小麦SBEⅡa、SSⅡa基因片段的克隆及VIGS重组载体的构建

[目的]克隆小麦SBEⅡa、SSⅡa基因部分序列并构建二者的VIGS重组载体,为在小麦上利用VIGS技术研究SBEⅡa、SSⅡa基因与小麦淀粉合成的关系奠定基础.[方法]根据GenBank中公布的小麦SBEⅡa(AF286319.1)、SSⅡa(AF155217.2)基因序列分别设计特异引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡa、SSⅡa基因的特异片段.然后以BSMV:γ-PDS为原载体,通过酶切连接用SBEⅡa、SSⅡa基因片段分别将原载体中的PDS基因进行替换,从而构建BSMV:γ-SBEⅡa和BSMV:γ-SSⅡa重组载体.[结果]克隆的SBEⅡa和SSⅡa基因片段长分别是178 bp和171 bp.序列分析表明:SBEⅡa基因片段与小麦SBEⅡa(AF286319.1)序列同源性为100;;、SSⅡa基因片段与SSⅡa(AF155217.2)序列同源性也为100;;酶切鉴定结果表明成功构建BSMV:γ-SBEⅡa和BSMV:γ-SSⅡa重组载体.[结论]构建的BSMV:γ-SBEⅡa和BSMV:γ-SSⅡa重组载体将为下一步利用VIGS技术在小麦上研究SBEⅡa、SSⅡa基因与小麦淀粉合成的关系奠定基础.     

小麦淀粉合成相关酶基因 SSⅡa、 SBEⅡa和 SBEⅡb表达序列多态性及对淀粉质量分数的影响

为了探究小麦淀粉合成相关酶SSⅡa、SBEⅡa和SBEⅡb基因表达序列核苷酸多态性及其与淀粉质量分数的关系,根据GenBank中已公布的基因序列设计特异引物,克隆基因的表达序列并测序,通过Clustal X2比对分析,用Dnasp 5.0计算核苷酸多态性信息,并建树做单倍型与淀粉质量分数的相关分析。结果表明,克隆得到3个基因的ORF(Open reading frame)序列,NCBI/Blast同源比对SSⅡa、SBEⅡa和SBEⅡb与GenBank中已登记的序列的同源性分别为98.19%、98.64%和99.04%。在SSⅡa、SBEⅡa和SBEⅡb中分别发现40、14和18个SNP位点,其中共包括4个InDel。在SSⅡa中,其第2外显子区为变异富集区,Tajima’s D检验D值均不显著。可见,这3个基因的多态性信息均较丰富,其单核苷酸多态性与小麦淀粉质量分数之间存在一定的对应关系。     

玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的克隆与过表达载体的构建

【研究目的】克隆玉米分支酶基因SBEⅡb并构建该基因的过表达载体pCASBEⅡb。【研究方法】从糯玉米（Waxycorn）新鲜胚乳中提取总RNA,利用RT-PCR方法克隆玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA。【结果】克隆得到了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的全长cDNA,用BLAST软件作同源序列比对的结果显示,该片段的核苷酸序列与GenBank上报道的序列具有99%的同源性,全长2719bp,编码799个氨基酸。【结论】将该基因连接到携带GUS报告基因的植物表达载体pCAMBIA1303中,并通过了GUS活性检测,说明已成功构建了玉米淀粉分支酶基因SBEⅡb的过表达载体pCASBEⅡb。     

木薯淀粉合成酶SSS Ⅱ基因片段的克隆与分析

[目的]建立木薯块根RNA的提取方法,并克隆和鉴定淀粉合成酶SSS Ⅱ基因核心片段。[方法]采用改良的CTAB法提取木薯块茎RNA,反转获得cDNA模板,同时基于已知植物的SSS Ⅱ基因同源性,设计简并引物,进行RT-PCR扩增,通过Blast在线检索比对对基因功能进行了初步鉴定。[结果]所获得片段即为木薯SSS Ⅱ基因的核心序列。[结论]该研究为木薯淀粉合成酶SSS Ⅱ基因全长cDNA序列的克隆及其反义载体的构建奠定了基础,同时为实现优质淀粉的代谢工程提供了理想的候选基因。     

小麦抗白粉病基因Pm4b的RGA分析

为克隆抗性基因和发展Pm4b的特异分子标记奠定基础。利用10对RGA引物,对小麦抗白粉病基因的一些载体品种(系)进行扩增,将引物对R11F/R11R从Pm4b基因的载体品种VPM中扩增出的稳定多态性条带回收、克隆、测序,获得与小麦Pm4b基因的相关抗病基因的同源片段,并对不同的小麦Pm基因载体品系作了检测分析。该稳定多态性条带全长1 321 bp。序列分析表明这个片段属于RGA类序列。用该标记检测小麦不同Pm基因载体品种(系),发现该多态性片段仅出现在Pm4b基因载体品种中。该研究可为分离抗性基因和发展Pm4b的特异分子标记奠定基础。     

木薯DBE和SBE基因的序列分析及其茉莉酸甲酯诱导表达特性

为研究木薯中调控支链淀粉合成的DBE和SBE基因如何被茉莉酸信号调控,首先对木薯基因组数据库中的Me DBE和Me SBE2.1基因进行序列分析,二者都具有α淀粉酶催化结构域且启动子区都具有茉莉酸响应元件等多种响应元件。以木薯品种‘华南八号’悬浮培养细胞为材料,利用q RT-PCR检测木薯Me DBE和Me SBE2.1基因在茉莉酸甲酯处理后的表达特性。结果显示:Me DBE基因的表达在最初短暂上调后持续下调,而Me SBE2.1则持续上调后又恢复最初水平,说明Me DBE和Me SBE2.1基因可被茉莉酸信号调控,进一步推测表明,其受到不同激素信号整合后的综合调控,以影响支链淀粉的生物合成。     

牡山羊草puroindoline a基因的克隆与表达分析

puroindoline a （Pin a）和puroindoline b（Pin b）是控制小麦籽粒硬度的主效基因。根据已报道的小麦Pin a基因的保守序列,设计合成了1对特异性引物ForA1和RevA1,对六倍体牡山羊草Aegilops juvenalis（UUMMDD）的基因组DNA和胚乳cDNA进行Pin a基因扩增、克隆、序列测定和表达分析,发现了1个新型Pin a（Pin a～allele）,其ORF长4／17bp,编码148个氨基酸残基,具有麦类作物Pin a基因特有的28个氨基酸的信号肽序列和WRWWKWWK的色氨酸结构域基因序列,与软粒小麦cv.capilole的Pina—Dla相比较,其核苷酸同源性和氨基酸同源性分别为98．7％与96．6％。Pin a～allele含有1个紧邻色氨酸结构域的突变位点（Gln 77Leu）。RT～PCR证实了Pin a在籽粒胚乳中的表达。Soulhern Blot分析结果表明,牡山羊草中Pin a基因含有1个拷贝。研究结果表明,山羊草中包含着与小麦差异较大的籽粒硬度控制基因。     

农杆菌介导的双SBE基因RNAi载体对水稻的遗传转化

[目的]提高水稻中直链淀粉的含量,扩大稻米的利用范围。[方法]以水稻中花11品种为材料,通过农杆菌介导法,侵染水稻幼胚诱导出的愈伤组织,将淀粉分支酶基因SBE1和SBE3同时导入受体愈伤组织,经过一系列的共培养、预分化、分化、生根壮苗后,获得含有转基因的转化植株,并对转化植株进行PCR鉴定。[结果]通过用根癌农杆菌介导法,侵染由水稻幼胚诱导的274粒愈伤组织,经过共培养、筛选,得到177粒抗性愈伤,然后将抗性愈伤预分化、分化得到103株分化苗,生根壮苗后获得49株转基因植株;从49株转基因植株中随机提取34株的基因组DNA,利用PCR技术从基因组DNA中扩增得到了片段大小约为500 bp的潮霉素基因序列。[结论]初步证实转基因植株的真实性,淀粉分支酶基因SBE1+SBE3成功整合进入水稻基因组中。     

火炬松生长和松脂性状相关候选基因的单核苷酸多样性分析

[目的]对火炬松Pinus taeda生长和松脂产量相关功能基因单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism,SNP)位点进行筛选与分析,为分子标记辅助育种提供技术基础.[方法]利用生物信息学对火炬松cDNA文库进行整理、比对、剪接、注释,挑选出与生长素、赤霉素、细胞分裂素及蒎烯合成相关的非重复序列基因(Unigene)作为候选基因片段,利用MEGA5.0和DnaSP4.0软件对火炬松36个单株的8个候选基因片段进行序列比对和分析.[结果]所测序列总长为5 177 bp,检测到184个SNP位点,平均36.9 bp的基因序列中出现1个SNP位点,其中123个为非同义突变、61个为同义突变SNP位点.核苷酸多态性πa和θw分别为0.020和0.016.对8个候选基因片段内SNP位点进行的连锁不平衡分析显示,随着核苷酸序列长度的延伸,SNP位点的连锁不平衡在基因内部迅速衰退(R2≤0.2).[结论]在火炬松中,基于候选基因内SNP位点间的连锁不平衡作图是可行的.     

云南切梢小蠹热激蛋白40基因的克隆与序列分析

[目的]克隆云南切梢小蠹(Tomicus yunnanensis)热激蛋白40基因,并进行序列分析,得到该基因的特征。[方法]采用RACE克隆技术,获得云南切梢小蠹热激蛋白40基因,并对该基因进行分析。[结果]试验获得的基因序列长为1 205 bp,开放阅读框1173 bp,编码氨基酸序列390个,编码蛋白质的预测分子量为43.56 ku,等电点为7.35。该基因蛋白序列具有1个Amidation位点,2个天冬酰胺N末端糖基化位点,2个CAMP和CGMP依赖性蛋白激酶磷酸化位点,3个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,7个N末端十四烷基化位点,4个蛋白激酶C磷酸化位点,1个RGD细胞附着序列,1个DNAJ-1结构域等热激蛋白40所具有的典型特征。[结论]通过同源性比对分析发现,云南切梢小蠹热激蛋白40基因与家蚕(Bombyx mori)、赤拟谷盗(Tribolium castaneum)、美洲斑潜蝇(Liriomyza sativae)和东亚飞蝗(Locusta migratoria)的热激蛋白40基因在氨基酸水平上一致性为20%~30%,它们的相似性均不高。虽然不同昆虫Hsp40在进化过程中具有高度的保守性,编码序列变异比较低,但是结构域差异与生物体适应外界环境有一定的关系。     

斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列分析及原核表达

对斜纹夜蛾核型多角体病毒ⅡORF56基因的序列特征及原核表达进行了初步研究.ORF56基因编码区全长675 bp,编码224个氨基酸,预测编码蛋白分子量25.9 ku.序列分析显示,ORF56具有典型的晚期启动子特征序列GTAAG,推导的氨基酸序列中含有13个磷酸化位点和3个N-糖基化位点.PCR扩增获得该基因,克隆到融合表达载体pET-32a(+)中,在大肠杆菌BL21中诱导表达.用纯化的融合蛋白免疫家兔,制备了多克隆抗体,为深入研究SpltMNPVⅡORF56的结构与功能提供基础.     

甘蔗B家族蔗糖磷酸合成酶基因SofSPSB的克隆及原核表达

[目的]克隆甘蔗B家族SofSPSB基因并进行原核表达,为进一步研究甘蔗SPS酶学特性及SPS活性调控机制奠定基础.[方法]在进化分析的基础上,通过同源克隆获得甘蔗SofSPSB基因部分序列,再结合RACE技术获得全长cDNA序列.扩增SofSPSB基因ORF并连到原核表达载体pETBlue-2上,导入大肠杆菌BL21(DE3)中表达.[结果]通过比对B家族中进化关系很近的玉米(Zea mays)ZmSPS1和水稻(Oryza sativa) OsSPS1基因序列,并在保守区设计一对引物扩增获得甘蔗B家族SPS基因(SofSPSB) 2330 bp序列.结合5'-RACE和3'-RACE技术获得3481 bp SofSPSB基因全长cDNA序列,该序列包含一个3225 bp的开放阅读框(ORF);起始密码子(ATG)位于转录起始位点后56 bp处,终止密码子(TGA)后有一段201 bp的非编码序列,并带有真核生物典型的polyA尾巴;编码1074个氨基酸,SofSPSB与Zm-SPS1、OsSPS1的核苷酸序列同源性分别为94.7%和81.3%,氨基酸序列同源性分别为96.0%和83.9%;其理论分子量Mw=118.96 kDa,等电点pI=6.30.经原核表达后纯化获得带6×His标签的融合蛋白.[结论]克隆获得甘蔗B家族Sof-SPSB基因全长cDNA序列,成功构建了SofSPSB基因原核表达载体,使其在大肠杆菌BL21(DE3)中表达.     

木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基基因全长克隆

[目的]克隆木薯腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）小亚基基因cDNA全长序列,为木薯高淀粉品种的分子育种提供依据.[方法]根据木薯AGPase小亚基基因已知片段设计特异性引物,以木薯根、茎、叶为材料,利用PCR及RACE克隆木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列.运用生物信息学方法对其核苷酸序列和推导氨基酸的理化性质、蛋白质三级结构进行系统分析.[结果]克隆获得木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基cDNA全长1566 bp,其中包括1566 bp的完整ORF,编码一个含521个氨基酸的多肽.其理论蛋白质分子量57.01 kDa,等电点6.1,呈酸性.多重序列比较分析结果显示,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基核苷酸序列与蓖麻、麻风树和杨树相应序列的相似性分别为87％、87％和86％.结合系统进化树分析结果推测,木薯淀粉合成关键酶AGPase小亚基在不同物种及进化过程中具有高度的保守性.蛋白三级结构分析结果表明,木薯AGPase小亚基蛋白具有15个α-螺旋、24个β-折叠和多个转角.[结论]木薯AGPase小亚基基因cDNA全长序列与蓖麻、麻风树和杨树等具有较高的同源性.     

TcLr24小麦NBS-LRR同源基因的克隆与分析

目前已克隆的小麦抗叶锈病基因多数含有NBS类保守结构域,为克隆高抗叶锈病Lr24基因及其抗病相关基因,根据NBS保守结构域设计引物,对小麦抗叶锈病近等基因系TcLr24cDNA进行扩增,得到534bp的抗病基因同源序列。对该序列进行同源性检索并验证,获得1 408bp的电子延伸序列。以此通过RACE技术分别获取2 797bp和3 466bp的cDNA与gDNA全长产物,其翻译的蛋白质序列含有NBS保守区的P-loop、Kinase 2a、Kinase 3a、HD和LRR保守结构,与大麦等单子叶植物NBS类蛋白序列同源性较高,生物信息学分析表明其为稳定的亲水性蛋白,分子质量104.28ku,理论等电点6.15。半定量RT-PCR表明该片段所在基因序列为组成型表达。     

西伯利亚蓼乙二醛酶Ⅱ基因的克隆与表达模式分析

摘要[目的]克隆西伯利亚蓼（Polygonum sibiricum La3xm．）乙二醛酶Ⅱ基因并了解该基因表达模式。[方法]应用RACE技术和实时荧光定量PCR技术从西伯利亚蓼中克隆了具有完整编码区的乙二醛酶Ⅱ基因的cDNA序列,并对该基因在不同胁迫时间、不同组织的表达差异进行了比较。[结果]克隆的乙二醛酶Ⅱ基因cDNA为890bp,其中开放读码框为765bp,编码254个氨基酸,5’非翻译区为49bp,3’非翻译区为72bp,GenBank中登录号为HM241910。序列比对分析结果表明,该基因编码的乙二醛酶Ⅱ与乙二醛酶Ⅱ三型匹配最佳,并具备乙二醛酶Ⅱ的GloB、ComEC和Lactamase,B等结构域。实时荧光定量PCR分析显示,乙二醛酶II基因在正常生长的西伯利亚蓼地下茎、茎与叶中都有表达,其中茎的表达量最高。同时,乙二醛酶Ⅱ基因受3％NaHCO,胁迫诱导,其在不同部位的表达模式有差异。[结论]克隆了西伯利亚蓼乙二醛酶Ⅱ基因并初步阐明了其表达模式。     

利用PCR-SacⅡ-RFLP技术检测绵羊IGFBP-3基因多态性的研究

[目的]将IGFBP-3基因作为候选基因,寻找与绵羊羊毛品质等经济性状相关的SNP位点.[方法]利用PCR-SSCP和DNA测序快速筛查SNP位点;在此基础上建立PCR-RFLP检测方法,分析该位点在不同品种绵羊中的基因型和等位基因分布情况;通过多重比较分析不同基因型与中国美利奴羊部分羊毛性状的关联性.[结果]以绵羊基因组DNA为模板扩增得到了249 bp的特异条带,PCR-SSCP及测序分析显示在该序列的140碱基处发生了G/T突变,导致SacⅡ酶切位点消失.经PCR-SacⅡ-RFLP检测,哈萨克羊和中国美利奴羊细毛羊得到三种基因型:TT(249 bp)、GG(139 bp/110 bp)和TG(249 bp/139 bp/110 bp);杜泊羊中出现GG和TG两种基因型;湖羊、小尾寒羊以及萨福克羊中只有GG一种基因型.关联性分析表明不同基因型与部分羊毛性状没有明显的相关性.[结论]在绵羊IGFBP-3基因嫩含子4区发现一个新的SNP位点,玻建立PCR-SacⅡ-RFLP检测方法;该位点不同等位基因和基因型在不同绵羊品种中的分布具有一定规律性;不同基因型与中国美利奴细毛羊部分羊毛性状中间没有明显的相关性.     

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)热休克蛋白HSP30基因的克隆与组织表达

[目的]获得卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)HSP30基因并探讨其组织表达.[方法]采用RACE的方法从卵形鲳鲹脾组织克隆HSP30基因的cDNA全序列,并用荧光定量PCR分析在健康鱼及哈维氏弧菌感染后HSP30基因的组织表达.[结果]HSP30基因cDNA序列全长913 bp,包含5′非编码区(5′UTR)89 bp、3′非编码区(3′UTR)188 bp,开放阅读框(ORF)636 bp,编码211个氨基酸.预测其氨基酸序列成熟肽的蛋白分子质量为24.1 kD,理论等电点为5.62.HSP30包括N-末端序列(NTS)、α-晶状体蛋白结构域(ACD)、C-末端序列(CTS)和C-末端延伸(CTE).系统进化分析结果显示卵形鲳鲹HSP30与高体鰤(Seriola dumerili)HSP30聚为一支.卵形鲳鲹HSP30基因在各组织中均有不同程度的表达,其中肝组织中表达量最高,其次为皮肤、肌肉、脾、心、肾,其他组织的表达量较低.哈维弧菌侵染卵形鲳鲹后,肝、脾和肾组织中HSP30基因mRNA表达量均升高,肝组织中变化最显著.[结论]成功克隆了卵形鲳鲹HSP30基因,为进一步揭示卵形鲳鲹HSP30的抗菌免疫应答机制提供了理论依据.     

陆稻过氧化氢酶基因（OsCATB-lh） 的克隆及生物信息学分析

为深入了解陆稻过氧化氢酶(CAT)基因的序列特点和生物信息学信息,以粳型陆稻品种泸旱3号为材料,利用同源克隆技术成功获得1条陆稻CAT基因序列(Gen Bank登录号:KR133179)。该序列全长1 739 bp,其中编码区ORF全长1 479 bp,编码492个氨基酸。生物信息学分析发现,此基因是位于水稻基因组第6号染色体的单拷贝基因。对其编码蛋白分析表明,其具有过氧化氢酶保守结构域,属于CAT家族。与水稻CAT基因序列(Os CATB)进行比较发现,Os CATB-lh与水稻Os CATB基因核苷酸序列一致性达到99%,存在6个核苷酸差异位点;与水稻Os CATB蛋白序列一致性为99%,有3个氨基酸变异位点。     

2个淀粉含量不同木薯品种SSⅡ基因序列及不同生育期淀粉含量比较

以高淀粉木薯品种FX 01和低淀粉木薯品种SC 124为材料,探讨可溶性淀粉合成酶基因SSⅡ序列以及在不同生育期其淀粉特性的差异。结果表明:在SSⅡ的编码区发现了2个差异位点,这2个位点的突变导致了基因编码的蛋白发生了改变,分别由谷氨酰胺变成精氨酸和亮氨酸变成苯丙氨酸。在淀粉积累的各个时期,高淀粉木薯品种FX 01的支链淀粉、直链淀粉、总淀粉含量均显著高于低淀粉木薯品种SC 124。     

通过CRISPR/Cas9技术靶向编辑SSSⅡb基因改良稻米品质

[目的]本文旨在利用基因编辑技术,降低水稻直链淀粉含量,改善稻米食味品质特性,以培育直链淀粉含量降低的优质育种材料.[方法]利用CRISPR/Cas9基因编辑技术,下调水稻品种'宁粳4号'淀粉合成基因(SSSⅡb)的表达,对转基因家系进行目标基因的分子鉴定和主要农艺性状、生理生化指标的测定,选出目标育种材料.[结果]对...