双抗夹心荧光免疫吸附测定法(sFLISA)定量检测转基因玉米中Bt蛋白

将量子点(Quantum Dots,QDs)应用于标记羊抗兔多克隆抗体,并利用Bt杀虫晶体蛋白作为标准蛋白和免疫抗原,通过抗体-抗原-抗体-量子点标记抗体反应,建立了双抗夹心荧光免疫吸附测定法(sFLISA),以定量检测转基因玉米中的Bt表达蛋白.研究结果表明,该方法的最低检测限为3 pg/mL,线性检测范围为6～200 pg/mL,回收率在90.0%～105.9%,变异系数在3.0%～12.6%.     

双抗夹心荧光免疫吸附测定法（sFLISA）定量检测转基因玉米中Bt蛋自

将量子点（Quantum Dots,QDs）应用于标记羊抗兔多克隆抗体,并利用Bt杀虫晶体蛋白作为标准蛋白和免疫抗原,通过抗体-抗原-抗体-量子点标记抗体反应,建立了双抗夹心荧光免疫吸附测定法（sFLISA）,以定量检测转基因玉米中的Bt表达蛋白。研究结果表明,该方法的最低检测限为3pg／mL,线性检测范围为6-200pg／mL,回收率在90.0％-105.9％,变异系数在3.0％-12.6％。     

新城疫病毒检测方法的研究进展

新城疫是由新城疫病毒(NDV)引发禽类的烈性、急性、高度接触性疾病,禽类感染NDV后的死亡率可达100%,国际兽疫局(OIE)将其列为动物A类疫病。因此,对新城疫病毒进行简便、快速、准确的检测具有重要意义。本文从病毒分离及鉴定、免疫血清学检测、分子生物学检测、量子点技术、荧光微球检测技术方面阐述了NDV检测技术进展,以期为临床和科研工作者提供一定的参考。     

鸡新城疫病毒和禽肺炎病毒二重RT-PCR检测方法的建立及应用

[目的]建立一次性可同时扩增鉴别鸡新城疫病毒(NDV)和禽肺炎病毒(APV)的二重RT-PCR,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供技术支持.[方法]根据GenBank已发表NDV的F基因序列(GenBank登录号JX840454)和APV的F基因序列(GeneBank登录号AF187154)分别设计2对特异性引物,应用这2对引物建立可同时检测鉴别NDV和APV的二重RT-PCR,对扩增条件进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验和临床样品检测等验证其实用性.[结果]优化后的二重RT-PCR可特异性扩增出参试NDV毒株(LaSota株、F48E9株、I株)及APV/MN-10毒株的目的条带,其大小分别为247和424 bp,而其他对照参试毒株在247和424 bp处均无特异条带出现.二重RT-PCR针对NDV和APV的最低检出限均为10 pg的RNA.应用建立的二重RT-PCR对132份从广西采集的病鸡样品进行检测,结果得到NDV阳性样品26份、APV阳性样品2份,与血清学方法的鉴定结果一致.随机选取的2份NDV阳性PCR产物与NDV(GenBank登录号JX840454)的F基因序列一致,同源性达100%;2份APV阳性PCR产物与APV(GenBank登录号AF187154)的F基因序列也完全一致,同源性达100%.[结论]针对NDV和APV建立的二重RT-PCR具有特异性好、灵敏度高、简便快速的特点,可用于临床快速鉴别诊断,为有效防控鸡新城疫和禽肺炎病毒病提供了技术支持.     

禽流感病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

采用饱和硫酸铵初步纯化的兔抗AIV-H9高免血清中的IgG作为包被抗体,利用抗AIV-NP-7B4单抗作为ELISA的第二抗体,建立了检测禽流感病毒（AIV）抗原的双抗体夹心ELISA方法。经方阵滴定试验测定反应的最佳工作条件：兔抗AIV-H9高免血清IgG包被稀释度为1：8000（浓度为3.531μg/ml）,抗AIV-NP-7B4单抗腹水最佳使用稀释度为1：800,酶标二抗的工作浓度为1：4000。与其他禽易感病毒（NDV、IBV、EDS-76V）等均没有交叉反应。结果表明,该方法具有快速、敏感、特异等优点,可应用于AIV的检测和流行病学调查。     

基于量子点的赭曲霉毒素AsFLISA检测技术研究

建立了基于量子点标记技术的赭曲霉毒素A(Ochratoxin A,OTA)双抗夹心荧光免疫检测(sandwich fluorescence-linked immunosorbent assay,sFLISA)体系,包含多克隆包被抗体、生物素标记的多克隆检测抗体、量子点标记的链霉亲和素等,获得了sFLISA的最佳操作参数:包被抗体浓度2.5μg/mL,检测抗体稀释500倍,量子点标记链霉亲和素稀释100倍。该方法在OTA浓度3.125~125μg/L之间时,相对荧光强度和OTA浓度呈线性关系,回归方程为y=0.0206x+0.2018,R2=0.9924;加标回收率在90.1%~110.0%之间,变异系数均小于10%,能较好地进行赭曲霉毒素A的定量检测。     

禽偏肺病毒乳胶凝集试验检测方法的建立与应用

【目的】建立禽偏肺病毒乳胶凝集试验检测方法,以快速、有效、准确地检测该病毒。【方法】用制备的禽偏肺病毒抗体致敏乳胶,与禽偏肺病毒反应,优化最佳致敏条件,建立禽偏肺病毒乳胶凝集试验检测方法;对该方法的重复性与特异性进行检测,将该方法与套式RT-PCR进行比较,并将其用于临床病料的检测。【结果】禽偏肺病毒抗体致敏乳胶的最佳致敏温度为56℃,抗体最佳稀释度为1∶10(体积比),最佳致敏时间为120min。用建立的乳胶凝集试验检测方法和套式RT-PCR同步检测10份禽偏肺病毒尿囊液,两者的阳性检出率一致,总符合率为100%。应用该方法对采自山东省不同地区的68份可疑临床病料进行检测,阳性检出率为26.47%。【结论】建立了禽偏肺病毒乳胶凝集试验检测方法,该法具有快速、简便、准确、特异性强、重复性和稳定性良好等优点,是一种适于基层单位检测禽偏肺病毒的可靠方法。     

新城疫病毒xx08株HN蛋白主要抗原区的原核表达及其在抗体检测中的应用

为建立检测新城疫病毒(NDV)抗体的间接ELISA方法,构建了新城疫(ND)xx08株HN基因抗原表位集中区基因片段的重组表达质粒p ET28a-r HN,加入IPTG进行诱导表达,经SDS-PAGE鉴定表明,表达的重组蛋白大小约为28 ku。Western blot分析表明,该重组蛋白具有良好的反应性。以纯化的HN蛋白为包被抗原建立检测NDV抗体的间接ELISA方法,优化试验条件后,抗原最适包被浓度为5μg/m L,血清最适稀释比例为1∶80,与HI试验结果符合率较高,且与鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性支气管炎病(IBV)、鸡禽流感病毒(AIV)和鸡马立克氏病毒(MDV)等标准阳性血清无交叉反应。表明建立的间接ELISA方法可以用于临床新城疫抗体的检测。     

禽白血病检测方法的建立和比较

提纯的禽成骨髓细胞增生病病毒(AMV)经用吐温-80和乙醚裂解后免疫兔,能获得抗禽白血病病毒(ALV)群特异性(gs)抗原的高特异性抗体,试验结果表明这种抗体能满意和有效地用于各种检测方法中。葡萄球菌 A 蛋白的酶联免疫吸附试验(PPA-ELISA),酶联免疫吸附访验(ELISA),免疫酶组化法(IHCA)和琼脂扩散沉淀试验(AGP)四种方法的比较结果为:PPA-ELISA 的检出率最高,ELISA 的检出率为略低,其次为 IHCA 的检出率,AGP 的敏感性为最低。综合评定为ELISA 是一较为理想和经济的检测方法。广东省部分鸡场抽样检查的结果表明,各鸡场的 gs 抗原的阳性率是很高的,蛋清和胚胎中 gs 抗原的阳性率也很高,显然 ALV 的先天性传递在本病的流行病学中是非常重要的。     

用胶体金免疫电镜技术检测新城疫病毒

应用柠檬酸三钠还原法制备了20 nm的胶体金颗粒标记NDV抗体,并且用直接电镜、免疫电镜和胶体金免疫电镜技术比较观察了新城疫病毒.证明胶体金免疫电镜技术作为检测NDV的检测方法具有简单、快速、准确和无污染等优点.     

检测猪瘟病毒胶体金和量子点试纸条的初步研制

为建立快速、简便检测猪瘟病毒(CSFV)抗体的方法,本研究采用胶体金和量子点免疫层析技术,将纯化的重组CSFV E2蛋白作为捕捉抗原,以纯化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗体和HRP兔抗猪IgG分别包被于硝酸纤维素膜上,作为质控线(C线)和检测线(T线),优化反应条件,制备免疫层析试纸条,用于临床检测。结果表明,制备的2种试纸条都可用于检测CSFV标准阳性血清,使用不同批次试纸条进行检测,结果无差异。2种试纸条与CSFV阳性血清反应呈阳性,与伪狂犬病毒(PRV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和圆环病毒2型(PCV2)反应呈阴性;胶体金试纸条在临床样品中阳性检出率为84.38%(81/96),与CSFV抗体检测ELISA试剂盒检测阳性符合率为92.05%(81/88);量子点试纸条阳性检出率为87.50%(84/96),与ELISA试剂盒检测阳性符合率为95.45%(84/88)。本研究制备的2种试纸条都具有较好的特异性、敏感性、重复性和稳定性。     

禽流感病毒与新城疫病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank登录的禽流感病毒(AIV)M1基因与新城疫病毒(NDV)M基因核苷酸序列,设计用于扩增AIV与NDV的RT-PCR引物,建立了AIV与NDV二重RT-PCR检测方法。敏感性和特异性试验结果表明,该方法对AIV与NDV的最低核酸检出量分别为38和27 pg,可同时扩增出428 bp(AIV)与297 bp(NDV)的特异性片段,而对传染性法氏囊病毒、传染性支气管炎病毒与鸭肝炎病毒的检测结果均为阴性。该方法可用于2种病毒病的临床快速检测与流行病学调查。     

抗独特型单克隆抗体在鸡中诱导的抗新城疫病毒保护性免疫——新城疫单克隆抗独特型疫苗研究(Ⅲ)

用AFE_8Id_(16-6)和ALA_(15-6)Id两株新城疫病毒(NDV)的抗独特型单抗(MAb_2)分别免疫接种一组(18只)无HI抗体鸡,并以一组(7只)Lasota苗常规免疫鸡和一组(12只)不免疫的易感鸡分别作为免疫阳性和阴性对照。在两株MAb_2末次免疫后8天,用微量血凝抑制(HI)试验检测了4组鸡的血清中HI抗体水平。结果:两株MAb_2和Lasota苗免疫的鸡全都产生了HI抗体,非免疫鸡均未测到HI抗体。AFE_8Id_(16-6)免疫鸡的HI滴度为1～5log_2;ALA_(15-6)Id免疫鸡的HI滴度为1～4log_2;Lasota苗免疫鸡的HI滴度高达7～10log_2。在HI抗体检测后2天,用100LD_(50)F_(48)E_8株NDV强毒攻击4组鸡,隔离观察10天,AFE_8Id_(16-6)和ALA_(15-6)Id免疫鸡的保护比值分别为17/18和10/18,Lasota苗免疫鸡保护比值达7/7,而非免疫对照鸡在攻毒后6天全部死亡。试验结果证明,上述两株MAb_2是NDV保护性抗原的模拟物,在多次注射后可诱导鸡产生抗NDV的血凝抑制抗体,并能使鸡抵抗NDV强毒的人工感染。因此,这两株抗独特型单抗,尤其AFE_8Id_(16-6)有希望用作新城疫抗独特型疫苗。     

猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法的建立及应用

【目的】快速了解猪群感染猪流行性腹泻病毒或免疫猪流行性腹泻病毒相关疫苗后猪群特异性SIgA抗体水平。【方法】对猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)ZJ08株进行纯化，采用纯化的病毒作为包被抗原，以辣根过氧化物酶标记的SC(Secretory component,SC)多克隆抗体为标记抗体，通过优化检测条件，建立乳汁中猪流行性腹泻病毒特异性SIgA抗体间接ELISA检测方法。【结果】成功建立了猪流行性腹泻病毒SIgA抗体检测方法。PEDV抗原的最佳包倍浓度为0.6μg·孔^-1，样本最佳稀释比例为1∶5，作用时间1 h;SC标记抗体最适稀释比例为1∶100，作用时间1.5 h。建立的ELISA方法能够特异性检测样本中抗PEDV SIgA抗体，与PoRV(Porcine rotavirus, PoRV)、 TGEV(Transmissible gastroenteritis virus, TGEV)的阳性乳汁均无交叉反应；批内、批间重复试验的变异系数小于10%，具有良好的特异性和重复性。通过临床采集的乳汁样品测定发...     

抗鸡法氏囊病和新城疫高免蛋黄液的研制与应用

本文报道了用鸡传染性法氏囊病病毒(IBDV)和新城疫病毒(NDV)经多次、高度免疫的健康蛋鸡,从其所生产的蛋中,提取蛋黄,制成抗IBDV和NDV二联高免蛋黄液。其抗NDV的HI抗体和抗IBDV的中和抗体、沉淀抗体均达到较高的水平。经室内人工发病治疗试验及大田生产应用证明:鸡只注射二联高免蛋黄液之后,在短时间内对IBD及ND有预防作用;对刚发病的鸡群,及时用其注射治疗,效果显著。     

新城疫病毒灭活苗免疫佐剂HVJ-E的研究

将SPF鸡分为4组,分别注射PBS、仙台病毒囊膜(HVJ-E)、新城疫病毒(NDV)灭活苗(KV)和HVJ-E+KV,于免疫后7、14和21d采血,测定血清中IFN-β、IFN-γ及抗NDV抗体的水平;免疫后21d以NDV强毒进行攻毒,攻毒后2、4、7和10d采集口咽腔、泄殖腔棉拭子分离病毒,以探讨HVJ-E作为NDV灭活苗佐剂的效果。结果表明:HVJ-E能显著提高NDV灭活苗的抗体产生水平并促进干扰素的分泌(P0.05),添加HVJ-E佐剂的灭活苗的保护率为100%,排毒率为0%,显著提高免疫鸡的保护率。证明HVJ-E具有很好的免疫佐剂特性。     

抗新城疫病毒血凝素中和性单克隆抗体的研制和免疫生物学特性鉴定——新城疫病毒的单克隆抗独特型抗体疫苗研究之一

作者以新城疫病毒(NDV)的强毒株F_(48)E_8为免疫抗原。应用淋巴细胞杂交瘤技术。获得6株抗NDV血凝素的中和性单克隆抗体,分别命名为F_4、FE_8、F_(14)、F_(14),FD_(12)和F_(32)。这6株单抗对NDV都表现出高度的血凝抑制(HI)活性和中和能力。其中FE_8和F_4单抗的HI效价分别达1:2~(17)和1:2~(16),鸡胚内中和效价分别达10~(-5)和10~(4.8)。这些单抗的特异性强,仅与NDV发生反应,而与感染家禽的常见病毒如传染性腔上囊炎病毒(IBDV)、小鹅瘟病毒(GPV)、鸭肝炎病毒(DHV)、鸭瘟病毒(DPV)均无交叉反应。在鸡体保护试验中,1ml 1:160倍稀释的FE_8或F_4腹水单抗均能使所试小鸡抵抗NDV强毒的攻击。上述结果表明,FE_8和F_4单抗不仅能为NDV的单克隆抗独特型抗体研制提供一种理想的免疫原(单克隆独特型抗体,Ab_1)。而且可用于新城疫的紧急预防。     

H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法的建立

【目的】H9亚型禽流感是重要的人兽共患性传染病,该亚型病毒为H7N9亚型和H10N8亚型流感病毒提供了6个内部基因（PB2、PB1、PA、NP、M、NS）,并且一直处于动态重组过程中。因此,建立针对H9亚型禽流感的型特异性电化学发光免疫的高通量快速检测方法,加强H9亚型流感的监测,具有重要意义。【方法】用钌联吡啶标记H9亚型AIV的单克隆抗体,用MPI-E型电致化学发光分析系统评价钌标单抗标记效率;用生物素标记H9亚型AIV的多克隆抗体,HABA法检测抗体生物素化的效率;待测抗原与钌标单抗作用1 h后,将此抗原-抗体复合物与通过生物素-链霉亲和素系统固定在磁微球表面的多克隆抗体反应,最后加入反应底物三丙胺后即可在电化学分析系统进行发光检测。优化生物素化多抗和钌标单抗最佳工作浓度,确定临界值和反应谱,对所建立的方法进行敏感性、特异性和重复性试验。攻毒后3 d和5 d,采集攻毒组和空白对照组鸡只的88份咽拭子和肛拭子,分别用电化学发光免疫检测方法和鸡胚病毒分离法进行检测和比较。【结果】钌标抗H9亚型AIV单克隆抗体的标记效率为每个单抗IgG分子上结合21个Ru²⁺,且间接免疫荧光方法证明其仍具有生物活性;生物素化兔抗H9N2亚型AIV多克隆抗体的标记效率为每个IgG分子上结合了6个生物素分子,且Western blotting试验证明其仍保持生物活性;该方法的检测临界值为28.3,可疑区间为23.4-33.2;阴性和阳性变异系数均小于10%;检测限为5×10⁴EID₅₀,能够特异性地检测H9亚型AIV,不与其他亚型流感病毒（H1、H3、H4、H5和H6亚型）和其他类型的禽源病毒（NDV、IBV和IBDV）反应。3 h内即可完成检测,与鸡胚病毒分离法的符合率为86.4%。【结论】所建立的H9亚型AIV型特异性电化学发光免疫检测方法可以用于临床样品检测,对H9亚型禽流感的监测和防控具有重要意义。     

鸡新城疫病毒、鸡细小病毒和禽流感病毒 三重PCR检测方法的建立及应用

【目的】建立能同时检测鸡新城疫病毒(NDV)、鸡细小病毒(ChPV)和禽流感病毒(AIV)的三重PCR检测方法,为临床上快速诊断及有效防控NDV、ChPV和AIV的单一或混合感染提供技术支持。【方法】参考NCBI中已公布NDV的F基因(登录号DQ195265.1)、ChPV的NS1基因(登录号GU214704.1)和AIV的M基因保守区(登录号DQ485211.1),设计合成针对NDV、ChPV和AIV的特异性引物,应用这3对引物建立三重PCR检测方法,对反应体系及扩增程序进行优化,并通过特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样品检测等评估其实用性。【结果】优化后的三重PCR反应体系为ChPV和AIV的上、下游引物各0.5μL,NDV的上、下游引物各1.0μL,NDV、ChPV和AIV的核酸模板各1.0μL,Premix Taq~(TM)12.5μL,无RNase水补足至25.0μL。最佳扩增程序:95.0℃预变性5 min;94.0℃1 min,58.5℃1 min,72.0℃1 min,进行35个循环;72.0℃延伸10 min,12.0℃结束反应。建立的三重PCR能同时扩增出NDV(453 bp)、ChPV(687 bp)和AIV(239 bp)的特异性条带,对应的最低检测下限分别为2.5 pg NDV、6.4 pg ChPV和2.0 pg AIV,但扩增传染性支气管炎病毒(IBV)、禽呼肠孤病毒(ARV)、马立克病毒(MDV)、传染性喉气管炎病毒(AILTV)和禽肺炎病毒(APV)等病原体均呈阴性。应用建立的三重PCR对50份鸡喉头或泄殖腔棉拭子样品进行检测,结果显示有1份NDV阳性、9份ChPV阳性和2份AIV阳性样品,其中包含2份ChPV和AIV均呈阳性的样品,1份ChPV和NDV均呈阳性的样品,与常规PCR的检测结果一致。【结论】建立的三重PCR能同时对NDV、ChPV和AIV 3种病原进行特异性诊断,在混合感染病例鉴别诊断方面具有广阔的应用前景。     

猪流行性腹泻病毒双抗体夹心ELISA检测方法的建立

以乳化灭活的猪流行性腹泻病毒(PEDV)作为抗原,免疫大白兔,制备兔抗PEDV高免血清,纯化抗PEDV IgG并进行生物素标记。以体外表达的PEDV S蛋白作为抗原,商品化的PEDV单克隆抗体作为捕获抗体,生物素标记的IgG作为检测抗体,建立了检测PEDV的生物素-亲和素系统的双抗夹心ELISA方法。结果表明:该方法最低检测限量为20 ng/μL,且稳定性和特异性较好。对25份临床猪腹泻样品进行检测,3份检出PEDV阳性,与RT-PCR法的符合率为100%。本研究为PEDV临床检测提供了新方法,也为猪腹泻病原的多重检测技术研究奠定了基础。