3种ELISA法定量检测转cry1Ac基因水稻Cry1Ac蛋白的比较研究

用从细菌中分离的纯品CryIAe蛋白作为抗原成功制备出了效价较高的CryIAe蛋白的兔多抗，对制备的抗体的免疫学分析表明，其与CryIAc有极显著的免疫交叉反应，并在对转cryIAc基因水稻的检测中具有良好的特异性。用戊二醛一步法对纯化的IgG进行了碱性磷酸酶标记。应用制备的抗体进行了直接法、间接法和双抗夹心法等ELISA方法检测转cryIAc基因水稻中Bt的含量，结果表明直接法和间接法ELISA只能定性而不能定量测定转cryIAc基因水稻，而双抗夹心法是一种比较理想的定量检测水稻中Bt含量的方法。同时确定了双抗夹心法的各项具体条件。     

间接ELISA检测小鹅瘟抗体反应条件的选择

通过方阵法对间接ELISA抗原、抗体反应浓度进行筛选,再运用正交试验对不同的包被液、封闭液、底物进行比较和选择,最后对酶进行选择,最终确定运用ELISA法测定小鹅瘟抗体的最佳反应条件。即抗原最佳浓度为37.00μg/ml,血清最佳稀释倍数为1∶200,包被液为0.1 mol/L碳酸盐缓冲液,4℃包被12 h,封闭液为10%犊牛血清的PBS溶液,使用羊抗兔IgG酶标二抗,底物为联苯二胺(OPD)。     

农产品中黄曲霉毒素产毒菌标识性分子大容量反应体系提高ELISA灵敏度

【目的】为预防和降低黄曲霉毒素污染,在前期探明黄曲霉毒素产毒菌株鉴别标识性分子PO8蛋白的基础上,欲研究建立高灵敏、大容量反应体系的双抗夹心ELISA检测技术,为污染源头监控提供技术支撑。【方法】用干菌丝作标识性分子PO8蛋白的参考物,以高压均质制得的黄曲霉菌裂解液为检测抗原,纯化后的PO8-VHH作包被抗体,产毒菌株多抗作检测抗体,抗原、抗体分别以200μL/孔加入到96孔酶标板,进行大容量反应体系夹心ELISA法的试验。优化相关理化因素,以阳性孔OD_(450nm)≥1.0,阳性孔OD_(450nm)/阴性孔OD_(450nm)较高为原则,确定最佳试验条件,建立标准曲线。并通过样品添加回收试验、重复性试验、特异性试验,对建立的夹心ELISA方法进行性能评估。【结果】通过棋盘格试验确定了最佳包被抗体浓度为3.0μg·mL~(-1),最佳多抗的工作浓度为2.5μg·mL~(-1)。优化反应条件确定:最佳抗体包被条件为4℃过夜,最佳封闭液为3%的BSA,最佳封闭条件为37℃封闭2 h,最佳多抗作用条件为37℃反应50 min。在优化后的条件下建立了夹心ELISA方法的标准曲线,对黄曲霉菌检测限可达到0.1μg·mL~(-1),比前期报道的常规容量反应体系灵敏度提高了约10倍。该方法特异性强,与青霉菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、赭曲霉菌均无交叉反应,且检测非产毒黄曲霉菌株信号值较低,接近于阴性值。重复性试验显示,板间变异系数为1.5%—5.8%,板内变异系数为0.4%—3.2%,均小于7%,说明该方法稳定性好。采用该方法对花生、玉米等农产品进行添加回收试验,平均回收率在81.9%—109.0%。【结论】本研究建立的大容量反应体系夹心ELISA方法可快速、高灵敏地检测黄曲霉毒素产毒菌,为从源头上控制黄曲霉毒素污染提供了新的快速、方便的检测技术支撑。     

农产品中黄曲霉毒素产毒菌标识性分子大容量反应体系 提高ELISA灵敏度

【目的】 为预防和降低黄曲霉毒素污染,在前期探明黄曲霉毒素产毒菌株鉴别标识性分子PO8蛋白的基础上,欲研究建立高灵敏、大容量反应体系的双抗夹心ELISA检测技术,为污染源头监控提供技术支撑。 【方法】 用干菌丝作标识性分子PO8蛋白的参考物,以高压均质制得的黄曲霉菌裂解液为检测抗原,纯化后的PO8-VHH作包被抗体,产毒菌株多抗作检测抗体,抗原、抗体分别以200 μL/孔加入到96孔酶标板,进行大容量反应体系夹心ELISA法的试验。优化相关理化因素,以阳性孔OD_450nm≥1.0,阳性孔OD_450nm/阴性孔OD_450nm较高为原则,确定最佳试验条件,建立标准曲线。并通过样品添加回收试验、重复性试验、特异性试验,对建立的夹心ELISA方法进行性能评估。 【结果】 通过棋盘格试验确定了最佳包被抗体浓度为3.0 μg?mL ^-1,最佳多抗的工作浓度为2.5 μg?mL ^-1。优化反应条件确定：最佳抗体包被条件为4℃过夜,最佳封闭液为3%的BSA,最佳封闭条件为37℃封闭2 h,最佳多抗作用条件为37℃反应50 min。在优化后的条件下建立了夹心ELISA方法的标准曲线,对黄曲霉菌检测限可达到0.1 μg?mL ^-1,比前期报道的常规容量反应体系灵敏度提高了约10倍。该方法特异性强,与青霉菌、尖孢镰刀菌、串珠镰刀菌、赭曲霉菌均无交叉反应,且检测非产毒黄曲霉菌株信号值较低,接近于阴性值。重复性试验显示,板间变异系数为1.5%—5.8%,板内变异系数为0.4%—3.2%,均小于7%,说明该方法稳定性好。采用该方法对花生、玉米等农产品进行添加回收试验,平均回收率在81.9%—109.0%。 【结论】 本研究建立的大容量反应体系夹心ELISA方法可快速、高灵敏地检测黄曲霉毒素产毒菌,为从源头上控制黄曲霉毒素污染提供了新的快速、方便的检测技术支撑。     

草鱼白介素10基因的克隆表达及其双抗体 夹心ELISA检测方法的建立

为建立检测草鱼白介素10(CiIL-10)的双抗体夹心 ELISA方法,首先克隆CiIL-10基因、构建与表达原核表达重组质粒pET-32a-CiIL-10,并对表达产物进行纯化,以获得重组CiIL-10(rCiIL-10)纯化蛋白.然后,以纯化的rCiIL-10蛋白为免疫原制备兔源及鼠源抗rCiIL-10的多克隆抗体,并对其进行纯化与酶标记.最后,以纯化的鼠抗rCiIL-10抗体为捕获抗体,rCiIL-10纯化蛋白为夹心抗原,HRP标记的兔抗CiIL-10纯化抗体为检测抗体,通过优化反应条件,建立双抗体夹心 ELISA检测方法.结果显示,该方法的优化反应条件包括,捕获抗体的最佳包被浓度为20μg·mL-1,检测抗体的最佳稀释度为1 ∶ 3 200,最佳封闭条件是使用5％脱脂奶粉,37℃封闭1.5 h,样品反应时间为2 h,以OD450值≥0.174作为阳性判定标准.该方法的板内及板间重复性变异系数小于10％,最低检测限量为24.29 ng·mL-1,与草鱼白介素6、草鱼肿瘤坏死因子、小鼠白介素10、小鼠干扰素和小鼠单核细胞趋化蛋白均无交叉反应.结果表明,建立的双抗体夹心ELISA方法具有较好的特异性、重复性和灵敏度,可用于草鱼白介素10的快速检测.     

百合鳞茎蔗糖合成酶活性检测体系的建立

为了建立富含多糖的百合鳞茎蔗糖合成酶(sucrose synthase,EC2.4.1.13,SuSy)活性检测体系,深入研究其蔗糖代谢机制,以兰州百合(Lilium davidii var.unicolor)鳞茎外层鳞片为试材,分别研究了提取缓冲液种类及pH值、反应温度、底物浓度以及缓冲液pH值对SuSy合成和分解方向活性的影响.结果表明:SuSy合成方向活性检测的最适提取缓冲液是pH值为7.8的TrisHCl,最适反应温度为50℃,底物果糖最适浓度为50 mmol· L-1,UDPG最适浓度为5 mmol·L-1,反应缓冲液Tris-HCl最适pH值为7.5;SuSy分解方向活性检测的最适提取缓冲液为pH值7.8的Hepes-NaOH,最适反应温度为40℃,底物蔗糖最适浓度为10mmol· L-1,UDP最适浓度为7 mmol·L-1,反应缓冲液Mes-NaOH最适pH值为4.5.     

油包水(W/O)型微乳液中m-6菌木质素降解酶的研究

【目的】研究W/O十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)微乳液体系和HAc-NaAc缓冲液体系中,m-6菌株固态发酵后产生的胞外木质素降解酶漆酶(Lac)、木质素过氧化物酶(Lip)、锰过氧化物酶(Mnp)酶促反应的最佳反应条件。【方法】通过分别对Lip(以2,2′-连氮-二(3-乙苯基并噻唑-磺酸)为底物)、Mnp(以MnSO4为底物)和Lac(以藜芦醇为底物)3种木质素降解酶在W/O型CTAB微乳液体系和HAc-NaAc缓冲液体系中的酶活测定,研究不同温度、pH和底物浓度对酶促反应的影响,探讨最佳反应条件,并比较两种反应体系下的酶活。【结果】在W/O型CTAB微乳液体系中,Lip、Mnp和Lac 3种酶酶促反应的最佳条件为:温度37℃、pH分别为4.5,4.5和3.5;在HAc-NaAc缓冲液体系中,3种酶酶促反应的最佳反应条件为:温度37℃,pH分别为5.0,5.0和4.0;在两种反应体系中的最佳反应底物浓度相同,即藜芦醇、MnSO4、2,2′-连氮-二(3-乙苯基并噻唑-磺酸)浓度分别为0.053,0.116,0.492 mmol/L。在W/O型CTAB微乳液中,Lip和Mnp酶活比其在HAc-NaAc缓冲液体系中分别提高了81.45%和36.75%,但Lac酶活却减少了2.914倍。【结论】得到了Lac、Lip和Mnp酶3种木质素降解酶在W/O型CTAB微乳液体系和HAc-NaAc缓冲液体系中的最佳反应条件,为木质纤维素的生物降解奠定了基础。     

鸡传染性囊病双抗体夹心Dot-ELISA诊断法的建立及应用

本研究以醋酸纤维素膜作为固相载体、辣根过氧化物酶标记鸡抗传染性囊病病毒抗体(IBD—IgG)、饱和联苯胺为底物显色建立了一种简便、快速、敏感的鸡传染性囊病双抗体夹心Dot—ELISA诊断法。经方阵实验确定最佳反应条件为:IgG的包被液为0.05MpH9.6碳酸缓冲液,包被浓度为1:50;酶标抗体的工作浓度为1:100;洗涤液为含0.05％吐温—80的0.02MpH7.4磷酸缓冲液,封闭液为含0.2％明胶的洗涤液,封闭时间,抗原及酶标抗体的作用时间均为37℃30分钟。应用本方法和琼扩试验一同检测20份已知阳性病料,120份待检病料和胚毒尿囊液、10份正常鸡样品进行对比试验,结果表明Dot—ELISA阳性率为90％,而AGP只有40％;凡AGP阳性者,Dot-ELISA匀呈强阳性,而在Dot—ELISA阳性样品中,只有44％AGP阳性,其敏感度比AGP高100倍。     

小麦黄花叶病毒的血清学检测

利用间接ELISA对感染WYMV的小麦病叶检测,通过比较分析影响ELISA测定结果的包被缓冲液、抗血清及酶标抗体的浓度和种类,确立了较为稳定的反应体系.利用此ELISA检测体系并结合RT-PCR方法对从四川采集的田间小麦中WYMV进行检测,确定了有较高的检测灵敏度的检测系统,为田间大量小麦病样的检测提供有效、方便的方法.     

鹿血双抗体夹心间接ELISA检测方法的建立

通过制备兔抗鹿血和小鼠抗鹿血多克隆抗体,建立了以兔抗为包被抗体,鼠抗为检测抗体的鹿血双抗体夹心间接ELISA检测方法。采用方阵滴定法确定了抗原、抗体的最佳反应浓度,并对ELISA各反应条件进行优化。结果表明:兔抗最佳包被浓度为1∶8 000,鼠抗的最佳反应浓度为1∶2 000,最佳封闭时间为60 min。该方法对鹿血检测灵敏,可达3×10-4倍稀释度,且对马血、牛血、羊血、猪血的检测结果均为阴性,说明该方法特异性良好。