白菜EST-SSR信息分析与标记的建立

 数量迅速增加的EST为开发新的SSR标记提供了宝贵的资源。本研究对4 584条白菜EST进行了搜索, 共检索出474个SSR, 检出率为10.3% , 包括40种重复基元。其中二核苷酸和三核苷酸重复单元的EST-SSR占主导地位, 二者出现的频率基本相近, 占总SSR的近83%; 其它重复类型所占比例均不足5%。GA和GAA是二、三核苷酸中的优势重复类型, 分别占二、三核苷酸重复类型的71.5%和37.5%。设计了15对EST-SSR引物, 在合适的PCR反应体系下, 以构建EST的白菜自交系A的DNA为模板, 对设计的EST-SSR引物进行筛选, 发现15对EST-SSR引物都能扩增出产物。进一步用这些可扩增的引物对28个白菜品种进行PCR扩增, 发现7对引物显示多态性, 占引物总数的46.7%。此结果表明, 根据EST建立EST-SSR标记是一条简便而又有效的途径。     

三十七个山东牡丹品种DNA指纹图谱构建与EST-SSR标记遗传多样性分析

以中国常熟尚湖牡丹园引栽的37个山东牡丹品种为试材,采用筛选出的10对多态性高、稳定性好且在染色体上分布均匀的EST-SSR标记引物,研究山东牡丹37个品种DNA指纹图谱和遗传多样性。结果表明:10对EST-SSR标记引物在37份材料中共扩增出了共计58个多态性基因型,平均每对引物5.8个,变幅2~13种;10对引物的多态性频率(FP)平均值为0.60;筛选出的4对核心引物可以将37个牡丹品种完全区分,以遗传相似系数0.69为阈值可将供试37个试牡丹品种分成5类。EST-SSR标记在供试牡丹品种间多态性差异较大,适合用于牡丹的DNA指纹图谱的构建。     

苹果EST-SSR引物的开发及部分品种亲缘关系分析

【目的】开发苹果EST-SSR引物,评价苹果种质资源的多样性与亲缘关系。【方法】利用NCBI数据库中苹果EST的SSR位点开发了35对EST-SSR引物,建立了苹果EST-SSR体系,并利用筛选出的16对引物对苹果品种资源的亲缘关系进行研究。【结果】118份基因组DNA共扩增出等位基因位点138个,位点数的变化从3到13不等,平均每对引物检测到8.62个位点,总的多态性比率为94.2%,各引物的多态性比例分布为81.8%～100%,相似系数为0.48～1.00。利用UPGMA法构建聚类树状图,在相似性系数0.65处可将118个供试材料分为5大组:其中第1组又可分为2个亚组,包含了绝大部分供试材料;第2、3、4和5组包含的品种数目分别为12个、11个、3个和2个;第5组与其他组亲缘关系较远,相似性系数仅为0.48。【结论】筛选出的16对EST-SSR引物可用于评价苹果种质资源间的遗传多样性。     

EST-SSR标记在黄瓜F_1种子纯度鉴定中的应用

以黄瓜杂交品种哈研808及其亲本为试验材料,利用102对EST-SSR引物对其进行纯度分析,筛选合适的引物。结果表明:有2对EST-SSR引物能够用于黄瓜杂交种子纯度的鉴定。     

利用SRAP和EST-SSR分析香椿资源的遗传多样性

利用SRAP和EST-SSR标记技术对中国9省10个香椿居群的遗传多样性和亲缘关系进行了分析,试图为香椿种质资源的保护和开发利用奠定基础。结果表明,33对SRAP标记共扩增出167个多态性位点,平均每对引物产生5.06个多态性位点;45对EST-SSR引物共检测到221个多态性位点,平均每对引物检测到4.9个多态位点;所选香椿居群的等位基因数和期望杂合度（EST-SSR,Na = 2.3506,He = 0.4632）及Shannon’s信息指数（SRAP,I = 0.6140;EST-SSR,I = 0.6752）较高,表明中国香椿资源具有较高的遗传多样性;居群间的遗传分化系数（SRAP,Gst = 0.3124;EST-SSR,Fst = 0.2462）表明所研究的香椿资源分化程度较高;聚类结果显示,10个香椿居群可分成3类,其中衡水、泰安和太和居群为一类,成都、昆明、武汉和汝阳居群为一类,德州和泉州居群聚为一类,南京居群的结果因两类引物略有不同;香椿居群间的遗传距离与实际的地理距离相关性不显著。     

基于SSR标记的六种野生猕猴桃亲缘关系分析

以贵州6种野生猕猴桃36个居群为试材，采用生物信息学方法，对“红阳”猕猴桃应答橘小实蝇侵害的转录组数据进行SSR位点搜索，开发EST-SSR引物后，研究了36个野生猕猴桃居群180份种质的遗传多样性与亲缘关系，以期为合理保护及开发利用野生猕猴桃资源提供参考依据。结果表明：“红阳”猕猴桃果实EST-SSR的分布频率为43.07%,6种重复类型的重复次数分布在5～24次，优势重复类型为二核苷酸，占总SSR位点的69.19%。参试的40对EST-SSR引物中有28对引物均可在6种野生猕猴桃中扩增出目的条带，在180个猕猴桃种质中共检测出了348个等位基因位点。多态性信息含量(PIC)在0.376 6(引物：P3-22)～0.930 4(引物：P4-37),平均为0.783 6,其中只有1对引物为中等多态性引物，其它均为高多态性引物。聚类分析显示，6种野生猕猴桃在遗传距离0.72处可分成2个类群，黄毛猕猴桃、毛花猕猴桃、阔叶猕猴桃被归为一类，京梨猕猴桃、异色猕猴桃、硬毛猕猴桃为一类。     

核桃EST-SSR信息分析与标记的初步建立

利用生物信息学方法,从dbEST数据库用SSRHunter软件对4 500条核桃EST序列进行搜索,发现462个SSR分布于399条EST序列中,EST-SSR出现频率10.27%,平均每5.65 kb EST出现一个SSR。核桃二核苷酸重复基元占主导地位,其次为三核苷酸重复基元,分别占总SSR的49.57%和27.27%。核桃二核苷酸EST-SSR的优势类型为AG,其次为AT,分别占二核苷酸SSR的67.25%和28.38%。核桃三核苷酸EST-SSR的优势重复基元为AAG,其次为ACC、AAT、AGG,分别占三核苷酸SSR的25.40%、21.43%、16.67%和11.11%。用Primer Primer 5.0软件设计了11对引物,对核桃属5个样品进行PCR扩增,10对引物有扩增产物,引物有效扩增率90.9%,其中7对引物有多态性,多态性引物占可扩增引物的70%。表明,利用核桃EST序列开发EST-SSR标记是可行的。     

基于EST-SSR标记分析猕猴桃种质遗传关系

利用开发的11对EST-SSR引物分析了33份猕猴桃种质资源的遗传多样性及其遗传关系。结果表明,11对EST-SSR引物在所有供试材料中均可扩增出清晰条带,其中有8对引物呈现多态性,多态性扩增率为72.7%,对33份种质材料的区分率达100%。8对多态性引物共检测到61个等位基因,每对引物可检测到的等位基因数为2-17,平均为7.6个。利用NTSYS-pc软件,以不加权成对算术平均法(UPGMA)对扩增结果进行聚类,谱系图显示,33份种质材料之间的相似系数在0.60～0.97,表明猕猴桃种质之间遗传关系相对来说不是很远。在相似系数0.73的水平上可将供试猕猴桃材料分为7个类群,其结果与传统的形态分类大体一致。从分子角度揭示了猕猴桃种质资源的遗传多态性及其遗传关系。可为猕猴桃种质改良提供理论依据。EST-SSR是非常有效和可靠的分子标记,可为猕猴桃分子育种及遗传连锁图构建奠定基础。     

猕猴桃EST-SSR引物筛选及通用性分析

应用SSRHunter软件对NCBI公共数据库中的猕猴桃EST序列进行筛查，利用Primer5．0软件设计引物并进行筛选，同时对其在部分柑橘类植物的通用性进行分析。以漓江猕猴桃DNA为模板，对所设计的97对EST-SSR引物进行筛选，结果表明其中77对引物能扩增出清晰条带，有效扩增率为79-38％。随机选取20对引物对...     

菠萝微卫星指纹图谱的构建

初步构建了菠萝种质的SSR指纹图谱,为菠萝种质鉴定提供了依据.从菠萝EST-SSR开发的20对微卫星引物扩增31份不同的菠萝种质,筛选出能够稳定扩增且带型差异明显的SSR引物.挑选5对多态性高、分辨率高、重复性好的SSR引物对,作为标准引物对材料进行扩增.每对引物得到的多态性带数8~15个,平均为11条;引物的多态信息...     

甜菜EST-SSR引物的开发与应用

利用NCBI公共数据库现有的甜菜（Beta vulgaris L.）表达序列标签（expressed sequence tags,EST）数据信息,开发了甜菜EST-SSR标记。在所有的29830条甜菜EST序列中共确认得到20109条非冗余EST序列,总长为11287.6kb。在含有微卫星重复的6951条EST序列中按照SSR引物设计要求,最终获得了2845个EST-SSR,平均每3.96 kb含有1个SSR。EST-SSR的分布频率和特征分析表明,A/T单碱基重复最多,其次是AAG/CTT三核苷酸重复,AG/CT二核苷酸重复,ACCTCC/AGGTGG等六核苷酸重复最少。随机合成了100对SSR引物,并分别选用6个甜菜品种进行多态性检验,将其按遗传相似性分为两组,多态信息含量（polymorphism information content,PIC）平均值为0.47。本研究证实这种全新的开发甜菜SSR标记的方法具有高效、多态性较高的特点,在甜菜遗传多样性分析、功能基因定位、遗传图谱构建以及比较基因组等研究方面有广阔的利用前景。     

杏EST-SSR标记的开发

 利用MISA软件对NCBI上杏的15 387条EST序列进行SSR位点查找,发掘出含有SSR位点的序列1 073条,共有1 353个SSR位点,候选SSR位点出现的频率为8.79%。二核苷酸、三核苷酸和四核苷酸重复是最主要的重复类型,分别占23.50%、38.80%和23.43%。设计了50对EST-SSR引物并进行PCR扩增,发现40对引物能扩增出理想的PCR 产物,其中有25对引物能够扩增出多态性带。随机对7对引物的部分杏扩增片段进行了测序分析,发现有57.1%的片段具有相应的SSR位点,对梅DNA指纹中部分谱带的测序结果也证明是杏扩增出的相应的SSR位点。根据推算,从杏EST中开发SSR标记的开发效率为3.98%。进一步选用20对扩增效果最好的引物对24个杏品种,16个花梅品种以及8个果梅品种进行DNA指纹构建与遗传多样性分析,结果表明,来源于杏的EST-SSR引物在梅中有很高的通用性,杏和梅是遗传差异明显的两种植物,果梅与花梅在遗传上是不能分为两类的同种植物。     

Development of novel EST-SSR markers for cucumber (Cucumis sativus) and their transferability to related species

We report on the development of novel simple sequence repeat (SSR) markers from publicly available Cucumis sativus expressed sequence tags (ESTs) and on their transferability among related species. In total, 533 di- to penta-type SSRs were identified from 6344 cucumber ESTs retrieved from GenBank. Identified SSRs mainly comprised of di- and tri-nucleotide repeats, of which AG and AAG motifs were much abundant. A total of 392 SSR-containing unigenes (non-redundant ESTs/consensus sequences) were suitable for primer design. From these, 35 primer pairs were designed as representative samples and 28 were usable markers. Twenty-six out of 28 usable markers revealed polymorphism among 21 cucumber accessions with 2–7 alleles detected (mean = 3.77) and their polymorphism information content (PIC) values ranged from 0.091 to 0.748 (mean = 0.388). The polymorphism observed herein partially arose from the null alleles which occurred at the multiple homoeoloci detected by the markers. Transferability of the 28 EST-SSR markers was investigated in four other cucurbits: melon, watermelon, pumpkin and gourd which showed frequency of 92.9%, 57.1%, 53.6% and 60.7%, respectively. The EST-SSR markers developed herein will complement the currently available genomic SSR markers and may be useful for genetic studies in cucumber and related species.     

蝴蝶兰EST 资源SSR 标记分析与开发

 利用SSRIT软件对NCBI上蝴蝶兰的8 188条EST序列按照碱基重复单元数8以上的标准进行SSR位点查找,发掘出246条EST序列,共含有261个SSR位点,检出率为3.19%。二核苷酸重复是最主要的重复类型,占SSR总数的94.25%。SSR的不同重复单元中,最常见的重复单元是：(TA)_n和(GA)_n,其余出现频率较高的依次为(TC)_n、(AT)_n和(AG)_n。设计了32对EST-SSR引物,以蝴蝶兰品种‘V31’的DNA为模板进行PCR扩增,发现16对引物能扩增出预期产物。进一步用这16对引物对16个蝴蝶兰品种（系）进行PCR扩增,9对引物有多态性,多态性条带数在2 ~ 12个之间。结果表明,设计开发的蝴蝶兰的EST-SSR标记是有效的。     

香菇EST-SSR标记的开发及应用

从NCBI中下载了12 184条香菇(Lentinula edodes)表达序列标签(expressed sequence tag,EST)序列,处理后得到全长3 681 177 bp的4 684个Unigene.在其中共发掘出142个简单重复序列(simple sequence repeat, SSR),分布于120条EST中,分布频率为2.99% (平均分布距离:25.924 kb).其中,单、二、三核苷酸重复是主要的重复类型,A/T,AG/CT,ACG/CTG是单、二、三核苷酸的主要重复基序,分别占所有EST-SSR的23.23%、21.83%和10.56%.利用引物设计软件PrimerPremier5.0设计了40对引物,并利用6%变性聚丙烯酰胺凝胶在18个香菇品种中进行检测.其中,22对引物为多态性引物,多态率为55%.应用NTSYS软件的聚类方法分析表明,18份材料遗传相似系数范围为0.375～0.984,与前人研究结果相符.     

Rose (Rosa hybrida L.) EST-derived microsatellite markers and their transferability to strawberry (Fragaria spp.)

The ‘Genome database for Rosaceae (GDR)’ provides a large collection of expressed sequence tags (ESTs) harboring simple sequence repeats (SSRs) from several Rosaceae genera, including Rosa (rose). Primer pairs flanking SSR were designed for 312 unique Rosa ESTs based on GDR database. Eight rose (Rosa hybrida L.) genotypes were tested for PCR amplification, and 287 (92%) of the primer pairs generated allele-specific PCR bands that were readily scored. From 183 (63.7%) primer pairs that evidenced polymorphic alleles among the eight rose cultivars, 20 pairs evidencing EST sequence homology to known gene functions and high levels of polymorphism were selected and utilized for DNA fingerprinting and genetic diversity assessments of 47 rose hybrids. A total of 202 polymorphic bands were scored and generated unique fingerprints for each rose hybrid. The Nei–Li genetic similarity coefficients among 1081 pair-wise comparisons of 47 cultivars exhibited a broad range of genetic variations from 0.30 (‘Grand King’ and ‘Carnival’) to 0.99 (‘First Red’ and ‘Red Champ’). UPGMA cluster analysis divided 47 hybrids into five major groups and two sub-groups. The cross-species transferability of 273 EST-SSR primer pairs was evaluated using four genotypes of the strawberry, a genus member of the Rosaceae family. PCRs on the DNA samples of strawberry were successful for 165 primer pairs; among these, 123 pairs amplified 243 polymorphic bands. As surrogates of the marker transfer, the phenetic relationship among the four strawberry genotypes was evaluated. Genetic similarity coefficients varied from 0.78 (‘Maehyang’ and ‘Janghyee’) to 0.64 (‘Janghyee’ and ‘Pragana’). The results of cluster analysis showed that the three octaploid strawberry cultivars were quite similar, whereas the diploid ‘Pragana’ was related distantly at the genomic DNA level. The EST-SSR markers developed in the present study can be efficiently utilized for genetic diversity studies in Rosaceae.     

EST-SSR标记在翦股颖上的通用性及遗传多样性研究

利用来自小麦、大麦、玉米、高粱、水稻的1 058 对EST-SSR 在翦股颖上进行扩增,得到有效扩增引物620 对（58.60%）。其中源于小麦、大麦、玉米、高粱、水稻的引物对数分别为313（61.49%）、30（63.83%）、101（51.53%）、11（35.48%）、165（60.00%）。进一步利用其中53 个引物对,对8 个翦股颖品种进行了遗传多样性分析。有51 对引物显示了多态性,占引物数的94.34%;共检测到368 个等位变异,平均每对引物有6.9 个等位变异;多态性信息指数（PIC）为0.49 ~ 0.93,平均为0.78;品种间遗传相似系数为0.48 ~ 0.86,平均为0.72。聚类分析结果表明,在相似系数0.75 处,8 个品种可明确的分为两大类,第Ⅰ类为高地;第Ⅱ类又可分为两个亚类,Ⅱ-1 亚类由阿尔法、潘克劳斯、回旋组成,Ⅱ-2 亚类由普特、L-93、开拓、A4 组成。     

甜瓜EST-SSR位点信息及标记开发

 对GenBank中35 547条甜瓜EST进行净化处理, 得到总长度为2.5 ×10⁷ bp 的无冗余EST34 408条。从这些序列中发现2 877 个SSR, 分布于2 119 条EST中, 出现频率为8.36% , 分布密度为1/8.72 kb。单碱基、二碱基和三碱基重复是主导重复类型, 分别占EST2SSR总数的16.61%、22.49%和46.09%。A /T、AG/CT和AAG/CTT分别是单碱基、二碱基和三碱基的优势重复基元, 分别占15.88%、16.02%和28.61%。在所有的EST-SSR中, 69.10%的重复次数为4～10次, 51.34%的长度为12～20 bp。设计了30对EST-SSR引物, 分别对33份甜瓜自交系进行了PCR扩增, 24对引物能够扩增出期望长度的条带, 22对引物产物表现多态性, 平均每对引物能检测到2.73个等位基因。这些引物能比较准确地将甜瓜材料聚为不同类别。24对引物中, 有19对、16对和15对分别在黄瓜、西瓜和葫芦中通用。以上结果说明, 从甜瓜EST中开发SSR标记是一条简便、可行的途径。     

郑抗系列无籽西瓜品种SSR指纹图谱的构建

为实现无籽西瓜品种的快速、准确鉴定,用23对西瓜核心SSR引物分析了15份无籽西瓜品种的DNA指纹。23对核心引物中有21对具多态性,共扩增出58个基因型,平均2.71个,平均多态性信息量(PIC)为0.36。10对引物在9个品种上具有特征谱带,组合PIC值0.4的8对引物可以将参试的15个无籽西瓜品种一一区分开,并利用这8对引物构建了参试品种的数字指纹图谱。研究表明,西瓜核心SSR引物适合用于构建无籽西瓜品种的DNA指纹,将为无籽西瓜品种真实性鉴定和知识产权保护提供有效的技术依据。     

秋甘蓝品种的SSR指纹图谱的构建

 为实现对甘蓝品种进行快速准确鉴定,利用SSR分子标记技术对目前广泛栽培的‘京丰一号’、‘晚丰’、‘中甘8号’、‘中甘18’、‘中甘19’和‘中甘22’等6个秋甘蓝品种及其亲本共18份材料构建指纹图谱。基于先前的甘蓝EST-SSR标记开发研究,选取26对多态性较好的甘蓝EST-SSR引物对其进行扩增分析,通过对这26对EST-SSR引物的电泳检测统计分析,利用BoE974、BoE916、BoE337、BoE316和BoE222等5对引物构建了这6个甘蓝杂交种及其亲本的指纹图谱,实现了这18份材料的分子鉴定。利用引物BoE222对一份‘京丰一号’的商品种子进行纯度鉴定,结果显示90粒种子为真杂种,9粒为假杂交种,种子纯度为90%。