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)方法和实时荧光定量PCR方法。【结果】NN6整合结构主要包括cry1Aa、aad和Npt II基因,插入棉花基因组7号染色体37 169 450位,产生91 bp基因组缺失;所构建的定性PCR检测方法能特异、快速地对棉花单株和种子单粒中NN6转化体的纯/杂合状态进行鉴定,实时荧光定量PCR检测限为44拷贝,能满足国内外对转基因标识的需要;对含有cry1Aa基因的3个市售棉种进行检测,其纯合度分别为1.51%,5.21%和21.09%。【结论】本研究解析了NN6的整合结构,并建立特异性检测方法,为我国转基因棉花新品种选育及转基因安全管理提供技术手段。     

基因枪法转Bt/GNA基因超甜玉米植株的获得及抗虫性鉴定

以超甜玉米自交系S1幼胚诱导的愈伤组织为受体材料,利用基因枪法共转化Bt和GNA基因,获得了128株再生植株,移栽成活31株,其中26株可育.经PCR检测外源基因整合进玉米基因组中,含Bt基因11株,其中有5株能扩增出GNA基因.Southern杂交证明,目的基因已经整合在玉米基因组中.对9株转基因T1代植株叶片室内接虫抗性鉴定,结果显示,5株转基因植株叶片饲喂6 d后明显抑制玉米螟幼虫的发育,幼虫体重增加较少,幼虫死亡率高,表现较强的抗性.     

超量表达水稻miRNA167a调控株型的研究

本研究将水稻MIR 167基因家族成员之一MIR167a基因构建到玉米Ubiquitin基因组成型启动子下游,采用农杆菌介导的遗传转化方法实现了miRNA 167a在水稻品种中花11号中的超量表达.Southern杂交进一步获得了单拷贝基因插入的转基因植株.Ubi::MIR 167a超量表达植株表现为矮化、分孽角度增大...     

多位点整合的转基因棉花后代分子鉴定

 GFP47是一个利用双元载体pPZP111构建的绿色荧光蛋白基因的简单质粒载体pPZP-GFP经农杆菌介导转化陆地棉(Gossypium hirsutum L.)获得的T₀株系,PCR和Southern杂交分析证实其不仅整合了多个拷贝的正常的T-DNA,而且有紧邻T-DNA左边界的载体骨架序列的整合。对来源于GFP47的33个T₁个体的PCR分析表明,T₁后代中可以分离只有正常T-DNA整合的个体。对T₁群体中不同基因型个体的Southern杂交分析结果显示,该多拷贝整合的T₀转化体至少在棉花基因组中有四个插入位点,不同的Southern带型暗示不同插入位点的T-DNA结构和排布有很大的不同。至少有一个位点整合了只包括目的基因和选择标记基因在内的正常T-DNA结构。     

利用新的外植体建立棉花高效转化系统的研究

利用陆地棉 (Gossypium hirsutum cv.Cok-er3 1 2和 G.hirsutum.晋棉 7号 ,冀合 3 2 1 ) 8～1 2 d无菌苗侧根 1 0 mm切段作为新的外植体与农杆菌 L BA440 4 p BK9(3 5 s∶∶ LUC∶∶ Nos)共培养将外源基因导入棉花 ,成功的获得转基因工程植株 ,提高了愈伤组织和转基因工程植株的转化效率。 p BK9质粒上携带的萤光素酶基因 [Lucif-erous(lux) ]为报告基因 (reporter gene) ,新霉素磷酸转移酶基因 (npt II)为选择标记基因 (markergene) ,经选择获得的转基因工程植株通过 VedioImage System进行整株活体萤光素酶基因 (lux)活性表达检测 ,获得 To 代和 T1代萤光素酶基因(lux)阳性表达植株。进行 DNA分子杂交 (South-ern blot)分析 ,证明外源基因已经整合到棉花基因组中。转基因工程植株萤光素酶基因 (lux)和新霉素磷酸转移酶基因 (npt II)在自交后代中得到保持 ,外源基因呈核基因单一位点显性遗传。     

叶酸生物合成途径中调控基因folB表达载体的构建及在大豆中的转化

叶酸是一种水溶性B族维生素,是维持人体正常活动所必需的营养元素之一,也是植物体内参与一碳单元反应的重要辅酶。folB基因是叶酸调控基因,来源于拟南芥,调控叶酸合成途径中的关键酶DHNA的生成。本研究将人工合成的folB基因转入大豆受体材料Williams82中。共侵染200个大豆外植体,得到26株转化苗。通过对转化苗的草丁膦(浓度150 mg/L)涂抹鉴定,获得16株除草剂抗性转化苗。通过PCR检测,得到12株PCR阳性转化苗。经过bar试纸条检测,其中10株为阳性。Southern杂交结果表明,9株转化苗为Southern杂交阳性。研究结果表明:外源功能基因folB和筛选标记基因bar已经整合到大豆基因组中。相应的转基因后代表现出除草剂抗性和folB基因Southern杂交阳性。本研究通过将folB基因转入大豆,获得了转基因后代,以此为基础可进一步选育高叶酸含量的转基因大豆品种。     

棉花GhMADS7基因正调控棉花花瓣发育

MADS-box基因家族作为一类重要的转录因子,主要参与植物花器官的生长发育。GhMADS7/98具有保守的MADS-box及K结构域,属于AG亚家族MIKC~C型MADS-box基因。通过同源序列比对发现,GhMADS7/98与拟南芥AtAG (AT4G18960)基因的蛋白序列具有64%的同源性。组织表达分析表明, GhMADS7基因在花瓣、花药、柱头和胚珠等花器官组织中均有表达。为进一步研究该基因的功能,构建了该基因的RNAi干涉载体并转化棉花,获得了表达量明显下调的转基因株系。表型观察发现,在干涉植株长度为5~6 mm和7~8 mm的花蕾中出现花瓣发育延缓的表型;通过对干涉系转基因植株花瓣进行石蜡切片观察发现,相较于野生型植株,干涉系植株花瓣中的维管束存在明显的收缩现象;通过qRT-PCR检测发现,转基因株系中控制花瓣发育的A、B类基因的表达量出现异常。因此推测GhMADS7在棉花花瓣发育过程中起着重要的作用。     

农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化花生的研究

选用鲁花14与花育23花生品种, 通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究, 从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行npt II基因的PCR检测, 结果有22株能扩增出620 bp左右的npt II基因条带, 阳性率约为84.62%。提取npt II基因显示为阳性的植株叶片DNA作模板, 用VP4基因特异引物进行PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳分析, 所有npt II基因阳性的植株均扩增出了约2 350 bp的特异性条带, 而野生型没有。对部分转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析, 发现转基因植株中出现了阳性杂交信号, 表明VP4基因的确已经整合到花生的基因组中, 并且是1~2个拷贝。用RT-PCR分析了11株转G1VP4基因的植株, 证明插入鲁花14中的VP4基因已经正常转录, 利用Western blot方法检测筛选到的4株转基因花生, 分别提取其蛋白, 在30 kD处出现特异性蛋白条带, 这为获得转基因创新种质材料奠定了基础。     

农杆菌介导轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化花生的研究

选用鲁花14与花育23花生品种, 通过农杆菌介导开展了轮状病毒抗原蛋白VP4基因遗传转化研究, 从转化植株中随机选取26株表现Kan抗性植株进行npt II基因的PCR检测, 结果有22株能扩增出620 bp左右的npt II基因条带, 阳性率约为84.62%。提取npt II基因显示为阳性的植株叶片DNA作模板, 用VP4基因特异引物进行PCR扩增, 经琼脂糖凝胶电泳分析, 所有npt II基因阳性的植株均扩增出了约2 350 bp的特异性条带, 而野生型没有。对部分转基因植株进一步进行PCR-Southern杂交和Southern杂交分析, 发现转基因植株中出现了阳性杂交信号, 表明VP4基因的确已经整合到花生的基因组中, 并且是1~2个拷贝。用RT-PCR分析了11株转G1VP4基因的植株, 证明插入鲁花14中的VP4基因已经正常转录, 利用Western blot方法检测筛选到的4株转基因花生, 分别提取其蛋白, 在30 kD处出现特异性蛋白条带, 这为获得转基因创新种质材料奠定了基础。     

转G10eve基因棉花的获得及草甘膦抗性初探

【目的】为培育高抗草甘膦棉花新品种提供种质材料。【方法】对草甘膦抗性基因G10eve进行生物信息学分析,利用农杆菌介导的方式将G10eve导入到珂字棉312中。利用PCR(Polymerase chain reaction)、qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)方法分析G10eve的表达情况。对受体及转基因植株进行草甘膦喷施实验,测定其莽草酸含量,分析其抗性水平。【结果】最终获得28个独立的转基因阳性系,转化率及幼苗分化率分别高达49.3%、40.6%。PCR及qRT-PCR检测证明外源G10eve基因已经整合到棉花基因组中,且在不同转基因株系间表达量差异显著。在子叶期,转基因植株可耐受8 mL·L~(-1)浓度的草甘膦,而非转基因对照在2 mL·L~(-1)浓度草甘膦处理下已出现药害。草甘膦处理前后,转基因植株叶片莽草酸含量未出现明显积累,进一步说明其具有草甘膦抗性。【结论】过量表达G10eve基因能够提高受体材料对草甘膦的抗性,获得了高抗草甘膦的棉花株系。     

转基因克隆牛外源基因整合位点的研究

整合位点的侧翼序列是外源基因表型研究和功能探讨的前提条件,对目的基因的正常转录和表达有着重要影响。本试验利用热不对称交措式PCR（Thermal Asymmetric Interlaced PCR,TAIL-PCR）的方法克隆了目的基因。结果表明：外源基因整合到牛的12号染色体基因组克隆(NW_003104315.1)中。分析了整合位点的纯合性发现转基因牛为整合位点杂合子。TAIL-PCR法能够有效、快速的鉴定外源基因在基因组中的整合位置,具有良好的应用前景。     

一个新的玉米silky1基因等位突变体的遗传分析与分子鉴定

前期试验发现一个玉米雄性不育突变体(male sterile mutant),命名为msm-6。经过连续多代杂合单株自交发现该突变体性状能稳定遗传,遗传模式分析表明该突变体为单个隐性1核基因控制。以msm-6与自交系B73杂交构建F2遗传定位群体,利用BSA (Bulk Segregant Analysis)方法,筛选到与msm-6位点连锁的4个SSR标记,即C6-24、C6-30、C6-34和C6-40。进一步采用444个F2单株对这4个连锁标记验证,将msm-6定位于标记C6-24与C6-34之间,即玉米第6染色体68.5～98.1 Mb之间。通过基因组序列信息分析发现,在此定位区间内存在一个已报道的Silky1基因。Silky1基因编码MADS-BOX蛋白,是参与花器官建成ABCD模型的B功能基因,该基因的突变会造成雄花不育、雌花花丝增多等表型。利用杂合体+/silky1-mum3与纯合突变体msm-6/msm-6杂交进行等位测验,杂交后代中正常植株与突变植株分离比例符合1∶1。基因组序列以及转录本序列分析发现,msm-6突变体中第6个内含子5'端供体位点AG/GTAAG (外显子/内含子交接处)的序列+1位G突变为C,导致第6外显子被错误剪切掉,产生了第6个外显子缺失的Silky1异常转录本。以上实验证据表明,msm-6与所报道的由mutator转座子插入造成的Silky1突变体silky1-mum2、silky1-mum3和silky1-mum4的突变方式不同,是一个新的Silky1基因等位突变体。msm-6的发现与鉴定为进一步深入解析玉米穗花器官决定的遗传机制提供丰富的实验材料,同时也为RNA加工过程中剪接位点保守性提供重要证据。