小麦PDS基因VIGS载体构建体系的优化及验证

为在小麦上进行VIGS体系的优化,根据GenBank中公布的小麦PDS基因序列(FJ517553.1)设计特异引物,利用RT-PCR技术克隆PDS基因片段,以BSMV:γ-2a为原载体,通过酶切将原载体中的2a基因片段替换为PDS基因片段,构建小麦PDS基因的VIGS重组载体BSMV:γ-PDS。经测序确认,其与GeneBank中登录的小麦PDS基因序列同源性为97%。重组载体经本实验室简化改良的方法进行转录模板的处理。与试剂盒所提供的方法相比,本研究将RNA酶孵育处理步骤整合入质粒提取的步骤中,省略了SDS-蛋白酶K孵育处理等步骤,降低了引入新杂质的风险,同时降低了实验成本,节省了时间和精力。体外转录的电泳结果表明,体外转录反应的产物浓度大,条带单一,可用于接种实验。抽穗期小麦穗部接种实验及实时定量PCR的结果均表明,小麦内源PDS基因被有效沉默,证实了优化的重组载体BSMV:γ-PDS体系的有效性,奠定了利用VIGS载体侵染抽穗期小麦体系优化的基础。     

小麦籽粒淀粉含量的QTL定位及效应分析

为深入了解小麦籽粒淀粉含量的遗传特性和QTL效应,选择淀粉含量差异较大的小麦品种M344和武春3号杂交,创制F2∶3群体,并利用973对SSR引物对小麦籽粒总淀粉、直链淀粉和抗性淀粉含量进行基于混合线性模型的QTL定位及效应分析。构建了包含有163个标记的遗传连锁图谱,分布于18条染色体,连锁图谱总长度为1 622.5cM,标记间平均距离为9.95cM。QTL分析表明,共检测到4个主效QTL和12对上位性QTL,涉及1B、2B、2D、4A、5D、6A和7A等16条染色体。其中,抗性淀粉含量上位性QTL3对,总淀粉含量上位性QTL 4对,直链淀粉含量上位性QTL 5对,总贡献率分别为8.34%、17.50%和8.13%。总淀粉和直链淀粉含量各检测到1个加性QTL,抗性淀粉含量检测到2个加性QTL,贡献率分别为5.34%、8.49%、11.47%、12.53%。研究发现,2B染色体Xwmc453.3~Xcfd44.2标记区间的QTL位点同时影响抗性淀粉和总淀粉含量,2D染色体Xgwm296~Xgwm455.2标记区间的QTL位点同时影响抗性淀粉和直链淀粉含量,7A染色体Xwmc488.1~Xwmc488.2标记区间的QTL位点同时影响直链淀粉和总淀粉含量。     

功能标记的开发及在禾谷类作物中的应用

功能标记是根据与表型紧密相关的功能基因内部特定区域多态性基序开发出来的一种新型分子标记。由于功能标记直接来源于基因内部的功能性基序,因此,此类标记可以对不同遗传背景下目标等位基因的有无作直接、快速的判定。本文在3种DNA分子标记基于植物中的开发、应用特点比较论述的基础上,重点介绍了功能标记的开发特点,最后探讨功能标记作为一种辅助育种手段在禾谷类作物常规育种中的应用及其开发前景。     

小麦淀粉合成相关酶基因 SSⅡa、 SBEⅡa和 SBEⅡb表达序列多态性及对淀粉质量分数的影响

为了探究小麦淀粉合成相关酶SSⅡa、SBEⅡa和SBEⅡb基因表达序列核苷酸多态性及其与淀粉质量分数的关系,根据GenBank中已公布的基因序列设计特异引物,克隆基因的表达序列并测序,通过Clustal X2比对分析,用Dnasp 5.0计算核苷酸多态性信息,并建树做单倍型与淀粉质量分数的相关分析。结果表明,克隆得到3个基因的ORF(Open reading frame)序列,NCBI/Blast同源比对SSⅡa、SBEⅡa和SBEⅡb与GenBank中已登记的序列的同源性分别为98.19%、98.64%和99.04%。在SSⅡa、SBEⅡa和SBEⅡb中分别发现40、14和18个SNP位点,其中共包括4个InDel。在SSⅡa中,其第2外显子区为变异富集区,Tajima’s D检验D值均不显著。可见,这3个基因的多态性信息均较丰富,其单核苷酸多态性与小麦淀粉质量分数之间存在一定的对应关系。     

小麦淀粉合成酶SSⅡa基因克隆及生物学分析

淀粉合成酶SSⅡa基因是小麦淀粉合成中的关键酶基因。为了从分子水平上了解造成不同小麦品种（系）淀粉含量差异的原因,本研究根据GeneBank中的SSⅡa基因序列AF155217.2设计引物,对8个不同抗性淀粉含量的小麦品种（系）SSⅡa基因进行克隆和多态性分析,并对其氨基酸序列进行结构域预测。结果表明,8个品种的SSⅡa基因序列高度保守,与GeneBank中已发表的序列相似度达98.19%以上,共发现40个单核苷酸变异,导致20个氨基酸发生了变异。蛋白结构域分析发现这些变异位点均位于α-淀粉催化酶氨基N-末端外侧,而在α-淀粉催化酶的催化区域并未发现变异位点。另外,在新春12中,还发现了一个缺失位点,缺失片段为249 bp,该缺失片段包含了糖基转移酶的部分位点。本研究为进一步从分子水平理解SSⅡa基因的结构与抗性淀粉含量之间的关系及开发分子标记辅助选择育种提供了序列信息。     

MS-222对杂交鲟幼鱼的麻醉效果及模拟运输试验

为了研究MS-222对杂交鲟的麻醉和运输效果,采用药浴麻醉的方法研究了杂交鲟[西伯利亚鲟(Acipenser baerii)(♀)×史氏鲟(Acipenser schrenckii)(♂)]幼鱼在不同浓度和不同水温下的麻醉效果,同时还模拟进行密封运输试验。结果表明:在17℃、20℃、23℃和26℃水温下,MS-222对杂交鲟幼鱼的有效麻醉浓度分别为30.89 mg/L~42.13 mg/L、31.15 mg/L~45.12 mg/L、38.45 mg/L~54.52 mg/L和49.02 mg/L~60.53 mg/L。随着MS-222溶液浓度升高,杂交鲟幼鱼进入麻醉状态所需时间缩短,其复苏所需时间增加。杂交鲟幼鱼麻醉时间有随水温降低而缩短的趋势,复苏时间有随水温降低而延长的趋势。在22℃±0.5℃水温和40 mg/L浓度下,麻醉运输12 h以1∶8的鱼水比的运输效果最好;麻醉运输24h以1∶15的鱼水比的运输效果最好;麻醉运输48 h以1∶25的鱼水比运输比较合适。试验表明:MS-222对杂交鲟幼鱼有较好的麻醉复苏效果,其适宜浓度为40 mg/L~50 mg/L,在保证较高运输存活率情况下,可降低密封袋的用水量,从而减少运输成本。     

小麦花后籽粒抗性淀粉含量累积动态分析

为了给小麦抗性淀粉(Resistant starch,RS)的生物合成调控提供依据,以3个抗性淀粉含量差异较大的春小麦品种新春24、安农9912和E28为材料,分别测定其花后6、9、12、15、18、21、24、27、30 d籽粒中的抗性淀粉含量,并进行了净遗传增量的估算.结果表明,三个品种的抗性淀粉含量在籽粒灌浆期均呈现双峰曲线变化.新春24籽粒的抗性淀粉含量在花后15d达到第一个累积高峰,而安农9912和E28籽粒的抗性淀粉含量在花后18 d后才达到第一个累积高峰(其中E28的峰值最高),花后30 d安农9912和新春24再次达到第二个累积高峰.通过各时期籽粒抗性淀粉含量净遗传增量的变化可以了解与抗性淀粉合成相关基因的表达量和效果.本研究结果显示,控制抗性淀粉含量的基因在整个籽粒灌浆时期均有表达,不存在时间上的间断,并且控制抗性淀粉合成的基因在灌浆末期的表达量对成熟籽粒抗性淀粉的含量起重要作用.     

抗性淀粉含量不同的小麦品种(系)淀粉分支酶SBE Ⅱa和SBE Ⅱb基因多态性分析

[目的]克隆抗性淀粉含量不同的小麦品种(系)中淀粉合成酶关键基因SBEⅡa和SBEⅡb进行多态性分析,从分子水平阐述不同小麦品种(系)间抗性淀粉含量差异的原因.[方法]根据GeneBank中公布的小麦SBEⅡa(AF286319.1)和SBEⅡb(AY740401.1)基因序列设计特异性引物,利用RT-PCR技术克隆SBEⅡa和SBEⅡb基因序列,利用Clustal.W进行测序结果的比对分析,NCBI Conserved domain和intePro在线网站对SBEⅡa和SBEⅡb氨基酸序列进行结构域预测,寻找影响抗性淀粉含量的主效基因位点.[结果]克隆了SBEⅡa(2 471 bp)、SBEⅡb(2 510 bp)基因ORF(open reading frame,ORF)全长.序列分析表明:SBEⅡa、SBEⅡb基因与公布的序列同源性分别为98.64;和99.07;.[结论]SBEⅡa基因ORF的三个结构域中未发现影响籽粒抗性淀粉含量的候选差异位点.在SBEⅡb基因编码区羧基C-末端的3个候选差异位点和α-淀粉催化酶结构域的1个候选差异位点可能是造成小麦品种(系)间抗性淀粉含量差异的原因.SBEⅡa、SBEⅡb氨基N-末端前面序列中共计10个单碱基变异作为潜在差异位点,也可能参与SBE基因的表达.