冷休克法和静水压法人工诱导大黄鱼三倍体

同时采用冷休克法和静水压法进行大黄鱼（Pseudosciaena crocea Richardson）倍体诱导条件研究，同时比较适合条件下两种方法诱导效果差异以及大批量诱导组不同生长阶段三倍体榆出率的差别。结果表明：（1）冷休克法和静水压法都可成功诱导出大黄鱼二倍体。冷休克法适宜诱导条件为20℃培育水温下授精后3min，在3～4℃海水中处理8～10min；静水压法适宜诱导条件为同样培育水温下授精后3min，在静水压450kg／cm^2下处理3min。三倍体诱导率受处理时刻、处理时间和处理温度（或压力）3因素的影响。（2）综合三倍体诱导率、处理后受精卵原肠期存活率和仔鱼孵化率，静水压法诱导效果要明显优于冷休克法。（3）采用冷休克法进行大黄鱼三倍体大批量诱导，早期胚胎、初孵仔鱼和4月龄幼鱼三倍体检出率分别为34．03％、29．54％和14.81％。表明随生长发育诱导组三倍体检出率有下降趋势。     

3种染色体组加倍方法诱导黄河鲇雌核发育的比较

用经紫外线照射后遗传失活的黄河鲇精子、刺激性成熟的黄河鲇卵子,进行雌核发育,采用冷休克、热休克和秋水仙素浸泡等3种染色体组加倍方法诱导黄河鲇卵进行二倍体雌核发育.实验结果表明:在人工诱导黄河鲇二倍体雌核发育过程中,以冷休克处理组的效果最好,胚胎孵化率达到8.1%;其次为秋水仙素处理组,胚胎孵化率达到6.3%;热休克处理组诱导效果较差,胚胎孵化率仅为4.0%.     

3种染色体组加倍方法诱导黄河鲇雌核发育的比较

用经紫外线照射后遗传失活的黄河鲇精子、刺激性成熟的黄河鲇卵子, 进行雌核发育, 采用冷休克、热休克和秋水仙素浸泡等3种染色体组加倍方法诱导黄河鲇卵进行二倍体雌核发育。实验结果表明: 在人工诱导黄河鲇二倍体雌核发育过程中, 以冷休克处理组的效果最好, 胚胎孵化率达到8. 1%; 其次为秋水仙素处理组, 胚胎孵化率达到6. 3%; 热休克处理组诱导效果较差, 胚胎孵化率仅为4. 0%。     

三倍体草鱼的生产

精卵混合加水后，不同时间间隔对卵施行不同持续时间的冷休克或热休克生产三倍体草鱼(Chneopharyngodon．idella)，生产的三倍体草鱼达87％，精卵混合一分钟后的草鱼卵立刻暴露手高出周围温度(26℃)12℃的水温中持续3．5分钟处理效果最佳,将幼鱼按规格分级，用科尔特计数器和波道仪分析50-100尾／组鱼的血样，测定其倍性，剔除三倍体百分率低的不同规格的鱼组，使三倍体达到95%的群体重新放回池塘进一步生长，最后选择100％的三倍体草鱼，总体长在150-250毫米的鱼逐尾进行分析。     

草鱼出血病基因疫苗的免疫效果

为探讨含有草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白VP6基因的重组基因疫苗对草鱼出血病的免疫效果,将重组基因疫苗分别配制为10、30和60μg三个梯度,同时设30μg pFastBacTMDual空载体组,均以等体积的氢氧化铝佐剂为免疫增强剂,对草鱼进行注射,以未经处理的草鱼作为对照组。定期采血测定抗体效价,最后对各组草鱼进行攻毒试验并计算死亡率和免疫保护力。结果显示：注射疫苗的三组草鱼均产生抗体,10μg组效价为1：6～1：11;30μg组为1：9-1：13;60μg组为1：11-1：17,且各组效价均在第28天测定最高,免疫保护率依次为100％、100％和95％,而空载体组和对照组为70％和0％。研究表明,疫苗能够诱导草鱼产生免疫反应,为草鱼出血病核酸疫苗的生产应用和产业化提供了重要的理论依据。     

干扰素防治草鱼出血病的效果初探

对人工的鲫鱼干扰素防治草鱼出血病的效果进行了初步探讨。结果表明，人工诱导的鲫鱼干扰素确能有效防治草鱼出血病，腹腔注射和药浴浸泡两种匀有一定效果。在病毒感染前使用干扰素处理的效果好于在病毒感染后使用干扰素处理。多次使用干扰素处理的效果好于一次性处理。     

热休克法诱导日本沼虾四倍体的初步研究

以热休克抑制受精卵第一次卵裂，进行日本沼虾四倍体诱导实验，热休克温度在３８、３９、４０和４１℃，于产卵２１０￣２３０分钟后，处理１￣２分钟均可获得四倍体胚胎，４０℃处理１．５分钟，四倍体胚胎诱导率达３６．８％，３８和３９℃处理２分钟后所获得的嵌合体胚胎比率大于四倍胚胎比率，而热休克温度４０℃时，四倍体率显著高于合体比率，４１℃处理时由于有丝分裂异常导致胚胎死亡率高，更适宜的处理时间有待进一步研究，     

诱导虹鳟鱼四倍体的初步研究

利用静水压法和热休克法对虹鳟鱼(Oncorhynchus mykiss)受精卵进行处理,诱导四倍体.对发育至原肠后期的胚胎进行染色体制备并计数,结果显示热休克处理组的四倍体诱导率为5.5%,静水压处理组的诱导率为22.8%,静水压的诱导效果明显优于热休克.最佳的开始处理时间为受精后340min,静水压力为650 kg/cm2,处理持续时间为5min.     

热休克诱导黄颡鱼三倍体的研究

以正交试验设计,采用热休克法研究了诱导三倍体黄颡鱼的适宜条件.试验结果表明,在卵受精后2 min,40 ℃持续处理2 min,三倍化率可达57.5%,原肠期相对存活率43.0%,孵化期相对存活率38.5%.分析了热休克处理的参数与三倍体出现率和胚胎相对存活率的关系,诱导参数中处理温度和诱导时机为重要因素,其次为持续时间.     

草鱼肝细胞脂变模型的建立及脂代谢基因表达分析

为了筛选草鱼肝细胞脂肪变性的最佳诱导剂及浓度,并初步分析脂肪乳剂(lipid emulsions,LE)引起草鱼肝细胞脂肪变性的作用机理,以草鱼(Ctenopharyngodon idellus)正常肝细胞为研究对象,建立草鱼脂肪变性肝细胞模型,以含10%胎牛血清的基础培养液为对照组,处理组为含20%脂肪乳剂0.5~2 m L/L和含20%、50%胎牛血清的诱导培养液,孵育草鱼肝细胞48 h后,定量分析肝细胞内的甘油三酯(TG)含量,观察脂滴积聚情况及肝细胞超微结构的变化,检测细胞培养上清中谷丙转氨酶(alanine transaminase,ALT)、谷草转氨酶(aspartate transaminase,AST)的活性,q RT-PCR技术检测脂代谢关键基因(PPAR?、PPAR?、SREBP-1c、LPL、Lep和UCP2)的转录水平变化,蛋白质印迹技术检测PPAR?、SREBP-1c的蛋白水平变化。结果发现,含1~2 m L/L LE的诱导液组和含20%、50%FBS的诱导液组与对照组相比TG含量均显著上升(P0.05),且20%FBS和各浓度LE诱导组的转氨酶活性与对照组相比差异不显著(P0.05),表明含1~2 m L/L LE的诱导液和含20%FBS的诱导液均可建立草鱼营养性脂肪肝细胞模型。在肝细胞脂变模型中,PPARγ和LPL等脂代谢基因的表达量显著升高(P0.05),而Lep基因表达量显著降低(P0.05),PPARγ和SREBP-1c的蛋白水平升高。结论认为:采用1~2 m L/L LE和20%的FBS均可以在短时间内建立草鱼肝细胞脂肪变性模型,含1 m L/L LE的诱导液诱导效果最佳;肝细胞内脂质的蓄积可能与脂肪代谢关键基因PPARγ、SREBP-1c、LPL及Lep等密切相关。     

热休克诱导全雌虹鳟三倍体

以虹鳟二倍体的伪雄鱼为父本（遗传型为xx），探讨了采用热休克方法阻止第二极体排放诱导全雌虹鳟三倍体的适宜条件。结果表明：虹鳟三倍体诱导率明显受处理温度、起始时间以及持续时间等因子的影响。在孵化水温为6．5℃，卵子受精后20min经26℃热处理20min，孵化率为64．62％，三倍体诱导率为86．67％；卵子受精后lOmin经26℃热处理20min，三倍体诱导率为100％，但孵化率仅为3．87％。受精卵经26℃处理的诱导效果好于24℃和28℃的（P〈0．01）。     

静水压休克法诱导三倍体鲶鱼（silurus asotus L）的研究

采用静水压休克法诱导三倍体鲶鱼。通过对受精时间、静水压力及持续施压处理时间三方面进行筛选试验的结果表明，鲶鱼卵受精4－5min，用600－649kg/cm^2的静水压力处理3min，可以获得100％的三倍体鲶鱼，而且胚胎存活率也较高，孵化率达对照组的90％以上，是静水压休克法诱导三倍体鲶鱼的最佳条件。三倍体鲶鱼的倍性用细胞遗传学方法验证。     

冷休克诱导大鳞副泥鳅雄核发育单倍体

为探索诱导鱼类雄核发育单倍体的新方法及形成机制,以大鳞副泥鳅为研究对象,无须卵子失活,仅用冷休克诱导雄核发育单倍体,并对其后代的早期胚胎发育、染色体数目、分裂胚细胞学观察等进行了系统分析。早期胚胎发育结果显示,0℃与3℃处理组的孵化率分别为0.83%和57.42%,二者之间孵化率差异显著(P0.05),0℃和3℃处理组均表现出单倍体综合征。染色体倍性鉴定结果显示,0℃处理组染色体分布为18~27,单倍体率为81.40%,3℃处理组染色体分布为20~30,单倍体率为68.97%。分裂胚细胞学观察结果显示,3℃处理组受精后60 min,卵核和第二极体位于胚表面,有一同释放迹象。结果表明,对大鳞副泥鳅受精卵进行3℃冷休克处理60 min,可以成功诱导雄核发育单倍体,研究推测冷休克诱导大鳞副泥鳅雄核发育的细胞学机制是雌核和第二极体一同释放。     

冷、热休克法诱导黄颡鱼三倍体的比较研究

分别采用冷、热休克抑制第二极体释放的方法诱导黄颡鱼三倍体。结果表明,在卵受精后2min,5℃处理20min,胚胎时期的三倍体率达70%左右,孵化率50%左右,幼鱼时期三倍体(含嵌合体)的检出率为25%,此条件为冷休克处理的优化参数;在卵受精后2min,40℃处理2min,胚胎时期的三倍体诱导率达58%,孵化率为39%,幼鱼时期三倍体(含嵌合体)的检出率为40%,此条件为热休克处理的优化参数。正交分析得出,冷休克条件下起始休克时间是原肠期三倍化率和孵化率的重要影响因子,温度对畸形个体的产生有重要影响;热休克条件下,参考三倍体率、畸形率、孵化期相对存活率三者而言,休克温度均是重要因素。比较观察到冷休克处理组的胚胎受损情况严重,后期的成活率较热休克处理组要低,总体诱导效果逊于热休克处理组。     

17α-甲基睾酮对草鱼性腺发育及性类固醇激素水平的影响

利用养殖草鱼雌性个体所表现出的生长优势,探讨通过性逆转培育全雌草鱼品种的方法,具有较好的应用前景。实验采用拌料投喂诱导方式,在饲料中设置0、50、100和200 mg/kg 4个浓度梯度的17α-甲基睾酮(MT),连续投喂150 d,观测不同处理水平草鱼性腺结构和血液中类固醇激素雌二醇(E2)、睾酮(T)和11-酮基睾酮(11-KT)含量的变化规律,探讨草鱼性逆转过程中的特征变化。性腺的组织切片结果显示,从投喂30 d开始,各处理组卵巢中开始出现精原细胞。30～150 d,50 mg/kg MT处理组草鱼卵母细胞的生成及成熟受到抑制,发育迟缓;100 mg/kg MT处理组的生殖细胞受抑制程度要高于50 mg/kg MT处理组,实验结束时性腺已被大量精原细胞占据,有向精巢发育的趋势;200 mg/kg MT处理组精卵兼性状态较50 mg/kg MT处理组明显,但精原细胞的数量少于100 mg/kg MT处理组,对照组卵巢未出现精原细胞。血清类固醇激素测定结果显示,投喂不同剂量的MT,E_2浓度均显著升高,于45 d时达到最高值,之后趋于平稳下降,但仍显著高于对照组,未经处理的雄性草鱼,随着早期精巢的发育,其E_2水平也逐渐升高。随着MT投喂时间的延长,各处理组T浓度分别有不同程度的降低,45 d时各处理组降幅最大,且与MT浓度呈正相关,11-KT则有不同程度升高。研究表明,100 mg/kg MT为其性逆转较适宜的浓度,MT可使早期雌性草鱼血清E_2升高,发挥雄激素效应,从而促进卵巢卵细胞退化,精原细胞增殖。     

人工诱导稀有鮈鲫雄核发育条件研究

为了探究单性群体选育途径，定向生产具备特定生长和繁殖性状的苗种，满足繁殖育种需要，进行濒危鱼类保护，以稀有鮈鲫（Gobicypris rarus）为试验对象，采用紫外线-热休克雄核发育技术诱导二倍体的方法，人工诱导稀有鮈鲫超雄个体产生。试验设置14组，1号为空白对照组，2~8号紫外线总辐射剂量分别为60、90、120、150、180、210、230 mJ/cm2，9～14号紫外线-热休克组的总辐射剂量分别为60、90、120、150、180、210 mJ/cm2。处理水温均为(38.5±0.5)℃，热休克2 min。结果表明：(1) 在紫外线总辐射剂量60~230 mJ/cm2时，随着照射剂量的不断增加，紫外线辐照组、紫外线-热休克组的受精率﹑孵化率均有下降趋势；(2)紫外线和热休克处理对受精卵造成一定的损伤，成活率大幅度降低的时间点主要集中在囊胚晚期、肌肉效应期以及出膜前期，少数胚胎由于活力差，存在难以正常脱膜孵化现象；(3)经紫外线或紫外线-热休克处理的受精卵，发育速度稍慢于正常受精卵，且均存在畸形发育卵。通过紫外线-热休克雄核发育技术获得的稀有鮈鲫畸形个体较少，可能为超雄正常形态的个体则更少。研究显示，紫外线和热休克相结合处理鱼类染色体的技术，有望成为人工诱导稀有鮈鲫雄核发育的有效方法。     

饥饿及再投喂处理对草鱼生长、葡萄糖代谢和转运蛋白1表达的影响

设置持续投喂组(C,持续投喂8周)、饥饿再投喂组(R,饥饿4周+再投喂4周)和持续饥饿组(S,饥饿8周)3个处理组,研究3种不同饥饿处理对草鱼(Ctenopharyngodon idellus)血清生化指标、糖原和糖代谢相关酶和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的影响,同时在此实验基础上研究草鱼在急性高糖负荷胁迫下的糖耐受能力、糖代谢相关酶和GLUT1的变化规律,旨在阐明草鱼在饥饿及再投喂处理条件下的糖代谢特征。选取初重为(125.35±0.54)g的草鱼,饲养8周后以30 mg/100 g体重的剂量腹腔注射葡萄糖研究其糖耐受能力。结果显示,S组肝糖原和血清的血糖、甘油三酯含量均最低。饥饿处理对草鱼糖耐受能力影响显著,S组血糖含量在各时间点上显著低于其余两组(P0.05),肝糖原在6 h达到峰值;饥饿处理对草鱼肝脏糖代谢关键酶影响显著,饥饿处理(S组)诱使磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)活性上升但抑制丙酮酸激酶(PK)和果糖-6-磷酸激酶(PFK)的活性(P0.05),而饥饿再投喂(R组)后PEPCK、PK和PFK酶活性恢复到持续投喂(C组)处理水平。注射葡萄糖后S组肝脏GK酶活性增幅最大,PK酶活性呈上升趋势,而R组则呈先下降后上升的趋势;饥饿处理对草鱼肝脏和肌肉GLUT1表达影响显著,注射葡萄糖后,除R组肝脏组织外,其余各组草鱼肝脏和肌肉组织GLUT1表达量均呈先上升后下降的趋势,且S组肌肉GLUT1表达量在各个时间点上均高于其余两组(P0.05)。研究结果表明,在不同饥饿处理下,草鱼可通过消耗肝糖原和甘油三酯及降低肝脏糖酵解相关酶(PK和PFK)活性和促进糖异生PEPCK酶活性来应对饥饿胁迫,而饥饿处理可诱使GK和PK酶活性上升、促进糖原合成和激活GLUT1基因的表达和转运来缓解草鱼急性高糖负荷,从而提高其糖耐受能力。     

饥饿及再投喂处理对草鱼生长、葡萄糖代谢和转运蛋白1表达的影响

本研究设置持续投喂组(C, 持续投喂8周)、饥饿再投喂组(R, 饥饿4周+再投喂4周)和持续饥饿组(S, 饥饿8周)3个处理组, 研究三种不同饥饿处理下草鱼血清生化指标、糖原和糖代谢相关酶和葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)的影响, 同时在此实验基础上研究草鱼在急性高糖负荷胁迫下的糖耐受能力、糖代谢相关酶和GLUT1的变化规律, 旨在阐明草鱼在饥饿及再投喂处理条件下的糖代谢特征。选取初重为(125.35±0.54) g的草鱼, 饲养8周后以30 mg/100 g体质量的剂量腹腔注射葡萄糖研究其糖耐受能力。结果显示, S组肝糖原和血清的血糖、甘油三酯含量均最低。饥饿处理对草鱼糖耐受能力影响显著, S组血糖含量在各时间点上显著低于其余两组(Plt;0.05), 肝糖原在6 h达到峰值; 饥饿处理对草鱼肝脏糖代谢关键酶影响显著, 饥饿处理(S组)诱使PEPCK酶活性上升但抑制PK和PFK酶的活性(Plt;0.05), 而饥饿再投喂(R组)后PEPCK、PK和PFK酶活性恢复到持续投喂(C组)处理水平。注射葡萄糖后S组肝脏GK酶活性增幅最大, PK酶活性呈上升趋势, 而R组则呈先下降后上升的趋势; 饥饿处理对草鱼肝脏和肌肉GLUT1表达影响显著, 注射葡萄糖后, 除R组肝脏组织外, 其余各组草鱼肝脏和肌肉组织GLUT1表达量均呈先上升后下降的趋势, 且S组肌肉GLUT1表达量在各个时间点上均高于其余两组(Plt;0.05)。研究结果表明, 在不同饥饿处理下, 草鱼可通过消耗肝糖原和甘油三酯及降低肝脏糖酵解相关酶(PK和PFK)活性和促进糖异生PEPCK酶活性来应对饥饿胁迫, 而饥饿处理可诱使GK和PK酶活性上升、促进糖原合成和激活GLUT1基因的表达和转运来缓解草鱼急性高糖负荷从而提高其糖耐受能力。     

不同质量浓度铅对草鱼鱼种抗氧化性能的影响

将草鱼暴露于不同水平(0、72、144、288 mg/L)的硝酸铅水溶液中,分别于12、24、48、96 h测定草鱼肝、鳃组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)含量.试验结果表明,当鱼经不同质量浓度Pb2+处理24 h后,其肝脏的GSH-Px活性表现为诱导效应;而鳃在低质量浓度(72 mg/L)Pb2+处理也表现诱导效应,但高质量浓度Pb2+(144、288 mg/L)处理24 h后,其GSH-Px活性表现为抑制效应.与肝GSH-Px相比,草鱼肝SOD经Pb2+处理后其活性抑制更加明显,表明肝SOD对Pb2+的毒性反应比肝GSH-Px敏感.同时,草鱼经不同质量浓度Pb2+处理12 h后,肝与鳃的MDA含量均比对照组明显增加.上述研究结果表明,水体铅可能通过诱导草鱼肝脏与鳃发生氧化损伤而发挥毒性作用,并进一步损伤机体结构及其生理功能.     

Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒在稀有鮈鲫中的传播途径研究

草鱼呼肠孤病毒（GCRV）引起的草鱼出血病是造成我国草鱼养殖风险的主要疾病之一。II型草鱼呼肠孤病毒（GCRV-Ⅱ）是草鱼出血病的主要致病毒株,为了研究其流行规律,本文基于稀有鮈鲫感染GCRV-JX02的研究模型,利用分子生物学检测,RT-qPCR定量等方法开展GCRV-II水平和垂直传播的研究,结果显示,水平传播中浸泡感染和共培养感染都能使稀有鮈鲫成为GCRV-II的无症状携带者,阳性检出率分别为50%和80%;其中共培养感染直接导致8%的稀有鮈鲫死亡。感染后无症状的稀有鮈鲫经热休克处理,浸泡感染与共培养感染组的死亡率分别为57.14%和100%,总体阳性检出率分别为80.95%和100%。腹腔注射感染GCRV-JX02后存活的无症状稀有鮈鲫每0.01克精巢与卵巢中病毒拷贝数分别为3.64×106和6.84×106。垂直传播实验中稀有鮈鲫单个的卵子、未受精卵、受精卵和幼鱼的平均病毒拷贝数为1.98×103、1.15×104、4.75×103和6.74×104,幼鱼中病毒的拷贝数显著高于卵子与受精卵时期,表明GCRV-JX02不仅能够在稀有鮈鲫中垂直传播,还能伴随幼鱼的发育不断扩增。本研究阐明了不同传播途径下GCRV-Ⅱ的传播潜力,有助于评估草鱼出血病的流行风险,且为筛选阻断草鱼呼肠孤病毒传播的药物提供了有效的动物模型。