小麦黄花叶病毒单克隆抗体的制备及ACP-ELISA检测方法的建立

为建立简便、有效、低成本小麦黄花叶病毒(WYMV)的检测方法,用提纯的WYMV免疫BALB/c小鼠后,利用杂交瘤细胞技术经细胞融合、筛选和克隆,共获得2D4、2D3和6F4 3株能稳定传代并分泌抗WYMV单克隆抗体的杂交瘤细胞,并分别注射小鼠腹腔制备其单抗腹水。3株单抗腹水的间接ELISA效价为10~(-6)~10~(-7),抗体类型及亚类均为IgG1、κ链。特异性检测结果表明6F4和2D4这2株单抗仅与WYMV的32 kD外壳蛋白有特异性免疫反应。利用效价最高的2D4单抗建立了检测WYMV的抗原包被ELISA方法(ACP-ELISA),其灵敏度分析结果表明,当病叶以1∶25 600(g/ml)倍稀释时仍能检测到病毒,特异性分析结果表明可有效区分小麦易感染的中国小麦花叶病毒(CWMV)。田间样品检测结果表明该方法可准确、可靠地用于小麦WYMV的大规模检测。     

小麦黄花叶病抗性鉴定及抗性亲本简单重复序列

小麦梭条斑花叶病毒（wheat spindle streak mosaic virus,WSSMV）又名小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic virus,WYMV）是造成小麦Triticum aestivum减产的重要病害。不同的小麦品种对WYMV病害的抗性表现相当复杂。推广抗性品种是防止WYMV大面积田间发病的有效措施。以从国内外收集到的527个小麦品种/系为材料,对其WYMV抗性进行了病圃鉴定,筛选抗性稳定的品种/系,并以其中推广面积较大的WYMV抗性和敏感品种为亲本筛选在抗性和敏感亲本间具有多态性的简单重复序列（SSR）标记。结果表明:527个候选材料中只有10个品种/系的抗性相对比较稳定。以其中3个推广面积较大的WYMV抗性品种丰抗1号T. aestivum Fengkang 1,石家庄72 T. aestivum Shijiazhuang 72,郑麦9023 T. aestivum Zhengmai 9023以及2个推广面积较大的WYMV敏感型品种扬麦158 T. aestivum Yangmai 158和烟农22 T. aestivum Yangnong 22为亲本,筛选在抗性和敏感亲本间具有多态性的SSR标记。结果表明:丰抗1号/扬麦158和石家庄72/扬麦158间的简单重复序列多态性最大,分别为64.0%和63.3%。因此,以WYMV抗性品种丰抗1号和石家庄72,以及WYMV敏感品种扬麦158为亲本材料构建作图群体更有利于利用分子标记对控制WYMV抗性数量性状位点（QTLs）进行精细定位和目标基因的图位克隆。图2表3参17     

小麦黄花叶病抗性鉴定及抗性亲本简单重复序列多态性分子标记的筛选

小麦梭条斑花叶病毒(wheat spindle streak mosaic virus,WSSMV)又名小麦黄花叶病毒(wheat yellow mosaic virus,WYMV)是造成小麦Triticum aestivum减产的重要病害。不同的小麦品种对WYMV病害的抗性表现相当复杂。推广抗性品种是防止WYMV大面积田间发病的有效措施。以从国内外收集到的527个小麦品种/系为材料,对其WYMV抗性进行了病圃鉴定,筛选抗性稳定的品种/系,并以其中推广面积较大的WYMV抗性和敏感品种为亲本筛选在抗性和敏感亲本间具有多态性的简单重复序列(SSR)标记。结果表明:527个候选材料中只有10个品种/系的抗性相对比较稳定。以其中3个推广面积较大的WYMV抗性品种‘丰抗1号’T.aestivum‘Fengkang 1’,‘石家庄72’T.aestivum‘Shijiazhuang 72’,‘郑麦9023’T.aestivum‘Zhengmai 9023’以及2个推广面积较大的WYMV敏感型品种‘扬麦158’T.aestivum‘Yangmai 158’和‘烟农22’T.aestivum‘Yangnong 22’为亲本,筛选在抗性和敏感亲本间具有多态性的SSR标记。结果表明:‘丰抗1号’/‘扬麦158’和‘石家庄72’/‘扬麦158’间的简单重复序列多态性最大,分别为64.0%和63.3%。因此,以WYMV抗性品种‘丰抗1号’和‘石家庄72’,以及WYMV敏感品种‘扬麦158’为亲本材料构建作图群体更有利于利用分子标记对控制WYMV抗性数量性状位点(QTLs)进行精细定位和目标基因的图位克隆。     

山东小麦黄花叶病毒的分子检测与鉴定

利用RT-PCR对2012年山东10个地区送检的105个小麦样品进行了检测,从泰安、临沂、枣庄3个地区的样品中检测到了小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)。这3个地区WYMV分离物CP基因的核苷酸一致率为97.6%～98.3%,氨基酸一致率为98.3%～99.0%。在利用CP基因核苷酸序列构建的系统进化树中,这3个分离物均与WYMV分离物聚类到一起,其中枣庄分离物和河南分离物(FR828007)亲缘关系更近。     

小麦黄花叶病毒衣壳蛋白的原核表达及抗血清制备

通过RT-PCR方法扩增获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的衣壳蛋白(CP)基因,将其连接原核表达载体p EHISTEV,并将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta,经IPTG诱导后,可以表达38 k D的融合蛋白。通过切胶回收的方法收集目的蛋白,免疫新西兰长耳兔,制备WYMV CP的多克隆抗体。间接ELISA测定该抗血清效价为1∶2 048,Western blotting分析表明该血清可以与病株中CP发生特异性反应,而与健康植株汁液无反应。该血清为WYMV的检测及CP功能的研究奠定了基础。     

基于SYBR Green检测小麦黄花叶病毒的两步法qPCR

小麦黄花叶病毒病是其常发病,常造成严重减产。为建立可用于定量检测小麦黄花叶病毒(WYMV)拷贝数的q PCR方法,本研究对不同来源的WYMV小种序列进行比对分析,在序列保守区域设计引物11对,对其退火温度进行优化,进而建立各引物的q PCR标准曲线。结果发现,11对引物的扩增效率在50.60%~116.04%之间,仅2对引物可用于后续研究,扩增效率分别为97.21%(WY-05和WY-06)和91.85%(WY-F2和WY-R2)。利用其中的WY-F2和WY-R2对高抗和高感WYMV的小麦品种进行分析,结果显示,抗感小麦品种WYMV拷贝数差异极显著。对抗感分离群体266个单株进行分析,发现该q PCR方法灵敏度显著高于酶联免疫吸附剂测定法,更适用于抗感杂交分离群体的表型鉴定,因而可以用于抗WYMV基因的遗传定位与图位克隆工作。     

小麦3种病毒病BSMV、BYDV-PAV、WYMV及WBD植原体病害的多重PCR同步检测

 【目的】通过对检测小麦病毒病和植原体病害的多重PCR体系各成分和循环参数进行摸索和优化,建立了一种同时检测大麦条纹花叶病毒（barley stripe mosaic virus,BSMV）、大麦黄矮病毒PAV株系（barley yellow dwarf virus,BYDV-PAV）、小麦黄花叶病毒（wheat yellow mosaic virus,WYMV）和小麦蓝矮植原体（wheat blue dwarf,WBD）的多重PCR技术体系。【方法】运用根据3种病毒核苷酸保守区序列设计的特异性引物对、根据WBD植原体核糖体蛋白基因序列设计特异性引物对rpF1/R1,从影响多重PCR（M-PCR）扩增的引物浓度、Mg2+浓度、Taq DNA聚合酶浓度、dNTPs浓度、退火温度等方面进行多重PCR体系的优化。【结果】成功的在一个体系中对BSMV、BYDV-PAV、WYMV和WBD复合侵染的小麦材料进行多重PCR扩增,得到503、600、898、1 240 bp 4条特异性大小与试验设计相符的条带,建立了同时检测4种病原的多重PCR体系。【结论】该体系实现了植原体DNA病原和病毒RNA病原的同时检测,体现了多重PCR的优越性。     

小麦黄花叶病毒P1蛋白原核表达、抗血清制备及其检测

用RT-PCR方法从感染小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)扬州分离物的小麦叶片中扩增获得该病毒P1基因的全长cDNA片段,并进行了序列分析。结果表明,P1基因编码区含有765个核苷酸,编码1个由255氨基酸组成分子量为28.2 kDa的蛋白。将P1基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中构建重组原核表达载体pGEX 6P-1-P1,经IPTG诱导,P1蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-P1的融合蛋白,纯化并制备了P1蛋白的兔抗血清。利用此抗血清,可以检测WYMV病叶中的P1蛋白,但与提纯的WYMV粒子没有血清学反应,表明P1没有参与WYMV粒子的包装,是一种非结构蛋白。     

驻马店地区小麦黄花叶病害病原鉴定与品种抗性评价

为了解驻马店地区小麦黄花叶病病毒分离物的类型及该地区主要推广小麦品种对小麦黄花叶病的抗性表现,对驻马店地区13个不同地点同一小麦品种上病毒分离物进行鉴定,并在同一田间试验条件下,对驻马店地区主要推广的12个小麦品种进行田间抗性评价。结果表明,随机选取的13个地点中有4个地点的样品中检测出小麦黄花叶病毒(WYMV),占总样品的30.8%,所有地点均未检测到中国小麦花叶病毒(CWMV)。在供试的12个小麦品种中,豫农416和衡观35表现为高抗,占供试品种的16.7%;泛麦8号和华育198表现为中抗或中感,占供试品种的16.7%;另外8个品种则表现为感病,占供试品种的66.6%。不同小麦品种在病圃区的产量及产量构成因素存在较大差异。以上结果表明,WYMV在驻马店地区有一定范围的分布,暂未检测到CWMV;该地区主推的小麦品种中豫农416和衡观35对小麦黄花叶病具有一定的抗性。     

小麦黄花叶病的扩展新发现及防治探究

小麦黄花叶病毒(WYMV)是由禾谷多黏菌传播的一类小麦病毒。WYMV具有广泛的世界性病害,给全球范围内的小麦等粮食作物带来了巨大的危害。在我国主要侵染冬小麦,且黄河以北地区鲜见报道其发病情况。而本文作者第一次在黄河北部地区——河南安阳的部分麦田发现了由WYMV侵染引发的小麦黄花叶病害,这给广大北方农田的小麦黄花叶病害防治工作敲响了警钟。本研究将从小麦黄花叶病害的发现过程、发病区域、致病原理及在农业生产中的防治工作等方面进行总结,并展望防治该病害的应用前景。     

Responses of Some American, European and Japanese Wheat Cultivars to Soil-Borne Wheat Viruses in China

Wheat seeds of 109 cultivars from USA, Europe and Japan were sown in experiments at seven sites in different provinces of China for one or two seasons. Five of the sites were infested with the bymovirus wheat yellow mosaic virus (WYMV) and two jointly with WYMV and the furovirus Chinese wheat mosaic virus (CWMV). Disease symptoms were assessed visually and leaf samples were tested for virus(es) by ELISA. At least 29 cultivars were resistant to WYMV at the sites where only this virus was present but all the cultivars were severely infected at Rongcheng (Shandong Province) where CWMV was mixed with WYMV. There was evidence that the presence of CWMV assisted infection by WYMV and also resulted in more severe symptoms.At the mixed site in Yantai, Shandong Province, symptoms were mild and many cultivars had symptomless infection. Of the two strains of WYMV identified in Japan, the Chinese sites seem to be most similar to the type isolated, WYMV-T. Eleven cultivars seemed to be susceptible to WYMV only at Loutian (Hubei Province),suggesting that the virus at this site would be worth studying further.     

小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位

通过RT PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)扬州分离物P2基因,并进行序列分析。P2基因编码区含有2 635个核苷酸,编码一个由875个氨基酸组成的分子量72 kDa 的蛋白。在原核表达体系中,该基因的全长表达较困难,因此将P2基因的5′端和3′端各设计大约1 kb亚克隆到原核表达载体pMAL C2X中构建重组表达载体MBP P2N,MBP P2C,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达MBP P2N和MBP P2C融合蛋白。MBP P2C融合蛋白经大量诱导、纯化、制备相应抗血清。用制备的抗血清可以有效检测WYMV病叶中的P2蛋白。免疫胶体金标记实验表明在感病WYMV的小麦叶片细胞膜状内含体结构中发现有大量胶体金颗粒特异性分布,表明P2蛋白可能与膜状内含体结构有关。     

小麦黄花叶病毒P3蛋白致病功能域的鉴定和分析

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)隶属于马铃薯Y病毒科(Potyviridae)大麦黄花叶病毒属(Bymovirus),其基因组由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。先前的研究表明,马铃薯Y病毒组多种病毒编码的保守蛋白P3具有多种功能,在病毒复制、致病性、克服宿主抗性、细胞间移动等方面均具有重要作用,而P3在大麦黄花叶病毒属中是否有类似功能目前还未见报道。本研究利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的本氏烟基因沉默系统,明确了WYMV的P3碳端在本氏烟上具有致病功能域P3-C,但完整的P3则不具有致病能力。进一步移码突变研究表明,P3-C的致病性是由其编码的多肽引起的,而非病毒来源的小干扰RNA介导的宿主基因沉默。同时P3-C的两个跨膜结构域对致病性具有重要作用,单独表达任何一个跨膜结构域P3-C均不能在本氏烟上引起明显症状。     

寡糖·链蛋白对小麦抗黄花叶病毒的免疫诱抗作用

【目的】激发子可以诱导寄主植物的系统获得抗病性,具有有效性、持久性和广谱性的特点。研究旨在明确新型激发子寡糖·链蛋白(oligosaccharins·plant activator protein)对小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)的免疫诱抗作用,为该激发子的研究和大面积推广应用提供技术支撑。【方法】选用小麦黄花叶病感病品种‘矮抗58’,在室内将消毒的小麦种子播种于自感病田带回的病土中,在(27±2)℃下培养。5叶期叶面喷施稀释1 000倍的6%寡糖·链蛋白。喷施7 d后,将麦苗置于(12±1)℃培养箱中接种培养。30 d后取出麦苗,分别测量小麦株高和叶片的叶绿素含量,计算病情指数和防治效果。在田间,同品种小麦种植于小麦黄花叶病常发地块,小麦返青后每周喷施1次6%寡糖·链蛋白,连续喷施3次。每周测量小麦株高和叶绿素含量,计算病情指数和防治效果。并于调查期间,每小区取20片植株最上部第一片完全展开的叶片,通过q PCR检测小麦植株内WYMV-CP基因拷贝数。在小麦收获时测定千粒重和穗粒数,测算产量。【结果】低温培养30 d后,经寡糖·链蛋白喷施处理的小麦较对照组的株高没有显著差异,但叶绿素含量则明显高于对照组(P0.05);同时处理组的病情指数较对照组明显降低,防治效果达到63.32%。田间经寡糖·链蛋白处理后,小麦株高和叶绿素含量较对照没有显著差异。小麦返青期,喷施1周后病情指数与对照没有显著变化;而2周后病情指数显著降低,防治效果可达46.67%。小麦收获时调查发现,经寡糖·链蛋白处理后小麦穗粒数显著高于对照组(P0.05),小麦产量明显升高(P0.05)。病株内WYMY-CP基因拷贝数在喷施1周后抑制率达到69.30%,2周后达到85.50%,3周后最高达到99.20%。【结论】寡糖·链蛋白可诱导小麦植株对小麦黄花叶病毒的抗性,显著降低小麦植株内WYMV-CP基因拷贝数;在田间可以减轻小麦黄花叶病的危害,减少产量损失。     

几种检测兎轮状病毒抗原方法的比较(节选)

本文应用间接ELISA法、直接ELISA、对流免疫电泳(CIEP)法和琼脂扩散(ID)法检查了腹泻死亡兔的肠内容物样品32份,从中检测出兔轮状病毒抗原,其检出率分别为50%、43.75%、28.13%。和15.63%。各法的检出率和符合率有明显差异。比较试验表明,检测兔轮状病毒抗原的四种方法各有优缺点。其中,以间接ELISA法较为敏感,以CIEP法较为快速和适用。     

山羊关节炎-脑炎ELISA方法的建立及其应用

 应用间接酶联免疫吸附试验（ELISA），检测了山羊关节炎-脑炎病毒（CAEV）试验感染山羊和自然感染山羊的血清抗体，确定了最适宜的反应条件。CAEV感染山羊血清终点滴度结果表明：ELISA比琼脂扩散试验（ID）敏感性高，对自然感染山羊检出率比ID高3%左右。CAE标准阳性血清和自然感染阳性血清预先被特异性抗原中和后的ELISA反应均呈阴性，从而证实了本方法的特异性。因此，本方法适于CAE的流行病学调查和监测工作。     

小麦黄花叶病毒编码VPg蛋白N端结构是VPg与核仁蛋白Fibrillarin互作区域

小麦黄花叶病毒（Wheat yellow mosaic virus,WYMV）属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,其基因组是由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。其中,VPg（Viral protein genome\|linked）作为病毒末端结合蛋白,与病毒基因组RNA 5’端共价连接。利用软件分析WYMV VPg蛋白氨基酸序列发现其N端具有核定位信号（NLS）序列,C端具有核输出信号（NES）序列。通过激光共聚焦显微镜观察VPg与GFP融合蛋白在烟草细胞中的表达情况发现,GFP\|VPg主要定位于细胞核中。利用eYFP（n）标记核仁结构蛋白Fibrillarin与VPg进行双分子荧光互补实验发现,VPg与Fibrillarin互作且定位于细胞核中。根据VPg结构特点构建一系列缺失突变体与Fibrillarin的互作实验验证了它们之间的互作区域发生在N端NLS区域。