蛋白质工程在苏云金芽胞杆菌Cry毒素改良中的应用

Bt微生物制剂和转基因抗虫作物已经在全球范围内取得了巨大成功,但是Cry蛋白存在杀虫谱窄、毒力有限以及害虫对Bt毒素的抗性风险上升等诸多问题,将严重制约Bt在未来农业生产中进一步发挥巨大作用。利用理性设计、非理性设计等蛋白质工程技术对Bt Cry蛋白进行改造是解决这些问题的新途径。通过总结蛋白质工程在Cry毒素改良中的应用情况,分析了存在的问题,并对未来发展动向进行了展望。     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为研究

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种,采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行为进行了研究.连续三代的研究结果表明Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株(T01,T02,T03,T05,T06,T07,T08)的基因组中,并稳定地遗传给后代.纯合转基因株系杂交分析表明,在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的,T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白基因整合位点是同源染色体的不同座位,而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白基因整合位点是在非同源染色体上.     

Bt杀虫蛋白在亚洲玉米螟幼虫体内组织中的分布

采用ELISA法检测了亚洲玉米螟取食转基因玉米后,Bt杀虫蛋白(Cry1Ab杀虫蛋白)在幼虫体内组织中的分布情况.结果表明,中肠和血淋巴中Bt杀虫蛋白含量最高,分别为267 ng·g-1和417 ng·g-1,丝腺、脂肪体、马氏管的含量较低,生殖器官中未检测到Bt杀虫蛋白;幼虫取食转基因玉米3d后改喂普通玉米的亚洲玉米螟发育成的蛹、成虫及卵中不含Bt杀虫蛋白.     

利用ELISA检测新疆转基因抗虫棉组织中Bt杀虫蛋白

利用抗体一抗原一酶标抗体反应,建立了酶联免疫吸附测定法(ELISA),检测转基因抗虫棉中Bt杀虫蛋白的表达。这一检测方法不仅对转基因抗虫棉组织中Bt杀虫蛋白表达量进行定性、定量测定,也对转基因抗虫棉的选育和抗虫性测定提供了依据。     

外源基因在转基因抗虫油菜中的遗传行为

为了选育出稳定的转基因抗虫油菜新品种，采用卡那霉素抗性分析和PCR检测技术对转基因抗虫油菜中Bt杀虫蛋白基因的遗传行进行了研究，连续三代的研究结果表明，Bt杀虫蛋白基因以单拷贝、杂合地整合到转基因植株（T01，T02，T03，T05，T06，T07，T08）的基因组中，并稳定地遗传给后代，纯合转基因株系杂交分析表明，在不同T0转基因植株中Bt杀虫蛋白基因整合位点是不同的，T01和T05或T03和T08的Bt杀虫蛋白若整位点是同源染色体的不同座位，而其他转基因植株的Bt杀虫蛋白若整位点是在非同源染色体上。     

转Bt基因作物毒素蛋白降解特性研究进展

总结了Bt杀虫蛋白的特性、转Bt基因作物毒素蛋白在土壤中的残留和积累以及对土壤生态系统的影响,阐明了转Bt基因作物毒素蛋白在土壤中的降解与影响因素,并提出应积极开展转Bt基因作物秸秆的降解研究,在降解秸秆的同时降解其中的Bt毒素蛋白.     

新疆转基因抗虫棉组织中Bt杀虫蛋白表达的研究

利用酶联免疫吸附测定法（ELISA）结合卡那霉素涂棉花的方法,检测转基因抗虫棉组织中Bt杀虫蛋白的表达。这一检测方法不仅可以快速、方便地对转基因抗虫棉组织中Bt杀虫蛋白表达量进行定性、定量测定,也对转基因抗虫棉的选育和抗虫性测定提供了依据。     

转vip3基因作物研究进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫晶体蛋白(Insecticidal Crystal Proteins,ICPs)转基因作物在全球种植已近15年。随着转基因作物种植面积的扩大,害虫对Bt杀虫蛋白产生抗性已成为一个严峻的问题。通过研究发现,苏云金芽孢杆菌的营养生长阶段可产生一种新的毒素,即VIP3蛋白。VIP3蛋白与已知的ICPs没有序列同源性和结构相似性,表达VIP3对十多种鳞翅目害虫具有毒杀作用,具有更广泛的抗虫谱,尤其可毒杀小地老虎(Agrois ipsilon)等对Bt非敏感害虫,对环境生物没有不良影响,是防治抗性害虫及扩大抗虫谱的一种新策略。     

高温对转基因抗虫棉中Bt杀虫基因表达的影响

 Bt抗虫棉中Bt杀虫基因能否稳定表达是影响转基因抗虫棉应用前景和商品化生产的重要因素。以转基因双价抗虫棉139-20的R5代材料，通过不同温度处理，研究温度处理对Bt杀虫基因表达的影响。结果表明，温度变化影响抗虫棉早期的生长发育和Bt杀虫基因的表达，从而影响了抗虫棉生长发育过程中Bt杀虫蛋白含量降低的时间。高温处理后可使Bt杀虫基因在生长发育期中的沉默时间提前，导致Bt杀虫蛋白含量急剧降低，具体原因可能是由于转录后水平的基因表达调控，引起特异Bt 杀虫基因mRNA的降解。因此，在生产实际中，应予以提前采取措施，预防高温期棉铃虫危害。     

利用Dot-ELISA检测Bt棉杀虫蛋白的研究

用苏云金芽孢杆菌HD-1和HD-68晶体杀虫蛋白的碱溶产物作为抗原,制备相应的抗血清,建立了检测Bt杀虫蛋白的Dot-ELISA,可检测Bt杀虫蛋白的最低水平为87.5ng/ml。用Dot-ELISA对2个转基因抗虫棉和它们的亲本进行了检测,并与生物学测定的抗虫性进行比较,结果基本一致。因此,对测定大批量转基因抗虫棉的抗虫性,Dot-ELISA是一个快速、敏感、特异、有效的方法。     

氨肽酶N(APN)与鳞翅目昆虫对Bt抗性的关系

使用Bt Cry毒素防治农业害虫是作物生产上的一个革命性的进步,受体与Bt杀虫蛋白结合能力的改变可能是昆虫对Bt产生抗性的主要原因。氨肽酶N(aminopeptidase N,APN)是一类存在于昆虫中肠内的Bt毒素受体蛋白,通过讨论APN与Bt毒素的结合作用,综述了APN基因变异与鳞翅目昆虫Bt抗性相关的分子机理,并介绍了(Bt)Cry毒素与APN相关的作用方式新模型。     

Bt toxin resistance from loss of a putative carbohydrate-modifying enzyme

The development of resistance is the main threat to the long-term use of toxins from Bacillus thuringiensis (Bt) in transgenic plants. Here we report the cloning of a Bt toxin resistance gene, Caenorhabditis elegans bre-5, which encodes a putative beta-1,3-galactosyltransferase. Lack of bre-5 in the intestine led to resistance to the Bt toxin Cry5B. Wild-type but not bre-5 mutant animals were found to uptake toxin into their gut cells, consistent with bre-5 mutants lacking toxin-binding sites on their apical gut. bre-5 mutants displayed resistance to Cry14A, a Bt toxin lethal to both nematodes and insects; this indicates that resistance by loss of carbohydrate modification is relevant to multiple Bt toxins.     

Engineering modified Bt toxins to counter insect resistance

The evolution of insect resistance threatens the effectiveness of Bacillus thuringiensis (Bt) toxins that are widely used in sprays and transgenic crops. Resistance to Bt toxins in some insects is linked with mutations that disrupt a toxin-binding cadherin protein. We show that susceptibility to the Bt toxin Cry1Ab was reduced by cadherin gene silencing with RNA interference in Manduca sexta, confirming cadherin's role in Bt toxicity. Native Cry1A toxins required cadherin to form oligomers, but modified Cry1A toxins lacking one alpha-helix did not. The modified toxins killed cadherin-silenced M. sexta and Bt-resistant Pectinophora gossypiella that had cadherin deletion mutations. Our findings suggest that cadherin promotes Bt toxicity by facilitating toxin oligomerization and demonstrate that the modified Bt toxins may be useful against pests resistant to standard Bt toxins.     

转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白田间降解动态

【目的】研究间苗后留在田间地表的转Bt基因玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解规律,比较两种Bt玉米幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的转Bt基因抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定各取样时期中幼苗残体中Cry1Ab杀虫蛋白残留量。【结果】转Bt基因玉米幼苗残体中杀虫蛋白降解是逐渐的,且降解速度较快,到50 d时幼苗残体已经完全腐烂,Bt11幼苗残体中的杀虫蛋白已经完全降解,在MON810中还能检测到微量的杀虫蛋白。两种转基因玉米幼苗残体中的Bt杀虫蛋白的初始含量差异不显著,但在同一时间段的Bt杀虫蛋白降解速度存在差异均显著,在30 d前MON810幼苗残体中Bt杀虫蛋白降解速度比Bt11降解的快,30d后,则降解趋势相反,到50 d取样结束时MON810和Bt11分别降解了初始含量的99.81%和100%。【结论】两种转Bt基因玉米间苗后留在田间的幼苗残体中的Cry1Ab杀虫蛋白降解速度不同,在50 d完全腐烂时,其中的杀虫蛋白完全降解或仅有微量残留。     

转Bt基因抗虫玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态

【目的】研究转cry1Ab杀虫蛋白基因玉米收获后玉米根茬及其根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解动态,比较两种Bt玉米根茬和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解速度。【方法】以两种表达Cry1Ab杀虫蛋白的Bt抗虫玉米MON810和Bt11为材料,采用ELISA方法测定玉米收获后根茬残体和根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的田间降解动态。【结果】转Bt基因玉米根茬残体和根际土壤中杀虫蛋白是逐渐降解的,Bt玉米MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较高,降解的速度也较慢,收获后8个月时还不能完全降解;Bt玉米Bt11根茬中Cry1Ab杀虫蛋白含量较低,降解速度比MON810根茬中Cry1Ab杀虫蛋白降解速度快,到7个月时已检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。Bt玉米MON810根际土壤中Cry1Ab杀虫蛋白的降解较Bt11的慢,MON810和Bt11根际土壤分别在8个月和7个月时检测不到Cry1Ab杀虫蛋白。【结论】种植过Bt11和MON810抗虫玉米的田块,在第二年春播农作物已经出土时,其根茬和根际土壤中残留的Cry1Ab杀虫蛋白尚不能完全降解,还有少量残留。     

cry2Ah-M基因杀虫活性研究

转Bt基因抗虫棉经过20多年的研究和生产应用,虽然取得了巨大的生态和经济效益,但棉铃虫的抗性风险也逐渐增加,因此,通过发掘不同杀虫机理的Bt基因,不仅可以提高杀虫效率,而且有效的避免或延迟昆虫的抗性。依据棉花遗传密码子偏好性,对来源于苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)新型Bt基因cry2Ah-like进行了密码子优化改造,利用农杆菌介导法导入烟草。通过荧光定量PCR方法,Southern blot和Western blot方法,证明了转基因烟草中外源基因在RNA和蛋白水平上均稳定表达,并且已整合到烟草基因组中。生物活性检测结果表明,饲喂转基因烟草叶片4 d后,棉铃虫幼虫校正死亡率达86.59%,达到高抗水平,进一步证明密码子优化后的cry2Ah-M基因能够高效表达且具有较高的杀虫活性,是有效防治棉铃虫的新型基因。     

Identification of a gene associated with Bt resistance in Heliothis virescens

Transgenic crops producing insecticidal toxins from Bacillus thuringiensis (Bt) are widely used for pest control. Bt-resistant insect strains have been studied, but the molecular basis of resistance has remained elusive. Here, we show that disruption of a cadherin-superfamily gene by retrotransposon-mediated insertion was linked to high levels of resistance to the Bt toxin Cry1Ac in the cotton pest Heliothis virescens. Monitoring the early phases of Bt resistance evolution in the field has been viewed as crucial but extremely difficult, especially when resistance is recessive. Our findings enable efficient DNA-based screening for resistant heterozygotes by directly detecting the recessive allele.     

苏云金芽孢杆菌的概况及其研究进展

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)杀虫剂是对人和环境友好的安全型细菌杀虫剂。目前Bt杀虫剂已被广泛应用,但因使用剂量较大,导致防治害虫时费用过高。若在生物防治中使用超高效的细菌杀虫剂,就可降低其使用剂量。Bt 00-50-5菌株是从美国引进的高效杀虫菌株,其晶体蛋白的特征分析尚未完成,其毒素的作用机理研究也未进行。本项目即将开展如下研究:(1)先用具有特异性杀虫功能的Bt 00-50-5菌株进行发酵,继续完成对防治中国害虫防治效果的评价;再分析细菌的编码杀虫毒素基因和毒素的生化特征;然后混合荧光标记毒素和中肠细胞,加入昆虫中肠蛋白酶(或单独加入氨肽酶、碱性磷酸酶、ATP酶、枯草杆菌蛋白酶、钠或钾离子代之)反应,用荧光显微镜观察细胞变化;最后阐明杀虫毒素对靶标细胞作用机制。(2)通过研究毒素分子与受体分子的作用关系,拟在分子水平上阐明毒素的作用机制。