家兔细胞核移植技术研究

以家兔16－32细胞期胚胎卵裂为核供体，显微注射到去核卵母细胞周隙中，共制作完成229枚重组胚，2次电融合后率达到76．8％。重组胚与兔胚成胎成纤维细胞共同培养，卵裂率为65．7％（23／35），桑囊率达到22．9％（8／35），均显著高于（P＜0．01）微滴直接培养结果（43．3％、13／30；16．7％，5／30）。将111枚重组胚手术移植到9只同期发情的受体母兔输卵管中，2只妊娠，其中1只完成足月胚胎发育产出克隆仔兔2只。     

胚胎移植方法和受体母猪因素对克隆猪生产效率的影响

【目的】建立高效的胚胎移植技术体系,以提高克隆猪的生产效率。【方法】比较不同移植方法和不同受体母猪状况的胚胎移植分娩率和克隆猪的出生效率,利用体外发育能力相似的不同品种和发育阶段的克隆胚胎混合移植确定最佳的受体母猪发情同期时间。【结果】克隆胚胎经由输卵管伞移植比输卵管打孔移植具有更高的移植分娩率和克隆猪效率（2.2% 和0.4%,P＜0.01）,而胚胎移植后辅助人工授精会降低克隆效率（0.6% 和 2.2%,P＜0.01）。利用经产母猪作为移植受体比青年猪受体具有更高的克隆效率（3.0%和0.8%,P＜0.01）和平均窝产仔数（（5.5±0.7）头和（2.7±0.3）头,P＜0.05）。受体母猪发情时间比胚胎激活时间晚12-36 h组的克隆效率分别为显著（P＜0.05）和极显著（P＜0.01）,高于晚0 h和早12-24 h 组的克隆效率（2.0%、0.5%和0%）。最佳的受体母猪发情时间为晚于克隆胚胎激活后24 h,克隆效率达3.0%。【结论】选择自然发情时间晚于克隆胚激活后24 h的经产母猪为受体,通过输卵管伞端移植胚胎,能够获得较高的克隆效率,是猪克隆胚胎移植的较理想方法。     

肉羊胚胎移植成活的影响因素实例分析

【目的】胚胎移植技术是获得优秀种质资源的一种重要应用技术,研究影响胚胎存活和妊娠的因素。【方法】回顾性调查分析影响胚胎移植后成活的胚胎和受体因素。【结果】三种胚胎运输方式的妊娠率极显著低于就近移植的妊娠率(P0.01);胚胎卵裂期与囊胚期移植妊娠率差异不显著(P0.05),但以2细胞移植的妊娠率最低;鲜胚与冻胚的妊娠率差异不显著(P0.05),2枚胚胎的妊娠率高于1枚胚胎的妊娠率,胚胎妊娠率随着胚胎质量而下降;囊胚与受体同期性差-24 h,妊娠率差异不显著(P0.05);放牧与舍饲的受体羊在胚胎妊娠率方面没有显著差异性(P0.05)。【结论】胚胎和受体因素对胚胎发生成功妊娠具有重要的影响。     

牛胚胎移植试验研究

本研究应用国产激素和器械对奶牛进行超数排卵，采用胚胎移植技术使黄牛繁殖奶牛。５ａ共超排供体牛１８５头，成功１５９头，成功率为８１．９５％；共获卵１２０１枚，头均７．５５±６．３７枚，其中可用胚胎８８０枚，头均５．６８±４．９６枚。同期发情处理受体牛２３６头，发情１３９头，发情率５８．９０％；鲜胚移植受体牛１７８头，受胎７８头，受胎率为４３，８２％，其中移植受体黄牛１４５头，受胎６１头，受胎率４２．０７％，移植受体奶牛３３头，受胎１７头，受胎率为５１．５２％；冷冻胚胎移植受体牛６１头，受胎２７头，受胎率为３７．７０％；５３胚胎移植产犊８５头。确立了应用国产激素垂体促卵泡素（ＦＳＨ）和前列腺素（ＰＧＧ＿（２２））诱发牛超数排卵和发情同期化处理的最佳程序和剂量，并总结出了采卵方法、胚胎鉴定、胚胎冷冻保存和移植等相应环节的技术规程。     

FSH剂量、受体品种及移植胚胎数对崇明白山羊胚胎移植效率的影响

为提高崇明白山羊的繁殖效率,用促卵泡素（Follicle-Stimulating Hormone,FSH）对崇明白山羊进行超数排卵,回收2～4细胞期胚胎移植至同期发情受体的输卵管,跟踪受体妊娠和产羔结果,比较不同FSH剂量时的超排结果,比较受体品种和移植胚胎数对妊娠率和产羔率的影响。试验结果为：（1）对于体重在20～30 kg的崇明白山羊,FSH的最佳超排剂量为240 U,每头次超排平均可获得可用胚胎10.06枚。（2）每只受体均移植2枚胚胎时,徐淮山羊的早期妊娠率为56.44%（57/101）,高于崇波杂交羊组（崇明羊与波尔羊的杂交后代）47.62%（10/21）和徐波杂交羊组（徐淮羊与波尔羊的杂交后代）46.93%（23/49）,但各组间早期妊娠率差异均不显著。（3）移植4枚胚胎时,妊娠率为60.00%（12/20）、产羔率为1.75,均高于移植2枚胚胎组的52.82%（75/142）和1.30。而移植4枚时胚胎的得羔率为26.25%（21/80）,低于移植2枚胚胎组的33.25%（141/424）。这表明,移植4枚胚胎可以提高受体妊娠率和产羔率,但降低了胚胎利用率。     

初情期前母猪胚胎移植试验

１７７枚受精卵或２－细胞期胚胎，手术法移植到８头发情同期化的青年母猪体内，结果有４头妊娠，其中３头受体足月产仔２２只，另一头受体在妊娠８８天后宰杀，发现有６个发育正常的胎儿。移植受体妊娠率为５０％，移植卵成仔（胎）率为１５．８％。     

波尔山羊胚胎回收和移植器械研制与应用

采用自己研制开发的波尔山羊胚胎手术回收和移植的关键器械，共进行122只供体的胚胎回收，回收供体卵巢上正常黄体总计2751枚，回收卵总数2504枚，回收率达到92．3％。采用这种自行研制的胚胎移植器械进行胚胎的子官移植，将2127枚波尔山羊胚胎移植给1182只受体，受体妊娠率达到63．0％（745／1182），证明该胚胎移植器械和制定的应用程序是可行的。     

陕北白绒山羊种公羊的体细胞克隆

【目的】利用体细胞核移植技术克隆陕北白绒山羊优秀种公羊个体。【方法】以特别优秀成年陕北白绒山羊种公羊耳部皮肤成纤维细胞为供体细胞,体外培养成熟的陕北白绒山羊卵母细胞作为受体,利用显微操作方法对成熟卵母细胞进行去核操作,然后将供体细胞注射到其卵周隙内,经电融合将其导入去核卵母细胞内形成核移植重组胚。利用钙离子载体Ionomycine联合蛋白酶抑制剂6甲基氨基嘌呤（6-DMAP）对核移植重组胚进行激活处理,挑选激活后完整的胚胎继续进行体外培养,然后在2～16细胞期时将克隆胚胎移植到相应的同期发情受体母羊体内,利用PCRRFLP技术鉴定克隆羊。【结果】构建了体细胞核移植胚胎253枚,重组胚胎的融合率为71.54%(181/253),体外培养后的卵裂率为68.33%（123/180）,囊胚发育率为25.20%（31/123）;在此基础上,构建了537枚克隆胚,将其中卵裂的359枚分别移植到32只代孕母羊体内,移植60 d后,有2只受体母羊确认妊娠,最终1只受体母羊妊娠第4月流产出2只死羔;另1只受体母羊维持到期并顺产体细胞克隆羊1只。经遗传学鉴定,2只流产羊羔与1只存活个体均为体细胞核移植后代。【结论】获得陕北白绒山羊克隆个体,建立了相对完善的陕北白绒山羊克隆技术体系。     

影响绵羊、山羊超数排卵及胚胎移植效果因素分析

在生产条件下，对3个优良品种的127只绵羊（道塞特47只、萨福克49只、杜泊31只）和111只波尔山羊供体使用不同国别生产的促卵泡素（FSH）实施超数排卵处理，然后对1231只小尾寒羊和奶山羊受体实施不同方法的胚胎移植，旨在筛选出切合于生产实际成本低、效率高的超数排卵和胚胎移植方案。实验结果表明，使用新西兰产FSH对波尔山羊超数排卵后平均获得可用胚胎14枚／只，显著高于澳大利亚产FSH效果（平均7．59枚／只）（P〈0．05）．而中国科学院产FSH的超排效果（平均10．38枚／只）与新西兰产无显著性差异（P〉0．05）；进一步采用中国科学院产和新西兰产FSH分别对道塞特、萨福克和杜泊3个品种绵羊实施超数排卵结果，获得平均可用胚胎数均无显著性差异（P〉0．05）；使用腹腔内窥镜法和常规手术法胚胎移植结果表明，移植妊娠率分别为57．44％和60．20％．2种方法间无显著性差异（P〉0．05）。由于中国科学院产FSH价格便宜，而腹腔内窥镜法胚胎移植可大大缩短操作时间，两者结合可降低成本、提高效率，适宜羊胚胎移植产业化应用。     

受体牛品种和移植季节对胚胎移植妊娠率的影响

研究分析了不同受体品种、受体牛饲养方式和移植季节对胚胎移植妊娠率的影响。用于移植的冷冻性控胚胎由加拿大进口。移植的受体选用鲁西黄牛和西门塔尔牛。分析结果显示：受体牛品种对胚胎移植的妊娠率有一定的影响，鲁西黄牛的妊娠率相对较高（40．80％），而西门塔尔牛的妊娠率则相对较低（38.10％）。经卡方独立性检验受体品种与妊娠率之间无显著性关联（P〉0．05）。另外，受体牛饲养方式和移植季节对胚胎移植的妊娠率也有一定的影响，集中含饲条件下受体的整体妊娠率相对较高。秋季移植受体的妊娠率要比春季移植的相对稍高，但二者之间的差异均没有得到显著的水平。     

影响杜泊绵羊胚胎移植效果的因素分析

系统探讨了在生产条件下杜泊绵羊移植胚胎数量、胚胎发育阶段、受体重复利用、卵巢黄体数量、季节和移植方法对胚胎移植效果的影响.结果表明:移植2枚或3枚胚胎的妊娠率(63.79%、61.90%)显著高于移植1枚胚胎的妊娠率(50.30%)(P<0.05);2～8细胞胚胎的移植妊娠率与桑椹胚/囊胚移植妊娠率差异不显著(P>0.05);受体重复利用对妊娠率无显著影响(P>0.05);受体单侧卵巢上有3个及以上黄体数妊娠率最高,但与单侧卵巢上有1个和2个黄体的妊娠率无显著性差异(P>0.05);在秋季进行胚胎移植,妊娠率为59.77%,高于冬季移植的妊娠率(52.94%),但差异不显著(P>0.05);常规手术法与腹腔内窥镜法移植相比,妊娠率无显著差异(P>0.05).     

体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究(英文)

[Objective] The aim of this study is to understand the effects of donor cell type,embryo stage,number and transfer position on the efficiency of goat transgenic clone.[Method] Using somatic cell nuclear transfer technology,the single goat fetal fibroblasts(GFF)and mammary gland epithelial cells(GMGE)harboring human lactoferrin(hLF)gene were transferred to the enucleated oocyte.Reconstructed karyoplast-cytoplast couplets were fused,activated,and cultured in vitro.Embryos at 2-8 cell stage were transferred into oviduct of synchronized recipients,and blastocysts were transferred into uterine horn.[Result] The pregnancy rate was similar between GFF and GMGE(oviduct transfer:26.47% vs.20.00%),and between oviduct transfer and uterine horn transfer(26.47% vs.25.00%)for GFF group;pregnancy rate in the group with the mean number of embryo transferred per recipient of 21.2 was significantly higher than in those the 5.93 group and 9.64 group(40.00% vs.26.67% and 21.43%).[Conclusion] These results indicate that pregnancy rate of goat transgenic clone couldn’t be affected by donor cell type,embryo stage and transfer position but be done by the number of embryo transferred per recipient.In addition,the study also suggests the feasibility of making transgenic goat using GMGE as donor cells.     

兔胚胎玻璃化冷冻的研究

探讨用玻璃化冷冻法保存兔胚胎的效果．结果表明,兔早期囊胚在0．5M海藻糖（93．8％）溶液中的存活率显著高于0．5M蔗糖组（70．0％,P〈0．05）．对照组与不同浓度甘油处理间兔胚胎存活率均差异不显著（P〉0．05）．分别用不同浓度乙二醇玻璃化冷冻兔胚胎,解冻回收后正常胚胎数和囊胚孵化率,对照组与10％,20%EG组之间均差异不显著（P〉0．05）,但对照组,10％,20％EG组均显著高于30％EG组（P〈0．05）．解冻回收后正常胚胎数体内胚胎组（79．4％）显著高于体外胚胎（54．1％,P〈0．05）,囊胚孵化率2组之间差异不显著（P〉0．05）．缓慢冷冻法与玻璃化冷冻法之间胚胎解冻回收后正常胚胎数和囊胚孵化率均差异不显著（P〉0．05）．     

体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究(英文)

[Objective] The aim of this study is to understand the effects of donor cell type,embryo stage,number and transfer position on the efficiency of goat transgenic clone.[Method] Using somatic cell nuclear transfer technology,the single goat fetal fibroblasts(GFF)and mammary gland epithelial cells(GMGE)harboring human lactoferrin(hLF)gene were transferred to the enucleated oocyte.Reconstructed karyoplast-cytoplast couplets were fused,activated,and cultured in vitro.Embryos at 2-8 cell stage were transferred into oviduct of synchronized recipients,and blastocysts were transferred into uterine horn.[Result] The pregnancy rate was similar between GFF and GMGE(oviduct transfer:26.47% vs.20.00%),and between oviduct transfer and uterine horn transfer(26.47% vs.25.00%)for GFF group;pregnancy rate in the group with the mean number of embryo transferred per recipient of 21.2 was significantly higher than in those the 5.93 group and 9.64 group(40.00% vs.26.67% and 21.43%).[Conclusion] These results indicate that pregnancy rate of goat transgenic clone couldn't be affected by donor cell type,embryo stage and transfer position but be done by the number of embryo transferred per recipient.In addition,the study also suggests the feasibility of making transgenic goat using GMGE as donor cells.     

Pregnancies Resulting from Transgenic Embryos with Human Lactoferrin Gene Produced by Somatic Cell Nuclear Transfer

[Objective] The aim of this study is to understand the effects of donor cell type,embryo stage,number and transfer position on the efficiency of goat transgenic clone.[Method] Using somatic cell nuclear transfer technology,the single goat fetal fibroblasts(GFF)and mammary gland epithelial cells(GMGE)harboring human lactoferrin(hLF)gene were transferred to the enucleated oocyte.Reconstructed karyoplast-cytoplast couplets were fused,activated,and cultured in vitro.Embryos at 2-8 cell stage were transferred into oviduct of synchronized recipients,and blastocysts were transferred into uterine horn.[Result] The pregnancy rate was similar between GFF and GMGE(oviduct transfer:26.47% vs.20.00%),and between oviduct transfer and uterine horn transfer(26.47% vs.25.00%)for GFF group;pregnancy rate in the group with the mean number of embryo transferred per recipient of 21.2 was significantly higher than in those the 5.93 group and 9.64 group(40.00% vs.26.67% and 21.43%).[Conclusion] These results indicate that pregnancy rate of goat transgenic clone couldn't be affected by donor cell type,embryo stage and transfer position but be done by the number of embryo transferred per recipient.In addition,the study also suggests the feasibility of making transgenic goat using GMGE as donor cells.     

体细胞核移植法获得转人乳铁蛋白基因克隆山羊妊娠的研究

[目的]探讨供体细胞类型、移植胚胎发育阶段、数量及部位对山羊转基因克隆效率的影响。[方法]利用体细胞核移植技术将转染人乳铁蛋白基因hLF的山羊胎儿成纤维细胞(GFF)和乳腺上皮细胞(GMGE)移植到MII期去核卵母细胞内,经电融合、激活、体外培养后,2~8细胞期克隆胚被移植到同期发情山羊的输卵管内,囊胚被移植到子宫角内。[结果]GFF与GMGE的妊娠率相近(输卵管移植妊娠率分别为26.47%及20.00%);在GFF,输卵管移植的妊娠率与子宫角内移植妊娠率接近(分别为26.47%及25.00%),输卵管移植胚胎平均数为21.2组的妊娠率显著高于5.93组和9.64组(40.00%及26.67%,21.43%)。[结论]供体细胞类型、移植胚胎的发育阶段及移植部位对山羊转基因克隆效率的影响不大,但对于输卵管移植,受体羊移植胚胎数量对妊娠率有明显的影响。此外,该研究还提示了利用成年羊乳腺上皮细胞制作转基因动物的可行性。     

无角道塞特羊胚胎移植技术研究

(1)超排处理无角道塞特绵羊163只,育成羊(76只)只均回收胚胎5.53枚,可用胚3.91枚,经产母羊(87只)只均回收胚胎7.55枚,可用胚6.34枚。经产羊平均回收胚胎总数高于育成羊(P<0.05)。春季和秋季之间超排效果差异不明显。重复超排羊和非重复超排羊之间平均回收胚胎总数和可用胚胎数差异均不显著(P>0.05)。(2)共处理受体876只,春季和秋季受体的同期发情率分别为56.37%和89.02%,发情受体利用率分别为84.67%和88.77%。(3)移植受体545只,妊娠318只,产羔396只,受体移植妊娠率为58.35%,移植胚胎成羔率为57.47%,在移植受体中,小尾寒羊的妊娠率最高为61.2%,同羊和内蒙细毛羊分别为54.62%和56.58%,受体品种之间移植妊娠率差异不显著(P>0.05)。受体黄体数对移植妊娠率及胚胎成羔率有一定的影响。胚胎的发育阶段对移植妊娠率也有影响,移植囊胚受体妊娠率最高为64.76%,明显高于早期桑椹胚移植妊娠率42.86%(P<0.05)。胚胎成羔率从桑椹胚到囊胚差异不显著(P>0.05)。     

杜泊绵羊冷冻胚胎移植

介绍了从新西兰引进的冷冻杜泊羊胚胎解冻后移植到同期发情湖羊和小尾寒羊母羊受体的方法步骤,并分析、评价了胚胎移植的效果。结果表明:受体羊总平均同期发情率为78.4%,胚胎移植利用率达49.1%,妊娠率达59.4%,产羔率达58.0%,羔羊出生重为4.7 kg(公)和4.3 kg(母),羔羊1月龄和3月龄体重分别为14.9kg和32.4 kg;不同批次和不同品种受体间胚移效果亦存在不同程度的差异;4批次试验共移植冷冻胚胎475枚,产羔266只,现存活245只。该研究建立了可靠而有效的杜泊绵羊冷冻胚胎移植技术,有望在畜牧业科研和生产中广泛推广应用。     

食蟹猴-猪异种体细胞核移植胚胎的构建

[目的]探索食蟹猴—猪异种核移植胚胎的发育能力,为食蟹猴异种核移植胚胎干细胞的构建奠定基础.[方法]以食蟹猴和猪胎儿的耳部成纤维细胞为供体,猪MⅡ期去核卵母细胞为受体,构建异种核移植重构胚,并从核移植融合/激活方式、培养液两个方面进行优化.[结果]70枚食蟹猴—猪异种核移植胚胎中,有49枚分裂（70.0％）,与猪同种核移植胚胎的分裂率（76.6％）无显著差异;使用微卫星引物D15S823对食蟹猴—猪异种核移植胚胎进行遗传学鉴定,均能扩增获得D15S823条带（350 bp）;食蟹猴—猪异种核移植胚胎融合后1h的染色体早熟凝集率（24.2％）显著低于猪同种核移植胚胎（44.7％）和猪孤雌激活胚胎（100.0％）,通过使用无Ca2＋融合液能够显著提高染色体早熟凝集率（48.2％）;在PZM-3、HECM-10和HECM-10＋10％ FBS 3种培养液中,食蟹猴—猪异种核移植胚胎的分裂率无显著差异.[结论]食蟹猴体细胞核能够在猪MⅡ期去核卵母细胞胞质中发生核重塑,并发育到8-细胞阶段.