西伯利亚蓼PsLEA基因的克隆及在NaHCO_3胁迫下的表达

根据西伯利亚蓼叶片cDNA文库中获得的胚胎发育晚期丰富蛋白(late embryogenesis abundant proteins,LEA)基因的部分序列,采用cDNA末端快速扩增(RACE)技术成功克隆了胚胎发育晚期丰富蛋白基因(LEA),命名为PsLEA(GenBank登录号:FJ478172)。该基因全长686bp,5'非翻译区为102bp,3'非翻译区为131bp,开放读码框为453bp,编码150个氨基酸。荧光定量PCR分析表明:正常情况下PsLEA基因在西伯利亚蓼的叶、茎和地下茎中皆有表达,其中茎中表达量最高。3%NaHCO3诱导胁迫下,叶、茎、地下茎中PsLEA表达均受到影响且表达模式存在差异,说明PsLEA基因与西伯利亚蓼的耐盐性相关。     

疣粒野生稻金属硫蛋白(OMMT-2)基因的获得及序列分析

从疣粒野生稻叶片cDNA文库中分离出1个金属硫蛋白基因的cDNA序列,命名为OMMT-2。该基因全长532bp,其中5’非翻译区为111bp,3’非翻译区171bp,开放阅读框长249bp,编码82个氨基酸,该蛋白的分子量为7775.9,理论等电点为6.49;基因编码的氨基酸含有14个半胱氨酸(Cys),占了总氨基酸的17.07%,且集中分布在肽链的N端和C端,呈CXC和CXXC排列方式。疏水性分析表明,该蛋白在43~56个氨基酸之间有较强的疏水区。通过氨基酸序列分析表明,金属硫蛋白中半胱氨酸的位置和数目有较强的保守性,揭示了半胱氨酸对金属硫蛋白的功能十分重要。     

棉花转录因子GhGT30基因的克隆及转录功能分析

Trihelix转录因子广泛参与植物生长发育、非生物胁迫应答等一系列生理活动。本研究根据表达序列标签(EST)电子拼接,结合cDNA末端快速扩增技术(RACE)和RT-PCR技术,从棉花中克隆了一个cDNA全长为2 210 bp的新基因,其开放读码框为2 025 bp,编码一个675氨基酸的蛋白,分子量约76.26 kD,等电点为6.21。SMART蛋白结构预测发现,该基因在N端和C端各有一个trihelix结构域,属于GT-2型trihelix转录因子,被命名为GhGT30 (GenBank登录号为JQ013098)。氨基酸序列比对显示,该蛋白和其他高等植物的GT蛋白有较高的同源性。进化树分析表明,GhGT30基因和大豆GmGT-2B基因处在同一进化树分支。拟南芥原生质体中瞬时表达分析表明,GhGT30主要定位于细胞核中。实时荧光定量PCR分析表明,该基因在棉花的花、纤维(12 DPA)中的表达量明显高于根、茎、叶及胚珠(0 DPA),同时,该基因对干旱、高盐、低温及脱落酸(ABA)等处理都有一定程度的响应,推测该基因对棉花非生物胁迫的调控起重要作用。     

柽柳MnSOD基因的克隆及功能验证

根据已克隆得到的柽柳MnSOD基因片段,采用RACE技术从柽柳中获得MnSOD的cDNA全长序列.该基因全长为1 087 bp.其中,5'非编码区40 bp,3'非编码区333 bp,开放读码框(ORF)长699 bp,编码232个氨基酸.分子量为26 KD,等电点为7.10.该MnSOD氨基酸序列与拟南芥MnSOD序列同源性最高为83%,从12个物种的序列比对可以看出MnSOD氨基酸序列保守性较高.该序列的Genbank注册号为AY573576(基因)和AAS77885(蛋白).将MnSOD基因与酵母表达载体pYES2连接,并进一步转化到酵母基因组中.对重组酵母INVSc1(pYES2-SOD)和对照INVSc1 (pYES2)进行干旱、高温胁迫实验.结果表明:重组酵母的抗干旱、高温能力明显高于对照,证实了来源于柽柳的MnSOD基因具有抗干旱和耐高温能力.     

小麦TaCRF2基因的克隆及其在烟草中的初步功能验证

通过RT-PCR从小麦cDNA中扩增获得一个锌指蛋白基因TaCRF2, 该基因的cDNA长度为847 bp, 序列分析表明它编码一个含有280个氨基酸的蛋白质。在线软件预测该蛋白质的相对分子质量为30.97 kD, 等电点为7.03, 且在C-末端含有一个典型的RING-H2型锌指蛋白结构域, 在N-末端含有两个跨膜结构域。氨基酸序列比对发现, TaCRF2与水稻中的一个RING型锌指蛋白(ABF95226)的相似度为82%。亚细胞定位分析显示, 该蛋白分布在细胞核和细胞膜上。Real-time PCR表达特性分析显示, TaCRF2基因的表达受干旱、盐和ABA的强烈诱导, 低温对该基因的表达量影响不明显。初步功能验证发现过表达TaCRF2基因增强了转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐性。     

牡丹PsDREB转录因子基因的克隆及亚细胞定位

DREB转录因子是一个干旱应答元件的结合蛋白,它在植物对干旱、高盐及低温胁迫的分子反应中起着非常重要的调控作用。本研究以芍药科芍药属牡丹‘洛阳红’品种叶片提取的总DNA为模板,通过PCR扩增获得一个1 661 bp的DREB(dehydration responsive element binding protein)基因的cDNA序列,包含1 089 bp的开放阅读框、448 bp的5'非编码序列和124 bp的3'非编码序列,命名为PsDREB。该基因的cDNA编码363个氨基酸,与葡萄、梧桐、杨树和咖啡的同源性分别为61%、60%、56%和55%。为进一步验证其功能,本研究通过基因枪法对该基因编码的蛋白进行了亚细胞定位检测,结果发现该蛋白定位于细胞核,符合转录因子细胞核定位的特征。研究结果为进一步研究该基因编码蛋白的结构和功能奠定了基础。     

小麦胁迫相关基因TaLEAL3的克隆及分子特性分析

第3组LEA蛋白(late embryogenesis abundant protein)介导干旱、高温、高盐等非生物胁迫响应, 关于普通小麦LEA基因的研究鲜有报道。利用噬菌体原位杂交技术, 从小麦苗期干旱胁迫条件构建的cDNA文库中筛选出LEA蛋白基因TaLEAL3, 其全长750 bp, 编码区长501 bp, 编码166个氨基酸, 含有一个明显的核定位信号区。氨基酸同源性分析发现, TaLEAL3属于第3组LEA蛋白, 序列中含有由11个氨基酸组成的3个不完全重复的基序和α-螺旋的LEA结构。电子定位结果显示, TaLEAL3基因位于4BL、4DL和5AL染色体上, 主要在茎中表达, 而在根中几乎无表达。实时荧光定量PCR分析表明, 在干旱、低温和ABA诱导下, TaLEAL3基因表达量明显增加。在该基因上游1.7 kb序列处, 预测具有启动子的核心序列和增强子序列, 及与干旱和低温等多种逆境胁迫相关的调控序列。本研究为深入分析小麦LEA蛋白基因的功能, 初步解析LEA蛋白的作用机制提供了数据。     

花生果糖-1,6-二磷酸醛缩酶基因AhFBA1的克隆与表达

以花生品种花育33为试材, 根据cDNA文库中已知的果糖-1,6-二磷酸醛缩酶 (fructose-1,6-bisphosphate aldolase, FBA) 基因全长序列设计引物, 通过RT-PCR克隆到该基因, 命名为AhFBA1。AhFBA1全长为1489 bp, 开放阅读框为1200 bp, 编码400个氨基酸。预测该基因编码的蛋白含有Glycolytic保守结构域, 可能定位于叶绿体中。蛋白序列比对和进化树分析表明, 花生与大豆(Glycine max)、苜蓿(Medicago truncatula)、鹰嘴豆(Cicer arietinum)和菜豆(Phaseolus vulgaris)等豆科植物中的FBA序列相似性最高, 亲缘关系最近。荧光定量PCR结果显示, 在高盐和干旱胁迫下, AhFBA1在花生叶和根中的表达均受明显诱导, 说明该基因可能参与花生对高盐和干旱胁迫的适应性调控; AhFBA1在花生根和叶中均受ABA的明显诱导, 说明该基因对花生非生物胁迫的调控可能是依赖ABA的。     

甘蔗ABA信号转导关键酶SoSnRK2.1基因的克隆与表达分析

蔗糖非酵解型蛋白激酶(SnRK)是植物体内ABA信号转导途径的关键调控酶, 在植物的抗逆境生长过程中发挥着重要的作用。本研究通过RT-PCR和RACE-PCR技术克隆出编码甘蔗SnRK2蛋白的基因SoSnRK2.1。该基因cDNA序列全长为1385 bp, 包含一个1002 bp的开放阅读框(ORF)。根据氨基酸序列预测SoSnRK2.1基因编码333个氨基酸残基, 与其他高等植物中相关蛋白的氨基酸具有高度的相似性, 尤其是与禾本科的玉米和水稻。构建该基因的原核表达载体pET-SoSnRK2.1, 在IPTG诱导下可得到38 kD 左右的蛋白, 与理论值一致。实时荧光定量PCR分析表明, SoSnRK2.1基因在ABA、干旱(PEG)+ABA、干旱(PEG)、NaCl、低温(4℃)和H₂O₂外源胁迫下均呈诱导表达的趋势。推测该基因参与调控干旱、高盐和低温等胁迫过程, 在甘蔗抗逆境胁迫中起重要作用。     

紫杆柽柳cDNA文库构建与硫氧还蛋白基因的克隆

以NaHCO3胁迫的紫杆柽柳(Tamarixandrossowii)为材料建立了cDNA文库。经检测,文库的初始滴度为5.7×105pfu,重组率为96%,插入片段的长度在0.3~3.0kb之间,平均长度为1.2kb,扩增后文库的滴度为4.0×109pfu/ml。对文库克隆进行随机测序,获得了紫杆柽柳的硫氧还蛋白(Thioredoxin)基因序列。生物信息学分析表明获得的硫氧还蛋白基因全长683bp,其中5'非翻译区长56bp,3'非翻译区长204bp,开放读码框长423bp,编码140个氨基酸,蛋白的分子量为15.1kD,理论等电点为5.59,其氨基酸序列中具有硫氧还蛋白的保守活性位点“WCGPC”序列,Clustal分析表明该硫氧还蛋白与蓖麻(Ricinuscommunis)的硫氧还蛋白氨基酸序列同源性高,达65%。本研究构建的cDNA文库为柽柳基因克隆和系统研究柽柳抗逆分子机理奠定了基础。     

棉花中一个钝叶醇14α-脱甲基酶基因同源基因（GhCYP51G1）的克隆、序列特征和表达分析

为研究植物固醇在棉花纤维细胞生长发育中的作用和信号传导机制,通过筛选棉花EST数据库并对目标EST序列进行整合和分析,从陆地棉栽培品种徐州142正在发育的纤维中克隆了植物固醇合成途径的重要酶基因——钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因,命名为GhCYP51G1 (GenBank登录号为EU727154)。该基因编码486个氨基酸残基,其分子量和等电点分别为55.2 kD和8.87。推导的氨基酸序列与烟草、马铃薯和葡萄等物种中CYP51家族成员有较高的同源性。而且具有钝叶醇14α-脱甲基酶序列中的典型保守结构域,如多个底物结合位点和血红素结合域。说明该克隆基因是钝叶醇14α-脱甲基酶基因的同源基因。实时定量RT-PCR的结果表明GhCYP51G1基因在快速伸长期的纤维中具有较高的表达水平,而在子叶、雌蕊和雄蕊以及开花后6 d胚珠、开花后0 d和2 d的胚珠纤维中表达水平较低。在开花后8 d的纤维细胞中GhCYP51G1的表达水平最高,这些结果说明该基因在纤维细胞的伸长生长中具有重要作用。同时在纤维生长过程中,由于生长素能够下调GhCYP51G1基因的表达,暗示植物固醇在植物激素,特别是油菜素类固醇物质和生长素的相互作用中具有一定作用。     

绿色棉纤维类黄酮3',5'羟基化酶基因GhF3'5'H的克隆及实时定量表达分析

以发育18 d的天然绿色棉及其近等基因系白色棉纤维细胞为材料,利用cDNA-AFLP结合cDNA末端快速扩增技术,克隆了1个绿色棉纤维优势表达基因的全长cDNA。序列分析结果表明,该cDNA全长1873bp,含有一个编码509个氨基酸残基的开放阅读框。Blast分析表明,该基因的编码产物为一个类黄酮3',5'羟基化酶,将该基因命名为GhF3'5'H,序列提交到GenBank,登录号为GU062184。实时荧光定量PCR检测结果显示:GhF3'5'H在绿色棉不同组织中的表达量均显著高于其近等基因系白色棉,而且主要在纤维细胞中表达。在纤维发育过程中,GhF3'5'H在纤维发育的早期表达量最高,并随纤维发育逐渐降低。推测该基因可能在绿色棉纤维色素前体物质的形成中发挥作用。     

小麦脂质转运蛋白cDNA结构及相应肽链构造特征的分析

根据测序获得的1条261 bp cDNA片段,通过电子延伸、设计引物,从小麦Mardler/7*百农3217(Pm2)的cDNA中扩增获得1条651 bp的cDNA片段,通过同源比对发现其包含小麦LTP1 完整的编码序列.该片段包含基因的5'非翻译区42 bp,3'非翻译区261 bp,开放阅读框348 bp,编码115个氨基酸.预计蛋白的分子量为11.2 kD,等电点为9.46.此基因有8个位置保守的半胱氨酸(C)残基及25个氨基酸的信号肽,为典型的植物脂质转运蛋白基因.其基因序列数据库(GenBank)登录号为AY796184(基因)和AAV65513(蛋白).通过疏/亲水性分析,发现肽链分子具有较大范围的疏水面.     

结球甘蓝花粉类钙调素蛋白基因BoCML49的克隆及表达分析

以结球甘蓝E1为材料,提取花粉萌发前和萌发后的混合花粉总蛋白,总蛋白双向电泳后通过MALDI-TOF-MS鉴定分析差异点,根据差异点分析结果,利用同源克隆得到甘蓝BoCML49基因707 bp的cDNA片段。通过对BoCML49基因的qPCR分析表明其表达量在花粉萌发前约为萌发后的2.73倍,表明BoCML49基因在花粉萌发后表达下调。通过5¢-Race和3¢-Race分别得到550 bp和721 bp大小cDNA片段,最终得到结球甘蓝BoCML49全长cDNA序列,开放阅读框位于125~
1 078 bp处,加尾信号(AATAAA)位于第1 222 bp处。通过cDNA推导得到的氨基酸序列分析表明,BoCML49编码317个氨基酸残基,预测分子量为33.51 kD,pI为6.93,经Smart-embl预测其含2个重要的EF-hand结构,分别位于序列第150~178和第216~244位氨基酸残基处,预测结果显示其含有7个α-螺旋和10个β-折叠结构。系统发育树表明结球甘蓝BoCML49与拟南芥AtCML49和AtCML50的亲缘关系较近。BoCML49基因的原核表达得到37.55 kD的融合蛋白。     

棉花腺苷高半胱氨酸水解酶cDNA的克隆、表达及染色体定位

腺苷高半胱氨酸水解酶是调节细胞内甲基反应的一个关键酶。通过对高品质纤维陆地棉品系7235的棉纤维混合cDNA文库随机测序, 得到一个棉花腺苷高半胱氨酸水解酶(编号: g073a03a,GhSAHH)的cDNA序列。该cDNA序列长1 598 bp, 利用5′RACE技术得到上游318 bp的片段,序列拼接获得全长为1 916 bp的cDNA序列, ORF为1 458 bp, 编码485个氨基酸, 其理论上的等电点pI＝5.69, 分子量MW＝53.2 kD。该基因在不同组织、器官中均表达, 在根、下胚轴和纤维发育早期优势表达。根据Southern杂交结果推测GhSAHH基因在陆地棉基因组中为单拷贝。利用本实验室陆地棉遗传标准系TM-1和海岛棉海7124培育的含140个单株的BC1作图群体, 将GhSAHH基因定位在第20号染色体上。     

棉花TCP家族转录因子基因GhTCP1的克隆与表达分析

通过比对拟南芥、金鱼草、水稻和玉米等植物中已知TCP家族转录因子的氨基酸序列,根据保守区设计兼并引物,以陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种新陆早13号的DNA为模板,获得棉花转录因子基因GhTCP1的中间保守区序列。根据该段序列设计特异性引物,采用5'和3'RACE技术获得了全长cDNA序列,编码397个氨基酸。基因组DNA序列分析表明,GhTCP1基因含有一个内含子。棉花GhTCP1蛋白与其它植物中的TCP家族转录因子有较高的相似性,证明该基因在进化过程中是相当保守的。半定量RT-PCR表达分析结果显示,该基因在棉花的侧芽中特异表达。     

牡丹类psDHN-YSK2基因全长cDNA的克隆与表达分析

为了获得牡丹类脱水素基因的全长cDNA序列,推测其在休眠解除进程中的生物学功能,以不同低温处理时间的牡丹花芽为供试材料,末端快速扩增方法克隆全长cDNA序列,实时定量PCR分析其表达模式。结果表明牡丹类脱水素基因全长cDNA序列为1187 bp,包括831 bp的开放阅读框,114 bp的5’非编码区和242 bp的3’非编码区。其编码的蛋白具有两个植物脱水素蛋白特征性K片段,根据Close的分类方法,属于YSK2类脱水素蛋白。系统发生分析表明psDHN-YSK2基因与葡萄亲缘关系最近。在花芽内休眠解除前期随着低温处理时间的延长psDHN-YSK2表达呈上调趋势。本研究克隆了牡丹psDHN-YSK2的全长cDNA序列,分析了其在花芽内休眠解除过程的表达趋势,暗示了其参与了牡丹花芽的内休眠过程。     

棉花转录因子GhWRKY4基因的克隆及特征分析

 本研究从陆地棉中克隆得到GhWRKY4基因,全长cDNA是1281 bp,包含1083 bp的开放阅读框,编码的360个氨基酸属于IIcWRKY转录因子家族。分析GhWRKY4基因结构表明其有三个外显子和两个内含子。GhWRKY4蛋白的亚细胞定位实验表明其定位在洋葱表皮细胞核。实时荧光定量分析结果显示GhWRKY4在棉花的根、茎、叶和花中均有表达。染色体步移得到了GhWRKY4的5’端侧翼序列,生物信息学软件预测表明GhWRKY4包含一系列和胁迫基因调控相关的反式作用元件,表明GhWRKY4参与植物对盐害和冷害胁迫的反应。     

棉花纤维特异表达基因GhF1的分离及鉴定

采用mRNA荧光差异显示结合cDNA末端快速扩增技术,克隆了一个棉纤维特异表达基因的全长cDNA,命名为GhF1,该cDNA全长622 bp,含有一个编码66个氨基酸蛋白的开放阅读框。Southern杂交分析表明该基因在陆地棉(Gossypium hirsutumL.)中含有两个拷贝。Northern杂交分析表明该基因在棉花纤维细胞特异表达,在纤维发育过程中,GhF1转录产物的累积主要发生在纤维细胞发育的早期阶段。尽管未发现该基因与已知基因有任何同源性,但其分布的组织特异性和表达的发育阶段性暗示该基因在纤维伸长中起作用。