将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin I)基因导入甘薯品种

本研究采用根癌农杆菌介导法以12个甘薯品种作为受体材料,将OCI（Oryzacystatin I)基因导入甘薯品种中,获取7个品种的抗Kan再生植株,对获得的具有Kan抗性的再生植株进行PCR分子检测,初步结果证明已将外源OCI基因导入到4个甘薯品种(6个株系)的基因组中。     

分子生物学技术在甘薯中的应用

甘薯是重要的粮食作物,它的遗传背景复杂,分子生物学研究进展落后于水稻、玉米等作物。分子标记技术主要应用于甘薯的遗传图谱构建、遗传多样性分析以及亲缘关系分析等方面。目前,已经构建了数张遗传图谱,亲缘关系分析表明三浅裂野牵牛I.trifida与甘薯有很紧密的亲缘性。基因克隆技术已经应用于甘薯在抗逆、品质以及块根发育等相关基因的分离,为甘薯的分子育种带来了有益的目的基因。在栗子香、新大紫等甘薯品种有转基因的报道,采用农杆菌介导的方法,已经取得了少量的转基因植株。     

甘薯块根储藏蛋白(Sporamin)启动子克隆及功能验证

提取甘薯“川薯34”总DNA,设计引物,通过高保真PCR扩增获得了长为1 144bp的甘薯储藏蛋白(Sporamin)基因启动子SpoA-p.PLACE在线分析表明:Sporamin启动子具有基本的启动子元件CAAT-box,并包含大量与储藏蛋白表达相关、抗逆相关及蔗糖表达相关的功能组件.构建植物表达载体pBI-SpoA-p::GUS、农杆菌工程菌株EHA105:pBI-SpoA-p::GUS后导入烟草及甘薯,分别得到15株烟草和10株甘薯的阳性转基因植株,GUS染色分析表明烟草各部位中只在根中有基因表达,甘薯根、茎和叶各部位未检测到活性.5％蔗糖诱导处理24 h后,在烟草根、茎及叶均观察到GUS活性;在甘薯中只有根有GUS活性.因此,可以看出此启动子为甘薯根部特异的表达启动子,并受蔗糖诱导而表达.     

根癌农杆菌介导苎麻转绿色荧光蛋白（GFP）基因植株再生

以苎麻优良品系“5041-3”子叶作为受体,利用根癌农杆菌介导法进行了绿色荧光蛋白基因的遗传转化研究,农杆菌菌株为EHA105,重组质粒为pBIN m-GFP5-ER。经农杆菌浸染后的子叶外植体经过共培养、选择培养、伸长培养和生根培养后再生出抗性植株,对抗性植株的再生过程进行了GFP荧光检测,结果表明,GFP基因能在苎麻中强烈表达,证明GFP基因能够在苎麻遗传转化中得到应用。对抗性植株的Southern杂交检测证实外源基因已整合到苎麻基因组中。     

甘薯外植体组织培养和植株再生

近年来,国内外已有许多研究单位开展了甘薯的组织培养和花药培养工作,并报道了从甘薯块根愈伤组织获得再生植株和应用顶端分生组织培养脱去病毒,以便达到提纯复壮的目的。吴耀武(1979),D.L.Biding和I.F.Shepard(1980)分别报道了甘薯茎、叶柄原生质体和叶肉细胞的群体发育。蔡新生等(1982)培养甘薯茎段获得愈伤组织并分化出胚状体。但至今尚未见到从甘薯的外植体茎段、叶柄和叶片的愈伤组织分化再生植株的研究文献。本文将报道这方面的一些实验结果。     

基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌介导转化方法的研究

以中棉所49、珂字棉201和YZ-1为受体材料,通过对培养基草甘膦浓度、农杆菌侵染时间和浓度、共培养时间以及恢复培养条件等因素的优化,建立了基于抗草甘膦基因的棉花茎尖农杆菌转化技术体系,并将抗草甘膦基因(EPSPS-G6)导入3个受体材料,获得转基因抗草甘膦棉花植株.研究结果表明,适合于棉花茎尖农杆菌介导的草甘膦筛选浓度为10 mg·L-1;茎尖转化体系为农杆菌菌液OD600为0.9～1.0,侵染时间为20min,共培养时间为48 h,选用SH培养基并加入适量活性炭(0.5 g·L-1)作为恢复培养基.用本研究创制的转化技术体系,转化处理3个陆地棉受体360个茎尖,共获得60株抗性再生植株,经PCR检测,获得阳性抗性植株26株,移栽成活23株.以茎尖外植体数计算,本体系的转化成功率6.4％.该转化体系适合于转化抗草甘膦基因或以抗草甘膦基因为筛选基因的外源基因,具有转化频率高、嵌合体少、转化周期短等优点.     

转根癌农杆菌介导的AtNHX1基因马铃薯的获得

构建重组表达质粒pBI12135-GZ+AtNHX1（带有CaMV 35S启动子）,通过农杆菌将其携带的液泡膜Na⁺/H⁺逆向转运蛋白基因（AtNHX）转化马铃薯栽培品种“甘农薯2号”试管薯薄片和“克新2号”茎段。经根癌农杆菌侵染和共培养后,用50 mg L^-1卡那霉素 +300 mg L^-1头孢霉素筛选抗性芽,试管薯薄片获得30株抗性植株,抗性植株再生率为37%;茎段未获得抗性植株。抗性植株的总DNA用AtNHX1基因的特异性引物进行PCR检测,结果27株为阳性,占90%。Southern杂交结果证实,外源基因多以双拷贝整合到马铃薯的基因组中。Northern杂交结果表明,转基因植株可以进行AtNHX1基因mRNA的正常转录,但植株间存在着转录量的差异。该研究为耐盐马铃薯的培育奠定了良好的基础。     

纽荷尔脐橙成年态节间茎段遗传转化研究

建立柑橘成年态节间茎段的离体再生和遗传转化系统是实现柑橘转基因育种实用化的前提基础。本试验以纽荷尔脐橙成年态节间茎段为试材,初步建立了脐橙成年态节间茎段的离体再生和遗传转化系统。结果表明采用改良的预处理灭菌法对成年态茎段进行消毒处理,污染率明显降低。节间茎段在MS＋3mg／L6-BA的培养基上,不定芽再生率较高。采用根癌农杆菌介导法将外源抗真菌病基因chit42导入其中,抗性芽通过二次嫁接后获得再生植株,PCR检测4株抗性植株中有2株扩增出该特异性条带,RT-PCR分析进一步确认外源基因chit42能够在转基因植株的基因组中表达。     

根癌农杆菌介导白细胞介素-4基因转化甘蓝(Brassica oleracea L.)研究

利用根癌农杆菌介导法,以白细胞介素-4(interleukin-4,IL-4)基因转化中甘11号甘蓝.本研究对可能影响il-4转化率的外植体类型、外植体的预培养时间、农杆菌的侵染时间以及外植体与农杆菌的共培养时间进行了优化.试验结果表明:il-4基因对带1～2 mm子叶柄的子叶的转化率显著高于下胚轴;带柄子叶在预培养1 d、侵染3 min、共培养1 d时,转化效果最好,转化率达23.3%;下胚轴在预培养1～3 d,侵染3～5 min,共培养1～2 d时,转化效果较好,转化率最高可达13.3%.经PCR检测及PCR-Southern杂交,初步证明目的基因il-4已经转入甘蓝的再生植株.转il-4基因甘蓝的PCR阳性再生植株已经开花并产生了后代.     

拟南芥pre-miR399b植物表达载体的构建

根据拟南芥miR399b茎环序列设计引物,PCR扩增克隆了拟南芥pre-miR399b(precursor miRNA)基因。采用LIC(Ligation-Independent cloning)法将pre-miR399b连接到双元植物表达载体pJG045上,构建成植物表达载体pS-DC2,并用冻融法将其导入根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)EHA105中。研究结果为将pre-miR399b基因转化大豆再生植株,鉴定miR399b基因在大豆磷吸收利用中的功能及培育磷高效大豆新品种奠定了基础。     

改良大豆子叶节再生体系的研究

采用大豆种子萌发5~6 d后的子叶节作外植体，对农杆菌介导的大豆遗传转化系统及其影响因素进行了研究。结果表明，将子叶节与农杆菌共培养60 h后放入含卡那霉素50 mg/L的诱芽培养基上，待苗长至4~5 cm后放入生根培养基中进行生根，最后移栽到培养土中，效果较好。对大豆遗传转化再生的主要因素，如大豆基因型、诱导出芽所需激素浓度、卡那霉素筛选压力等条件做了一系列的研究，建立了一个比较好的遗传转化系统，其转化率达到2.8%。     

农杆菌介导的马铃薯试管薯遗传转化体系的优化及反义class Ⅰ patatin基因的导入

用两个马铃薯栽培品种"鄂马铃薯3号"和"甘农薯2号"的试管薯为供体材料,建立了一种农杆菌介导的简单、快速和高效的遗传转化系统.在含有75 mg/L卡那霉素的选择培养基上,2～3周可产生抗性芽,4～5周获得完整的转基因植株.筛选出了试管薯遗传转化的优化条件,特别是在再生培养基中加入2 mg/L玉米素,两个品种的转化频率分别高达45.5     

甘薯胚性细胞悬浮培养系的建立

地甘薯胚性细胞悬浮增减系的进行了研究。将１２个基因的长约０．５ｍｍ的茎尖培养在含有０．２ｍｇ／Ｌ或２．０ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ的ＭＳ培养基上，形成了胚性愈伤组织。胚性愈伤组织的形成率因基因型和２，４－Ｄ深度不同而很大差异，为０－７５．７％。一方面，将胚性愈伤组织继续增减在含有２，４－Ｄ的ＭＳ培养基上，它们形成了处于各发育时期的体细胞胚。将具有体细胞胚的胚性愈伤组织转移到ＭＳ基本培养基上，体细胞胚发育成     

表达bar基因的抗除草剂转基因甘薯的获得

用农杆菌介导法将bar基因导入甘薯主栽品种徐薯18的胚性悬浮细胞中,获得了抗除草剂的转基因植株.农杆菌菌株EHA105携带的双元载体pCAMBIA3300上含有bar基因.来自于徐薯18胚性悬浮细胞的直径为0.7～1.3 min的280个胚性细胞团用于遗传转化.共培养3 d后,首先在含有2 mg/L 2,4-D、100 mg/L Carb的液体MS培养基中培养1周,然后将胚性细胞团转移到添加2 mg/L 2,4-D、100 mg/L Carb 和0.3 mg/L PPT的固体MS培养基上进行选择培养.选择8周后,将获得的37个PPT抗性愈伤组织转移到添加1 mg/L ABA、100mg/L carb和0.3 mg/L PPT的固体MS培养基上,其中的34个愈伤组织诱导得到体细胞胚并发芽形成小植株,共获得了164株拟转基因植株.PCR分析表明,其中的123株为转基因植株.Southern blot和Northern blot分析表明,bar基因稳定整合到转基因植株的基因组中并正确表达.除草剂喷洒试验结果表明,转基因植株具有高度除草剂抗性.     

沙冬青脱水素基因转化紫花苜蓿的研究

为获得抗旱性较强的转基因苜蓿植株,以紫花苜蓿品种中苜2号作为基因转化受体,通过对外植体选择、菌液浓度、选择压确定、侵染时间和共培养时间等因素进行优化,成功建立了农杆菌介导的遗传转化体系。在此基础上,将沙冬青脱水素基因通过农杆菌的介导,转化到中苜2号中。试验结果显示,子叶和下胚轴作为外植体愈伤组织诱导频率最高,可达100%;获得抗性愈伤组织与转基因植株的卡那霉素最佳筛选浓度为25 mg/L;外植体与农杆菌的共培养时间以5 d为最佳。试验共获得126株T0抗性株,PCR检测30株表现为阳性,表明脱水素基因已转入受体植株中。     

番茄‘黄樱桃-2号’再生体系研究

以番茄‘黄樱桃-2号’的子叶切段为外植体,研究不同激素组合对愈伤组织产生以及再生芽诱导的影响。结果表明,不同种类和浓度的激素诱导形成的‘黄樱桃-2号’愈伤组织和再生芽数目存在差异,最适培养基为：MS+ 6-BA 2.5 mg/L+ IAA 0.2 mg/L,出愈率可达到95.08%,每个外植体再生芽数约为5。最适生根培养基为：1/2MS+ IAA 0.2 mg/L。通过观察头孢霉素和羧苄青霉素2种抗生素对子叶愈伤组织和再生芽诱导情况的影响,确定‘黄樱桃-2号’子叶的除菌培养基为：MS+ 6-BA 2.5 mg/L+ IAA 0.2 mg/L+ 头孢霉素 200 mg/L+ 羧苄青霉素 200 mg/L。同时还对作为筛选剂的卡那霉素进行了浓度筛选,确定了卡那霉素对‘黄樱桃-2号’子叶的筛选浓度为50 mg/L。     

4种地被菊再生及遗传转化条件的比较

为建立地被菊‘神韵’、‘繁星粉’、‘都市丽人’和‘粉玫瑰’的离体再生体系,明确其遗传转化条件,为通过转基因技术培育地被菊新品种奠定基础,以叶片为外植体,研究了激素配比对4种地被菊再生芽诱导的影响;通过农杆菌介导比较了4种地被菊的遗传转化条件。研究结果表明,‘神韵’、‘繁星粉’、‘都市丽人’和‘粉玫瑰’可分别在含有NAA 1.0 mg/L+ BA 1.0 mg/L、NAA 0.3 mg/L+ BA 1.0 mg/L、NAA 1.5 mg/L+ BA 0.5 mg/L、NAA 0.5 mg/L+ BA 1.5 mg/L的MS培养基上获得最佳分化率;其叶片外植体的遗传转化条件为24 h预培养、OD600分别为0.4、0.5、0.3和0.4的农杆菌侵染10 min、共培养48 h、延迟培养2天、甘露糖筛选浓度为10 g/L、头孢霉素抑菌浓度为300 mg/L。部分抗性植株经PCR检测获得了目的条带,初步证明目的基因已经整合到4种地被菊的基因组中。     

甘薯和Ipomoea lacunosa的种间体细胞杂种植株再生及鉴定

用ＰＥＧ融合法融合甘薯品种高系１４号和近缘野生种Ｉｐｏｍｏｅａ ｌａｃｕｎｏｓａ的原生质体，将融合原生质体培养在含有０．０５ｍｇ／Ｌ２，４－Ｄ和０．５ｍｇ／Ｌ ＫＴ的ＭＳ培养基上，愈伤组织迅速增殖。将其中的７０个愈伤组织培养在添加３．０ｍｇ／Ｌ ＢＡＰ的ＭＳ培养基上，并进一步培养在ＭＳ基本培养基上，获得９株再生植株。过氧化物酶同工酶、酯酶同工酶和ＲＡＰＤ分析表明，其中２株再生植株（ＫＬ１和ＫＬ３）     

海藻糖合酶基因转化黑麦草及耐旱性研究

以多年生黑麦草(Lolium perenne L.)种子成熟胚为外植体,在MS附加5 mg/L 2,4-D、500 mg/L的L-脯氨酸、130 mg/L天门冬酰氨、10 mg/L AgNO3的诱导培养基(MSJ)上诱导胚性愈伤组织.用基因枪法将ubiqutin启动子驱动的海藻糖合酶基因(TPS基因)转入多年生黑麦草的胚性愈伤.在含有5 mg/LBialaphos的选择培养基上经过2个月的抗性筛选,抗性愈伤组织在分化培养基上生成了898株再生植株,其中的220株检测为阳性株,检测的阳性率占供检株数的24.5%.PCR分析及PCR-Southern杂交鉴定表明,TPS基因已整合到黑麦草的基因组中.抗旱性鉴定表明,转基因黑麦草在干旱胁迫条件下的保水能力增强,电解质渗出率明显低于对照,耐旱性提高.     

基因型和激素对转基因马铃薯植株再生的影响

本研究对影响农杆菌介导的马铃薯转基因植株再生的基因型和激素两个因素进行了探讨。试验结果表明,基因型对愈伤诱导率和芽诱导率均有很大影响,不同品种的愈伤诱导率为72.22%~95.83%,最高的是"Russet Burbank";芽分化率为0~11.54%,最高的是"费乌瑞它"。不同6-BA和NAA浓度对加拿大品种"Russet Burbank"的愈伤诱导和不定芽分化有明显影响,6-BA在2.5 mg/L和NAA 0.2~0.3 mg/L的处理愈伤诱导率最高,每块芽数以2.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L NAA最高。NAA浓度影响叶盘的愈伤诱导率且有一定的后效作用。