DNA条形码与实时荧光定量PCR技术在铁皮石斛鉴定中的应用

为建立铁皮石斛准确、高效的鉴定体系,本研究以101份石斛属和蝴蝶兰属植物样品为试验材料,通过对比ITS、psbA-trnH、matK及rbcL基因在石斛属植物中的鉴定能力,筛选出ITS作为本研究最理想的DNA条形码。以ITS序列作为靶基因,设计铁皮石斛特异引物和特异探针,以及石斛属通用引物和探针,利用实时荧光定量PCR(TaqMan)技术,建立铁皮石斛多重实时荧光PCR检测新体系,通过特异性、灵敏度和实际样本验证,发现参试样品中的25份铁皮石斛均可被有效鉴定,与其他鉴定方法相比,该方法具有特异性强、灵敏度高(高出普通PCR 100倍)、重复性好且高效经济的优势。本研究结果对铁皮石斛的资源保护与利用起到了积极作用。     

小麦AB基因组中一个重复序列的分离、定位与应用

利用102对微卫星引物对5份黑麦（Secale）、4份普通小麦（Triticum aestivum）和1份分枝小黑麦（Triticale）进行SSR分析,引物Xgwm614能在分枝小黑麦中扩增出一个387bp的特异DNA片段（记为FZ387,GenBank登录号为EF179137）,而黑麦未能扩增出。序列比对结果显示该片段与一粒小麦（T. monococcum）（AY485644）和栽培二粒小麦（T. turgidum）（AY494981）A基因组中Gypsy Ty3-LTR反转座子fatima的一部分分别有94%和95%同源性。根据序列同源性比对结果,在FZ387内部设计1对特异引物FaF和FaR。引物Xgwm614F和FaR能在含有A基因组的物种中扩增出约350bp的条带（记为A350）,而其不含A基因组的物种都未扩增出该条带。利用小麦二体和端体代换系材料对其进行定位,结果显示该片段分布在所有A染色体的长臂和断臂上。此外,引物FaF和Xgwm614R能在含有A、B或AB基因组的物种中扩增出约350bp的条带（记为AB350）,而不含AB基因组的材料未扩增出目标条带。利用这两对特异引物对小麦属近缘物种进行PCR扩增,发现只有中国春能够扩增出A350和AB350。序列比对结果和FZ387两侧SSR引物结合区的规律性变化表明该反转座子在进化上可能存在属间多样性和属内相似性。A350和AB350也可以分别作为分子标记检测A染色体和AB染色体。     

牛亚科MHC DRB3基因exon2的序列变异分析

根据牛（Bos taurus）主要组织相容复合体（MHC）DRB3基因的已知序列设计引物，对中国牦牛（B．grunniens）的DRB3基因exon2进行扩增和克隆测序，并根据DRB3基因exon2序列对牛亚科的遗传多样性和分子系统发育进行了分析。结果在234的片段中发现有115个多态位点，多态位点百分率为49．15％。由标准遗传距离和净遗传距离构建的牛亚科系统发育树，可将牛亚科分为5个属，支持将牦牛作为牛亚科中一个独立的属的观点。多态性较丰富的DRB3基因exon2适于属间系统发育分析。     

基于核糖体DNA第二内部转录间隔区(ITS2)序列鉴定四季青及其近缘种和混伪品

中药材四季青(Ilicis Chinensis Folium)的基原植物冬青(Ilex chinensis)是重要的园林观赏物种。利用DNA条形码技术可以快速、准确鉴定四季青及其近缘种和混伪品。本研究以冬青、铁冬青(Ilex rotunda)、秤星树(Ilex asprella)、枸骨(Ilex cornuta)和女贞(Ligustrum lucium)等37份植物样本为实验材料,提取全基因组DNA,扩增核糖体DNA第二内部转录间隔区(internal transcribed spacer 2,ITS2)序列并进行双向测序。测序结果利用Codon Code Aligner 4.2.7进行序列拼接,获得高质量ITS2序列。同时从Gen Bank中获得28条冬青的同属近缘种以及混伪品女贞、四川山矾(Symplocos setchuensis)的ITS2序列。基于隐马尔科夫模型(hidden Markov model,HMM)注释5.8S和28S,获得完整的ITS2区域,进而应用MEGA6.0(molecular evolutionary genetics analysis)进行冬青种间和种内序列分析,计算种内种间K2P(Kimura 2-parameter)遗传距离,构建邻接树(neighbor-joining tree,NJ tree)。结果表明,琼脂糖凝胶电泳得到清晰明亮的均一条带,说明利用通用的ITS2引物可以成功扩增到用于测序的PCR产物。通过PCR产物测序、数据处理和序列分析可知,冬青种内ITS2长度经过比对后为239 bp,全部样品的种间ITS2比对后长度为269 bp。冬青种内有4个变异位点以及6个单倍型,种间有143个变异位点,远远多于其种内变异位点。MEGA6.0分析结果表明,种间最小K2P遗传距离(0.094)大于种内最大K2P遗传距离(0.013)。邻接树显示,女贞和四川山矾分别以100%的自展支持率分别聚类,表现出良好的单系性,冬青属物种聚为一大支。冬青在冬青属下可以单独聚为一支,可以进行区分。冬青属其他物种以同一亚属聚为一支。研究结果表明,作为一种快速、准确、简便的分子生物学鉴定方法,ITS2可以应用于冬青及其近缘种和混伪品的鉴定,同时对于准确鉴定冬青属物种亦有巨大潜力,可为冬青属植物在临床上的用药安全和开发应用提供科学依据。     

蛋鸡卵巢PRSS23基因CDS序列分析

为获得蛋鸡丝氨酸蛋白酶23（PRSS23）的CDS序列并分析其结构域,试验根据NCBI中公布的其它物种PRSS23的mRNA序列,设计了特异性引物,采用RT-PCR技术扩增PRSS23 CDS全序列。BLAST比对发现,与其它物种PRSS23预测序列以及氨基酸序列同源性分别为99%、92%、91%、86%和100%、96%、96%、90%;通过分析该序列的三级结构,发现在第117到362位氨基酸之间含有一个典型的Tyrp-SPc结构域,该结构域具有典型丝氨酸肽链内切酶活性;通过对其蛋白信号肽预测分析,发现序列中含有信号肽,信号锚定的可能性为72.8%。     

应用线粒体DNA序列探讨羚牛分类地位

为探讨羚牛分类学地位,应用聚合酶链式反应（PCR）扩增了羚牛、绵羊、山羊和斑羚（青羊）线粒体DNA（mtDNA）细胞色素b基因（Cyt b gene）,并测序,结合GenBank检索序列,对9种偶蹄类动物、1种奇蹄类动物Cyt b gene序列差异进行分析,构建了分子系统树（最优NJ树和唯一MP树）。通过本研究分析表明羚牛与羊亚科动物亲缘关系最近,将羚牛归入羊亚科较为合理。     

ITS鉴定真菌病原：一例司法鉴定研究实例

本研究选择一例疑似空气污染物伤害松树的司法鉴定案作为研究实例,在现场勘察和初步形态鉴定的基础上,应用ITS序列分析鉴定了对疑似空气污染物伤害松树的病原做了分子鉴定。我们对委托鉴定的疑似空气污染物伤害松树的地及周边地区进行了勘查,现场勘查结果并不支持空气污染物伤害松树的看法。为明确松树枯死的原因,对取样病枝上的疑似病原物进行了显微镜观察和培养性状观察,根据显微镜下孢子的形态和病原菌的培养性状,初步判断导致马尾松枯死的病原可能为拟盘多毛孢属（Pestalotipsis）真菌。为进一步确定病原种类,我们应用分子生物学技术对危害马尾松的病原物进行了ITS分子鉴定。测定了疑似真菌的ITS序列,并进行了比对和系统发育分析。研究结果表明,导致松树枯死的病原菌系韦司梅拟盘多毛孢（Pestalotipsis vismiae）。在本研究案例中,利用真菌ITS序列的系统发育分析,快速、准确地鉴定了真正导致松树枯死的病原,为今后类似司法鉴定案件审理提供了证据鉴定的新手段。     

河南小麦黑胚病优势病原菌及其近似种rDNA-ITS序列分析

从河南省具有地域代表性的5个不同地区分离小麦黑胚病原菌Alternaria spp.菌株17株,经形态鉴定主要为链格孢属两个近似种A.alternata和A.tenuissima.通过与GenBank中登录的链格孢属中的9个种的rDNA-ITS序列比较分析,发现所有供分析菌株具有很高的同源性,其中与6个小孢子种A.alternata、A.tenuissima、A.mali、A.gaisen,A.citri、A.arborescens同源性为98%～100%,在聚类图上成为一支,而3个大孢子种A.radicina、A.porri和A.solani聚为另外一支,可明显地与其它小孢子种区分开.通过对Alternaria 58个菌株的rDNA ITS序列分析发现,同一个种或相似种内不分地域范围和寄主都有很高的保守性.与小孢子种相比,3个大孢子种在位点97-171、365-402、443-490处具有各自的特异位点,所以这些序列有可能作为它们分类鉴定、分子标记及系统发育的重要依据.分析结果表明,ITS1-5.8S-ITS2序列分析只能验证小麦黑胚病菌形态学鉴定的结果,但不能用于链格孢近似种的分类鉴定.     

杨桃细菌性斑点病菌的ITS序列分析及PCR检测

由丁香假单胞菌(Pseudomonas syringae pv.averrhoi)引起的杨桃(Averrhoa carambola)细菌性斑点病是杨桃生产上的重要病害.本研究利用细菌16S～23S rDNA间的内源转录间隔区(internal transcribed spacer ITS)序列通用引物Ll(5'-AGTCGTAACAACGTAGCCGT-3')和L2(5’-GTGCCAAGGCATCCACC-3’)扩增参试菌株的基因组DNA;并对其PCR产物进行克隆测序,经多重比对分析后设计出杨桃细菌性斑点病菌的特异性引物PsaveF(5'-CTTATCGACGACTCAGCTGCG-3’)和PsaveR(5’-TCATGCGTTGATCGTCAGGATC-3').此引物可以从杨桃细菌性斑点病菌基因组DNA中扩增出373bp的特异性片段,而其余参试的细菌无扩增条带,该引物检测的灵敏度可达10 pg,且可从自然发病的杨桃组织中扩增出特异性条带.表明该方法可以应用于杨桃细菌性斑点病的快速、灵敏、可靠的检测.此外,本研究对多种病原细菌的ITS序列进行比对分析,发现该病菌与核果树细菌性溃疡病菌Pseudomonas syringae pv.morsprunorum是近源种.该检测技术对杨桃细菌性斑点病害的控制有一定的实用意义.     

根据形态学和分子系统学特征界定拟盘多毛孢属的种

以拟盘多毛孢属108个ITS（内转录间区）序列建立了分子系统树,探讨拟盘多毛孢属的形态特征与分子系统树的相互关系.结果表明,拟盘多毛孢属首先按照分生孢子有色胞的颜色区分为暗色和淡色（同色）2个分支,暗色组再分成2个亚分支--同色亚分支和异色亚分支,淡色分支内进一步根据顶端附属丝特征和基部附属丝的有无区分为7个亚分支.寄主植物的某个分类单元在拟盘多毛孢属的分子系统树上并未形成特定的分支.通过对形态特征与分子系统树结合分析,重新界定小孢拟盘多毛孢（Pestalotiopsis microspora）、异色拟盘多毛孢（P.versicolor）和茶拟盘多毛孢（P.theae）.     

ITS鉴定木材种类：一例司法鉴定研究实例

本研究选取一例非法收购国家重点保护植物油丹的司法鉴定案作为研究实例,在确认鉴定技术可行的前提下,应用ITS序列分析对待检测的原木进行了分子鉴定。本研究采用CTAB法提取原木DNA,对其提纯后进行ITSrDNA的PCR扩增,再对PCR阳性产物进行克隆、测序,将测序结果进行Blast分析和构建系统发育树。结果表明,送检的47根原木中有9根被鉴定为油丹。本研究采用ITS序列系统发育分析方法,成功鉴定了原木种类,为今后类似司法鉴定案件的审理提供了可靠的鉴定意见。     

甘肃本地产当归、黄芪和大黄的rDNA ITS序列分析

本研究采用改良CTAB法分别提取18份甘肃本地产当归、黄芪和大黄基因组DNA,并用PCR分别扩增其ITS1-5.8S-ITS2序列、直接测序并作序列同源性比对分析。双向测序分析结果表明,甘肃6个不同产地当归rDNA的ITS1、5.8S和ITS2序列一致,片段长度分别为215bp、162bp和223bp;供试的黄芪ITS1、5.8S和ITS2序列分别为228bp、164bp和210bp;大黄ITS1、5.8S和ITS2序列分别为160bp、159bp和164bp。供试材料的ITS1-5.8S-ITS2核苷酸序列已提交GenBank。本研究为提供甘肃当归、黄芪和大黄指纹图谱鉴别的分子标记、其道地性药材的分子鉴定和品质评价提供参考。     

Bioguided fractionation and isolation of free radical scavenging components from in vitro propagated chinese medicinal plants Dendrobium tosaense Makino and Dendrobium moniliforme SW

This study was performed to investigate the free radical scavenging active components from in vitro propagated medicinal herbs of the genus Dendrobium, namely, Dendrobium tosaense Makino and Dendrobium moniliforme SW, using a 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) radical antioxidative assay. Seeds of the capsules derived after 12 weeks of hand-pollination germinated asymbiotically (50-74%) on half-strength Murashige and Skoog's (MS) basal medium with 3% sucrose and solidified with 0.9% Difco agar. Active growth in the germinated seedlings was achieved by reculturing on full-strength MS basal medium supplemented with 8% banana homogenate, 8% potato homogenate, 8% coconut water, 1.5% sucrose, and 0.9% Difco agar. Healthy plantlets transferred to plastic trays containing moss or moss and tree fern successfully acclimatized (84-100%) in the greenhouse. Extracts were prepared from plants grown in the greenhouse for a period of 6 months. Methanolic extracts of D. tosaense and D. moniliforme scavenged DPPH at 95.9 and 83.4%, respectively, at a concentration of 0.4 mg/mL. Therefore, methanolic solubles of D. tosaense and D. moniliforme were subjected to bioguided fractionation and separation by column chromatographic methods individually. After chromatographic separation of these crude extracts, the obtained fractions (Dm 1, Dm 2, Dm 3, Dt 1, Dt 2, and Dt 3) were tested for their activity. Among them, fractions Dm 2 and Dt 1 showed significant antioxidant activity by DPPH radical antioxidative assay. Active fractions were purified further by column chromatography and resulted in identification of the antioxidant components alkyl ferulates from D. moniliforme and quercetin from D. tosaense.     

山羊FSHR基因第10外显子的PCR-SSCP检测及其序列分析

利用PCR-SSCP技术检测山羊(Caprahircus)包括西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊173个个体FSHR基因第10外显子的单核苷酸多态性(SNP)。结果未发现SNP位点。测序后获得山羊FSHR基因第10外显子的核苷酸序列,并在NCBI数据库中获得GenBank登录No.DQ069909和DQ069910。通过DNA序列分析发现,FSHR基因第10外显子第120位碱基不存在C→T的转换,也不存在颠换等其它遗传变化。山羊、绵羊(OvisariesL.)和普通牛(Bostaurus)FSHR基因第10外显子序列同源性比较和聚类分析结果表明,山羊、普通牛和绵羊该部分序列的相似性最高为99.3%;在物种间比较中,绵羊和普通牛纯合子该基因外显子序列的不相似性最高为3.4%;据FSHR基因外显子序列构建的分子系统树结果显示,山羊、绵羊和普通牛物种内的个体各自聚为一类;山羊和绵羊先聚为一类,然后再与普通牛聚为一类。提示FSHR基因第10外显子的核苷酸序列适合于物种间的动物分子树的构建。     

of Goat Follicle-stimulating Hormone Receptor (FSHR) Gene

利用PCR-SSCP技术检测山羊(Capra hircus)包括西农萨能奶山羊、关中奶山羊、陕南白山羊、安哥拉山羊和波尔山羊173个个体FSHR基因第10外显子的单核苷酸多态性 (SNP)。结果未发现SNP位点。测序后获得山羊FSHR基因第10外显子的核苷酸序列， 并在NCBI数据库中获得GenBank登录No.DQ069909和DQ069910。通过DNA序列分析发现， FSHR基因第10外显子第120位碱基不存在C→T的转换，也不存在颠换等其它遗传变化。山羊、绵羊 (Ovisaries L.) 和普通牛( Bos taurus) FSHR基因第10外显子序列同源性比较和聚类分析结果表明，山羊、普通牛和绵羊该部分序列的相似性最高为99.3%；在物种间比较中，绵羊和普通牛纯合子该基因外显子序列的不相似性最高为3.4%；据FSHR基因外显子序列构建的分子系统树结果显示，山羊、绵羊和普通牛物种内的个体各自聚为一类；山羊和绵羊先聚为一类，然后再与普通牛聚为一类。提示FSHR基因第10外显子的核苷酸序列适合于物种间的动物分子树的构建。     

奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼SRY基因同源克隆和序列分析

采用人SRY基因保守序列的特异性引物，对奥利亚罗非鱼（Orcocbromis aureus）和尼罗罗非鱼（O．nilotica）雌、雄个体基因组进行PCR扩增，回收其中的600bp片段，分离克隆并双向测序。用DNAStar分析比较所得序列，表明克隆的600bp片段为SRY基因的同源序列。对两种罗非鱼雌、雄个体SRY同源序列进行多序列比较分析（CLUSTAL W分析），表明罗非鱼间SRY同源序列的相似性非常高，但仍存在性别间、种间差异。奥利亚罗非鱼雌、雄间序列相似性为99．5％，尼罗罗非鱼雌、雄间为99．5％，奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼种间则为98．7％，罗非鱼与人类SRY基因间只有7．1％，结果为进一步研究罗非鱼SRY同源基因与性别决定的关系提供了可能性。根据这些结果构建了罗非鱼系统分类树，表明奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼具有很近的亲缘关系。     

铁皮石斛EST-SSR分子标记的开发

为了开发铁皮石斛EST-SSR分子标记,利用SSRIT软件对铁皮石斛近缘物种-金钗石斛的15 383条EST序列进行SSR位点查找,利用Primer 5和Oligo 7软件进行引物设计和评价,之后经PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳对引物进行初步筛选,并通过聚丙烯酰氨凝胶电泳对所筛选的引物进行有效性检测。结果表明,SSRIT软件共查找到370条SSR位点序列,共有379个SSR位点,候选SSR位点出现的频率为2.46%。二核苷酸、三核苷酸和六核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占41.42%、26.91%和27.44%,其中二核苷酸重复中AG/CT(20.84%)和GA/TC(18.73%)最丰富;三核苷酸重复中TCT/AGA(4.22%)和GA/TC(3.96%)最丰富;而六核苷酸重复基元较多。EST-SSR平均长度为24 bp,平均每8.5条EST序列包含1个SSR位点。设计的106对EST-SSR引物中有50对能扩增出理想的PCR产物,引物有效扩增率为47.17%,其中有43对能够扩增出多态性条带,占可扩增引物的86%。本研究开发的43对引物为铁皮石斛遗传多样性分析、种质鉴定、遗传图谱构建和功能基因研究等提供了重要的参考价值。     

Classification of chemoautotrophic ammonia-oxidizing bacteria using pyruvate kinase genes as high resolution phylogenetic markers

Abstract

The phylogenetic relationship of β-proteobacterial ammonia-oxidizing bacteria (AOB) is mainly based on comparative sequence analyses of the genes encoding the 16S rRNA (16S rDNA) and the active site polypeptide of the ammonia monooxygenase (AmoA). However, classification of AOB with different morphotypes is not possible based solely on these markers. Pyruvate kinase (PYK), which is a key enzyme in the glycolytic pathway, functions at a primary metabolic intersection. The gene sequence of PYK is known to be a phylogenetic marker for bacteria and has been used for this purpose. The phylogenetic relationships of closely related AOB, ‘Nitrosolobus’, ‘Nitrosovibrio’ and Nitrosospira, were estimated based on pyk (PYK), a housekeeping and protein-coding gene. As a result, the pyk phylogenetic tree of the AOB showed a high resolution compared with the tree based on 16S rDNA sequences. Therefore, we conclude that analysis of the PYK gene sequences could play an important role in the in-depth classification and identification of AOB at a rank below the genus level.     

Design and evaluation of nematode 18S rDNA primers for PCR and denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE) of soil community DNA

Consensus nematode 18S ribosomal DNA primers were designed by aligning available 18S sequences and identifying a variable region flanked by highly conserved regions. These primers were then used to amplify nematode 18S rDNA from whole soil community DNA extracted from a range of European grassland types. Cloning of the PCR amplicons (778 bp) followed by restriction digest analysis (RFLP) resulted in the recovery of 34 unique nematode sequences from the four grasslands studied. Comparison of these data with the limited number of 18S rDNA nematode sequences currently held in on-line databases revealed that all of the sequences could be assigned to known nematode taxa albeit tentatively in some cases. Two of the sequences recovered from the site in the Netherlands (wet, hay-grassland) were recovered in a clade that included a sequence of the genus Trichodorus whilst other sequences from this site showed similarity with 18S rDNA sequences of the genus Prismatolaimus (five sequences), Xiphinema (one sequence) and Enoplus (one sequence). Of the remaining sequences, two showed some affinity with Mylonchulus (UK, upland peat), four with Steinernema (UK) and one sequence with Mesorhabditis (Hungary, east European Steppe). Three sequences from the Netherlands and one from Hungary were recovered in a clade that included a sequence of the genus Pratylenchoides whilst three further sequences from the Netherlands and two from Hungary were recovered in a clade encompassing the genus Globodera. Of the remaining nine sequences, two (NL6, NL62) formed a distinct lineage within the Adenophorea with 90% bootstrap recovery in a paraphyletic clade that included sequences of Prismatolaimus and Trichodorus. Seven sequences (three from the Netherlands, three from the UK and one from Greece) were left unassigned though the tree topology suggested some relationship (58% bootstrap recovery) with the genus Cephalobus. To assess whether primers used to amplify 18S rDNA might be used to fingerprint genetic diversity in nematode communities in soil, the environmental sequence data were used to design a second set of primers carrying a GC-clamp. These primers amplified a 469 bp fragment internal to the region flanked by the primer set used to derive the nematode trees and were used to amplify 18S rDNA for subsequent analysis using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). DGGE analysis of six major European grassland types revealed considerable genetic diversity between sites. However, the relationships seen with the DGGE data were inconsistent with previous studies where the same soils had been characterized with respect to functional and morphological diversity. To confirm that this second set of primers was amplifying nematode sequences, selected bands on the DGGE gels were extracted, PCR amplified and sequenced. The final alignment was 337 bases. These analyses revealed the presence of sequence signatures from the genera Paratrichodorus, Plectus, Steinernema, Globodera, Cephalobus and Pratylenchoides.     

河北安国7种中药材AM真菌遗传多样性研究

为探明药用植物根围AM真菌遗传多样性,于2010年8月在河北省安国市3个样地(中药材种植基地、霍庄、大户村)用随机抽样法采集7种中药材根围土壤样品,分离筛选双网无梗囊霉(Acaulospora bi-reticulata)为试验菌种,进行孢子DNA提取、PCR扩增、序列测定及聚类分析,研究了双网无梗囊霉遗传多样性与土壤因子的关系,并选取两条代表菌株所测序列,连同从NCBI数据库中下载的4属28种AM真菌相应序列构建系统发育树。结果表明,双网无梗囊霉可侵染不同样地不同宿主植物,3个样地7种中药材双网无梗囊霉DNA相似性达99.2%以上,其遗传特征保持了高度稳定性,双网无梗囊霉在样地和植物间具有广谱性。同一样地不同中药材根围土壤因子相似性很高,AM真菌DNA碱基序列相似系数也很高,而不同样地同一中药材根围AM真菌DNA碱基序列相似系数低于前者,可见遗传多样性与土壤因子密切相关。土壤因子对双网无梗囊霉基因序列的影响大于宿主植物的影响。