马疱疹病毒1型gB糖蛋白线性B细胞表位的预测与鉴定

试验旨在应用生物信息学技术综合分析马疱疹病毒1型（equine herpesvirus 1,EHV-1） gB糖蛋白,预测B细胞表位,筛选出具有潜在诊断价值的线性B细胞表位。将EHV-1 gB糖蛋白的基因序列输入DNAStar软件中的Protean工作区中,经参数综合比较分析筛选潜在的B细胞表位,克隆、表达预测表位的基因片段,利用表达的融合蛋白作为抗原与马疱疹病毒阳性血清反应。经预测分析,gB糖蛋白的B细胞表位可能位于第6-10、23-32、53-65、72-98、111-120、152-166和173-180位氨基酸区域。本试验成功构建并原核表达含7个潜在B细胞表位的融合蛋白。Western blotting试验结果显示,其中5个融合蛋白能被马疱疹病毒阳性血清识别。本试验利用生物信息学技术结合分子生物学技术成功筛选到5个潜在的B细胞表位,为EHV-1表位诊断、表位疫苗抗原的设计奠定了技术基础。     

两株狂犬病病毒强毒株糖蛋白基因的克隆及潜在抗原表位分析

通过RT-PCR分别获得了狂犬病病毒强毒CVS株、DRV82株糖蛋白基因,进行克隆及测序,并推导出氨基酸序列,与犬用疫苗弱毒株ERA、SRV9、犬源性街毒株CGX及人用疫苗株PG的糖蛋白序列进行比较。结果表明,以上狂犬病病毒毒株间的核苷酸同源性为83.1%～99.2%,氨基酸序列同源性为87.0%～98.5%。经Jameson-Wolf抗原表位优势图分析,CVS株与其他各株相比发现在304位、372位抗原表位优势升高;而DRV82株与其它各株差异不明显。抗原优势变化可能导致狂犬病病毒糖蛋白出现新的潜在抗原位点,为下一步构建不同毒株的狂犬病病毒糖蛋白重组疫苗奠定了基础。     

牛传染性鼻气管炎病毒gD蛋白表位鉴定

为鉴定牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)g D蛋白抗原表位,本研究利用p ET-30a原核表达系统表达、纯化了重组g D蛋白,采用超速离心纯化的IBRV免疫BALB/c小鼠,取脾淋巴细胞与SP2/0细胞进行融合,以重组g D蛋白作为包被抗原,通过间接ELISA筛选出一株稳定分泌抗g D蛋白的MAb杂交瘤细胞株(1G3)。间接免疫荧光结果表明:MAb与IBRV呈阳性反应,中和试验测定其腹水中和效价为1∶32。利用肽扫描技术原核表达GST融合短肽对MAb 1G3识别的抗原表位进行筛选鉴定,结果表明:该MAb识别的抗原表位为259EESKGYE265。蛋白序列分析表明该抗原表位在IBRV各分离株及牛疱疹病毒5型(Bo HV-5)中均保守。本研究为IBRV的糖蛋白g D的结构和免疫学特性及IBRV致病性的深入研究奠定了基础。     

旋毛虫p53糖蛋白抗原研究进展

旋毛虫p53糖蛋白是旋毛虫肌幼虫排泄分泌抗原的主要抗原组分之一,具有肌幼虫期特异表达特性,主要定位在肌幼虫β-杆细胞.不同旋毛虫种p53糖蛋白氨基酸序列相对保守,但抗原性有差异,在同一种内变异极少,具有种及属特异性抗原表位.论文就旋毛虫p53糖蛋白抗原的分子结构、不同发育时期的特异性表达、抗原性等方面的研究进展进行综述...     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39特异性单克隆抗体的制备

为了制备乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位特异性单克隆抗体,将编码乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39的DNA序列进行人工合成,随后插入表达载体pGEX-6p-1的限制性酶切位点BamHⅠ与XhoⅠ之间,构建了表位肽与GST的融合表达质粒。该表住融合蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB／c小鼠,按常规方法进行细胞融合。以化学合成的E39表位多肽为抗原,对融合细胞上清进行间接ELISA筛选。结果,筛选出1株分泌E39表位特异性抗体的杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞分泌抗体能力稳定。经鉴定,该单克隆抗体亚型为IgG2b,轻链类型为κ链。结果表明,用表位融合蛋白为抗原可以制备表位特异性单克隆抗体。     

1株非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体识别的B细胞抗原表位的鉴定

旨在研究非洲猪瘟病毒(ASFV) p30蛋白的B细胞抗原表位,本研究制备了p30蛋白的单克隆抗体(mAb),并以该单克隆抗体为工具进行B细胞抗原表位定位。首先,通过原核表达及Ni柱亲和纯化获得p30蛋白,将纯化蛋白免疫BALB/c小鼠进行杂交瘤细胞制备,通过间接酶联免疫吸附试验(iELISA)筛选出阳性杂交瘤细胞,并以细胞表达的方法制备单克隆抗体;采用间接免疫荧光试验(IFA)和蛋白质免疫印迹(Western blot)对单克隆抗体的特异性进行鉴定。利用IEDB表位预测软件对p30蛋白B细胞抗原表位进行预测,根据预测结果对CP204L基因进行截短表达,利用IFA、Western blot和iELISA对其抗原表位进行鉴定。最后,利用噬菌体十二肽库对制备的p30单克隆抗体进行4轮生物淘选,筛选多肽表位,并与上述基因截短表达筛选方法进行比对。特异性鉴定结果显示,该单克隆抗体能成功识别感染猪肺泡巨噬细胞的ASFV;基因截短表达筛选结果表明,其识别的抗原表位区域为⁸⁴M～K¹⁴²;噬菌体淘选试验结果表明,¹¹⁶TSSFETLFE¹²⁴为本试验制备的单克隆抗体所识别的p30蛋白抗原表位核心序列,该结果进一步缩小了表位分布范围。本研究制备了p30蛋白的1株单克隆抗体,并对其抗原表位进行鉴定,为血清学诊断试剂的研发和p30蛋白功能研究奠定基础。     

病毒多表位疫苗研究进展

病毒多表位疫苗是利用免疫学和基因工程技术筛选出病毒的抗原表位,同时结合计算机技术对表位进行优化,将同一病毒的不同细胞表位或者不同亚型病毒的细胞表位串联表达而制成的新型疫苗。由于病毒多表位疫苗在安全性、稳定性以及免疫效力等诸多方面的优势,已成为当前病毒疫苗研究的热点。本文从病毒抗原表位的确定方法、不同表位疫苗以及病毒多表位疫苗的免疫途径和安全性等几方面对病毒多表位疫苗作一综述。     

狐源犬瘟热病毒F蛋白B细胞抗原表位基因的克隆表达

为了研究犬瘟热病毒的抗原表位区段,试验以犬瘟热病毒基因组序列为材料,根据预测的F蛋白N端含有抗原指数较高的区域,选择可能含有潜在的B淋巴细胞优势抗原表位的片段,将其连接到原核表达载体pGEX-6p-1上进行B淋巴细胞抗原表位基因的克隆表达。结果表明:该区段能够在原核载体上高效表达。     

鸭坦布苏病毒E基因主要抗原域的原核表达及单克隆抗体的制备

为制备鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因主要抗原域的单克隆抗体(MAb),本研究经DNAStar软件分析预测E蛋白含有的优势抗原表位区,以DTMUV QD株基因组RNA为模板,通过RT-PCR扩增涵盖编码主要优势表位的E基因片段(943 bp~1 287 bp),并将其克隆至表达载体p ET-28a中,转化于大肠杆菌中进行诱导表达。对表达的重组蛋白进行western blot鉴定,将纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,取其脾脏细胞与SP2/0细胞融合,经筛选和鉴定,获得了两株能够稳定分泌抗E蛋白的杂交瘤细胞株,命名为4G8和6B12,其亚型均为Ig G1型,并且识别于不同的抗原位点。经间接免疫荧光检测,MAb 4G8和6B12均能够与DTMUV发生特异性反应。本研究所制备的MAb为进一步鉴定DTMUV以及分析囊膜糖蛋白E的结构和功能奠定了基础。     

犬吉氏巴贝斯虫BgTRAP的原核表达及抗原表位分析

为表达犬吉氏巴贝斯虫Bg TRAP蛋白及鉴定其抗原表位,本研究将犬吉氏巴贝斯虫Bg TRAP编码基因的密码子进行优化和高效表达,并利用生物学软件分析预测,结果显示,Bg TRAP中存在10个潜在的线性抗原表位,通过原核表达系统对其预测表位的多肽进行表达,以筛选的阳性血清样品为检测抗体进行ELISA检测,结果表明其中3个多肽能够与抗体特异性结合,其多肽序列分别为126DYVIAVEDTTHFGE139、672AYILAGFA GLLLIT685和497SDELGDEMGLTTNE510。本研究对Bg TRAP蛋白抗原表位的鉴定,为进一步开发基于Bg TRAP的犬吉氏巴贝斯虫诊断抗原及Bg TRAP的免疫学特性研究奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒VP73蛋白主要抗原表位区的原核表达及多克隆抗体的制备

构建重组原核表达载体pET32a-VP73,将pET32a-VP73转化BL21感受态细胞,经IPTG诱导,VP73蛋白主要抗原表位区可稳定高效的表达,SDS-PAGE结果表明,IPTG终浓度为1.0 mmol/L,诱导5 h蛋白质表达量最高,表达蛋白为融合蛋白,分子质量约为42 ku。蛋白质纯化后,经SDS-PAGE及Western blotting鉴定,确定表达产物为非洲猪瘟病毒VP73主要抗原表位区融合蛋白。将纯化的蛋白质免疫新西兰大白兔,免疫前后收集血清。用间接ELISA方法测定血清抗体效价,并以非洲猪瘟阳性血清、兔免疫前后血清及猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征、猪伪狂犬病阳性血清为一抗,确定该蛋白质的特异性。结果表明,制备的抗血清效价达到1∶1024000,能与纯化的VP73主要抗原表位区蛋白质发生反应。制备的多克隆抗体为VP73蛋白的免疫学研究和非洲猪瘟血清学诊断奠定了基础。     

基于免疫信息学方法设计针对猪急性腹泻综合征冠状病毒S、M及E蛋白的多表位疫苗

【目的】 设计针对猪急性腹泻综合征冠状病毒（Swine acute diarrhea syndrome coronavirus，SADS-CoV） S、M及E蛋白的多表位疫苗。【方法】 本研究选用IEDB预测SADS-CoV S、M及E蛋白T淋巴细胞主要组织相容性复合体Ⅰ（MHCⅠ）类分子结合表位；用NetMHCIIpan 4.0 Serve预测T淋巴细胞MHCⅡ类分子结合表位；用Immunomedicine Group、IEDB预测B淋巴细胞表位。将各个服务器预测结果筛选出重叠表位区域作为优势表位，运用IEDB、AllerTOP v 2.0 Servers筛选出高保守性、非致敏性的优势表位区域，通过柔性linker串联成多表位疫苗。对构建的多表位疫苗进行抗原性、理化性质、N-糖基化位点、二级结构和三级结构预测。使用分子对接评估多表位疫苗与免疫受体的结合能力，最后进行基因克隆。【结果】 经筛选后的高保守性、非致敏性优势表位构建的多表位疫苗相对分子质量为35.30 ku，为稳定亲水蛋白，具有良好的抗原性，存在1个N-糖基化位点，在二级结构中α-螺旋、β-折叠、无规则卷曲和β-转角分别占22.11%、20.35%、50.88%和6.67%。三级结构Ramachandran作图显示优势区域中含有残基数占到90.00%，进行细化后优势区域的残基数增加到91.92%，三级结构突出表位作图也证明多表位疫苗具有良好的免疫原性，分子对接表明多表位疫苗与TLR3具有高亲和力。经密码子优化、反向翻译和基因克隆确保设计的多表位疫苗在大肠杆菌K12表达系统中高效、稳定的表达。【结论】 构建的多表位疫苗抗原可有效表达并可能诱导强烈的T细胞和B细胞免疫应答。本研究为SADS-CoV多表位疫苗的设计提供了一种新的方法，为SADS-CoV多表位疫苗的研发提供了理论依据及数据支持。     

H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白线性表位的预测与鉴定

应用生物信息学方法预测H6亚型禽流感病毒血凝素蛋白(HA)线性抗原表位,并对所获表位的免疫原性进行初步鉴定,为流感病毒表位疫苗研制和H6亚型特异性ELISA检测方法奠定基础。依据近年流感病毒流行趋势,从GenBank下载具有代表性的H6、H5、H7和H9亚型禽流感病毒血凝素蛋白的氨基酸序列。利用DNA Star软件进行H6同亚型间氨基酸序列保守性分析,再将H6与H5、H7、H9不同亚型之间氨基酸同源性进行比较,然后借助在线服务器ExPASy和IEDB对序列进行抗原性、亲水性、柔韧性、二级结构和表面可及性预测。最后去除H6与H5、H7、H9亚型氨基酸同源区域,选择H6亚型氨基酸相对保守区域并且抗原表位综合预测结果较优的几个片段,所选择表位长度为15个氨基酸。合成所获得的优势线性表位,并用间接ELISA方法对所获表位的免疫原性进行鉴定。预测后获得4个线性抗原表位,经鉴定免疫原性最好的为表位A,最差的为表位B。     

Identification and expression of a gene encoding an epitope that induces hemagglutination inhibition antibody to Avibacterium paragallinarum serovar A

The aims of this study were the identification, cloning, and expression of a genetic region encoding an epitope that induces hemagglutination inhibition (HI) antibody against Avibacterium paragallinarum serovar A and an evaluation of the recombinant protein for immunogenicity in chickens. Although two monoclonal antibodies (MAbs) with HI activity, designated S24-951 and S7-1716-5C, were generated in this study, no reactive proteins with both MAbs were identified by Western blot analysis. A gene fragment of 5157 bp, designated hpa5. 1, was cloned from genomic DNA, and a recombinant protein expressed by hpa5.1, designated HPA5.1, reacted with both MAbs on dot-blot analysis. HPA5.1 showed no hemagglutinating activity, but significantly absorbed HI antibodies in the chicken immune serum. Analysis using a series of deletion mutants prepared from hpa5.1 indicated that a 4.8 kbp gene in hpa5.1 is essential for the expression epitope recognized by MAb S24-951. In addition, chickens immunized once with HPA5.1 showed a high protection rate with sufficient HI antibody titers against challenge exposure with a virulent strain of A. paragallinarum serovar A strain 221. These results show that hpa5. I1 is responsible for the expression of an epitope that induces HI antibody, and HPA5.1 might be a candidate for the development of a new vaccine against avian infectious coryza caused by A. paragallinarum serovar A.     

羊口疮病毒B2L蛋白抗原表位预测及重组蛋白设计与验证

为得到羊口疮病毒（ORFV）B2L蛋白的可能抗原表位及截短后高效表达的表位蛋白，本试验采用DNAStar、Mega 7.0等软件对部分NCBI已登录的B2L基因序列进行分析，并应用不同在线服务器对其编码蛋白的信号肽、跨膜区、细胞毒性T细胞表位、辅助性T细胞表位、B细胞表位和二级结构进行预测，同时参考多模板进行三级结构预测，综合抗原表位、亲水性、表面可及性和抗原指数等主要预测数据进行抗原位点分析及融合His·tag抗原表位蛋白的设计，构建并原核表达截短后高效表达的表位蛋白。结果显示，得到了几个可能的优质抗原表位，分别为88-93、133-138、172-175、251-254、311-313和370-377位氨基酸；纯化并复性的蛋白以多聚体形式存在；Western blotting结果显示，其具有良好的反应原性。该研究确定了ORFV B2L蛋白抗原位点，构建并原核表达了截短后高效表达的表位蛋白，为羊口疮诊断制剂及亚单位疫苗的研究奠定了基础。     

Identification of T-helper and linear B epitope in the hypervariable region of nucleocapsid protein of PPRV and its use in the development of specific antibodies to detect viral antigen

Peste des petits ruminants is a highly contagious viral disease of small ruminants making its diagnosis difficult from the similar symptoms of Rinderpest. Computer based prediction algorithms was applied to identify antigenic determinants on the nucleocapsid (N) protein of PPRV. Specificity and antigenicity of each peptide was evaluated by solid phase ELISA. Six specific peptide sequences were evaluated in multiple antigenic peptide (MAP) form and immune response was evaluated by supplementing universal T-helper epitope human IL-1beta peptide (VQGEESNDK, amino acids 163-171). Out of the six peptides 19mer sequence corresponding to 454-472 region of N protein of PPRV was found to be highly immunogenic and specific to PPRV. Evaluation of overlapping peptides differing in length for this 452-472 region, showed minimum length of 14 amino acid residues were required for the stable affinity binding of antigen-antibody. The results of immunization and indirect ELISA indicated the presence of T-helper epitope at the N-terminal end and linear B epitope at the C-terminal region of 454-472 19mer of nucleocapsid peptide of PPRV-nucleocapsid protein. The antipeptide antibodies developed against this region showed specificity to PPRV antigen differentiating it from RPV when used in indirect ELISA and western blot analysis.     

携带猪流行性腹泻病毒S1抗原表位的乙肝核心抗原病毒样颗粒的构建与鉴定

旨在构建以乙肝核心抗原（HBcAg）为载体呈现猪流行性腹泻病毒（PEDV）S1抗原表位的病毒样颗粒。将PEDV S1蛋白中含B细胞表位的270 bp片段插入到HBcAg主要免疫显性区域（MIR）,构建重组质粒pET-32a（+）-HBcAg-PEDV S1,转化到感受态细胞BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE鉴定纯化后的重组蛋白,通过透射电镜观察其形态结构。结果显示,成功构建重组质粒pET-32a（+）-HBcAg-PEDV S1,并在BL21（DE3）中以包涵体形式表达,纯化、复性后的重组蛋白经过2%磷钨酸负染后透射电子显微镜检测到病毒样颗粒结构。HBcAg-PEDV S1重组蛋白能够自发形成病毒样颗粒,在原核表达中,乙肝核心抗原可作为载体呈现PEDV S1抗原表位,为今后新型PED疫苗的研究提供了思路。     

Mapping neutralizing and non-neutralizing epitopes on the capsid protein of feline calicivirus

Neutralizing epitopes on feline calicivirus (FCV) capsid protein were mapped using chimeric capsid proteins recombinant between two FCV isolates that do not show any cross-neutralization. The three chimeric proteins examined were expressed in murine L929 cells employing an MVA/T7 vaccinia virus expression system and inoculated into major histocompatibility complex haplotype-matched C3/HN mice. Based on the neutralizing antibody titre the neutralizing epitope(s) could be mapped to the 5' hypervariable region of the E region or potentially to the C region. The epitopes of some non-neutralizing antibodies were mapped with the same chimeric proteins to the regions B or D and F of the FCV capsid protein.     

Successful suppression of endogenous α-1,3-galactosyltransferase expression by RNA interference in pig embryos generated in vitro

RNA interference (RNAi) technology using small interfering RNAs (siRNA) has been widely used as a powerful tool to knock down gene expression in various organisms. In pig preimplantation embryos, no attempt to suppress the target gene expression with such technology has been made. The purpose of this study is to demonstrate that the RNAi technology is useful for suppression of endogenous target gene expression at an early stage of development in pigs. Alpha-1,3-Galactosyltransferase (α-GalT) is an enzyme that creates the Galα1-3Gal (α-Gal) epitope on the cell surface in some mammalian species, and removal of the epitope is considered to be a prerequisite for pig-to-human xenotransplantation. We decided to suppress the endogenous α-GalT mRNA expression in pig early embryos, since reduction of α-GalT synthesis is easily monitored by cytochemical staining with Bandeiraea simplicifolia isolectin-B(4), a lectin that specifically binds to the α-Gal epitope, and by RT-PCR analysis. Cytoplasmic microinjection of double-stranded RNA and pronuclear injection of an siRNA expression vector into the embryos generated in vitro resulted in a significant reduction in expression of the α-GalT gene and α-Gal epitope in blastocysts, at which stage the α-Gal epitope is abundantly expressed. Somatic cell nuclear transfer of embryonic fibroblasts stably transfected with an siRNA expression vector also led to a significant reduction in the level of α-GalT mRNA synthesis together with decreased amounts of the α-Gal epitope at the blastocyst stage. These results indicate that the RNAi technology is useful for efficient suppression of a target gene expression during embryogenesis in pigs and suggest the possibility of production of siRNA-expressing pigs for use in xenotransplantation.