SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测网状内皮增生症病毒方法的建立

根据禽网状内皮组织增生症病毒(REV)长末端重复序列LTR基因保守区域设计并合成一对引物,建立基于SYBR GreenI模式的实时荧光PCR方法(Real-timePCR)。以常规PCR产物为标准品建立标准曲线,并对方法的特异性、敏感性、可重复性以及再现性、检出率进行评价。结果表明,该方法只从REV阳性样本检出扩增信号,不与其它病原出现交叉反应;熔解温度为86.8±0.5℃,无引物二聚体;扩增产物片段大小为270bp,与预期大小相符,测序结果证实为REV靶序列;在1.01×102～1.01×109拷贝之间呈现良好的线性关系,相关系数为0.999,扩增效率为99.7%,最低可检测101拷贝/反应阳性标准品,比常规PCR敏感103倍;组内变异系数、组间变异系数分别为4.80%～5.72%、0.75%～3.87%;对16例临床疑似病例进行检测,阳性率为81.25%(13/16),随机抽取7份阳性扩增产物进行测序,证实为REV序列。本研究建立的SYBR GreenI实时荧光PCR特异性强、通量高、灵敏度高、检测速度快,为REV的快速检测、分子流行病学调查以及监测REV污染疫苗情况提供新方法。     

SYBR GreenⅠ实时荧光PCR法检测禽活疫苗中禽网状内皮组织增生症病毒

为快速、准确检测禽活疫苗中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV),根据REV p30基因上的一段保守序列,利用Primer Premier 5.0软件设计合成了1对特异性引物,建立了基于SYBR Green I模式的实时荧光PCR方法,并以常规PCR产物为标准品绘制了标准曲线,对方法的特异性、敏感性、重复性、与经典方法的符合率进行了评价。结果表明:扩增产物片段大小为222 bp,与预期片段大小相符,测序结果证实为REV靶序列;标准曲线具有良好的线性关系,相关系数为1.0,扩增效率为94.2%,溶解温度Tm=(86.0±0.50)℃,无引物二聚体;该方法只从REV阳性样本检出扩增信号,其他病原无扩增信号,特异性好;最低可检测26.97拷贝数的阳性标准品,比常规PCR敏感1000倍;组内变异系数、组间变异系数分别为0.79%~5.36%,1.61%~5.25%。运用建立的实时荧光PCR方法对17批禽用活疫苗进行检测,并与间接免疫荧光法(IFA)进行同步比较试验,结果两者符合率为100%。且实时荧光PCR法更快捷、更方便,结果判定更为直观可用于疫苗中REV污染情况的监测。     

双重PCR检测禽源生物制品中禽网状内皮组织增生症病毒和禽白血病病毒

为了快速、准确检测禽源生物制品中的禽网状内皮组织增生症病毒(REV)和禽白血病病毒(ALV),根据GenBank中登录的REV参考毒株LTR基因序列和ALV P27基因序列,设计合成2对特异性引物。在建立各病毒单项PCR检测技术的基础上,优化反应条件,建立2种病毒的双重PCR检测方法。结果:可同时扩增REV的467 bp和ALV的675 bp的特异性片段,而对其他5种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该双重PCR技术能检出10 pg的ALV和10 pg的REV模板。用双重PCR技术与REV的间接免疫荧光法及ALV ELISA对245份疫苗株检测,进行同步比较,结果总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,对这2种外源病毒的同时检测,显示出了较好的可行性。     

鸭呼肠孤病毒TaqMan与SYBR Green荧光定量检测方法的建立及比较

本研究旨在针对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)建立两种快速、敏感、特异的荧光定量PCR诊断方法并对其临床实用性进行比较.试验根据呼肠孤病毒S1基因序列设计合成1对特异性引物和1条MGB探针,分别建立TaqMan和SYBR GreenI两种荧光定量PCR检测方法,并对两种方法的特异性、灵敏性、重复性进行比较.结果 显示,两种...     

羊口疮病毒SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR法的建立

为建立快速、灵敏、特异的检测羊口疮病毒(ORFV)的方法,基于羊口疮病毒保守序列B2L基因合成一对用于建立SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR的特异性引物,将ORFV B2L全长基因和pMD19-T质粒载体连接,构建重组阳性质粒,以构建的重组质粒DNA作为模板,建立ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR检测方法。结果显示:所建立的ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法线性关系良好,重复性好,扩增效率高,无引物二聚体和非特异性扩增,最低检测限为2.13×101copies/μL,比普通PCR高出1 000倍,该方法对绵羊羊痘病毒和山羊痘病毒的核酸cDNA不检出,特异性好;对180份山羊全血样本进行ORFV检测,结果得出常规PCR阳性检出率为2.8%(5/180),荧光定量PCR阳性检出率为4.4%(8/180)。试验表明,本次建立的ORFV SYBR Green Ⅰ实时荧光定量PCR方法特异性强、敏感度高、重复性好,适用于羊口疮病毒临床样本的检测。     

禽呼肠孤病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立禽呼肠孤病毒(ARV)快速、敏感的检测方法。本研究利用RT-PCR技术扩增出ARV S1基因中298bp的保守序列,并克隆到p MD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了ARV的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达4.8×101拷贝,与NDV、AIV、IBV、IBDV、ALV、REV均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床ARV的检测。     

鸡传染性贫血病毒SYBR Green Ⅰ法荧光定量PCR检测方法的建立及其在疫苗污染检测中的应用

为了更快速而灵敏地检测禽弱毒疫苗中可能存在的鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)污染,根据CIAV基因组保守区域VP2部分基因设计和合成了1对特异性引物,通过优化反应条件建立了快速检测CIAV的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR方法。结果显示,建立的检测方法灵敏度可达6.36 copies/μL,是常规PCR灵敏度的1000倍。该方法与禽网状内皮组织增生病病毒(Reticuloendotheliosis virus,REV)、禽白血病病毒(Avian leukemia virus,ALV)、鸡马立克氏病病毒(Mareks disease virus,MDV)等均无交叉反应,特异性良好;批内和批间重复试验显示变异系数均小于2.5%,呈现良好的可重复性。在模拟试验中,建立的SYBR Green I荧光定量PCR能够检测到1000羽份弱毒疫苗中1个EID50的低剂量污染,应用该方法从送检的14种(批)商品化禽用弱毒疫苗中检测到2份为CIAV阳性,阳性样品按照经典的SPF鸡检查法进行检测也为CIAV阳性。因此,本研究建立的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法灵敏度高,特异性强,重复性好,适合用于疫苗中CIAV污染的检验。     

一种新型鸭呼肠孤病毒SYBR GreenⅡ荧光定量PCR方法的建立

该研究旨在建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,NDRV)的荧光定量PCR诊断方法。本实验以感染新型鸭呼肠孤病毒的鸭组织RNA提取物为模板,根据Gen Bank数据库中呼肠孤病毒S1基因全序列,设计合成了一对特异性引物,PCR扩增基因片段,将其克隆至p ET-30a载体,重组质粒测序并进行同源性分析;以阳性质粒为模板,建立SYBR Green II荧光定量PCR检测方法,并进行敏感性和特异性检测。经测序证实扩增片段与预期目的片段相符,所建立的SYBR Green II荧光定量PCR检测S1的反应在101~108 copies/u L之间具有良好的线性关系,反应的检出下限为10 copies/μL,而H5型禽流感病毒、H9型禽流感病毒、鸡传染性支气管炎病毒、C型鸭肝炎病毒、新城疫病毒、鹅细小病毒、鸭瘟病毒等病毒的检测为阴性,表明该方法敏感、特异。本研究成功建立了SYBR Green II荧光定量PCR检测新型鸭呼肠孤病毒的方法,为新型鸭呼肠孤病毒致病机制和机体免疫保护机制的研究提供了技术平台。     

SYBR Green Ⅰ实时荧光PCR检测鉴定狮制品

为建立SYBR Green I实时荧光PCR检测鉴定狮（Panthera Leo）制品的方法,本文在豹属动物线粒体细胞色素b基因上设计狮特异性引物,建立并优化了SYBR Green I实时荧光PCR检测鉴定体系,采用17种血液、组织和骨粉类样品的DNA,通过扩增曲线和融解曲线分析检测的特异性和灵敏度,并用狮肉粉和牛肉骨粉系列百分比混合物进行抗干扰能力分析。结果显示,狮血液和组织DNA样品均出现特异性的实时扩增曲线,平均熔解温度在84±0.2℃。虎、豹、熊等14种哺乳动物DNA样本的检测结果均为阴性。灵敏度检测显示,本实验所建立的SYBRGreen I实时荧光PCR方法能够检测出10 pg/μL的狮组分DNA。抗干扰能力显示在骨粉中狮的成分最低检出含量为0.1%。这些结果说明,本文建立的SYBR Green I实时定量PCR方法具有方便、经济、灵敏度高和重复好等特性,可用于狮源性制品的检测鉴定。     

禽网状内皮组织增生病病毒套式PCR检测方法的建立

根据GenBank中登录的禽网状内皮组织增生病病毒(REV)基因组序列,设计合成了2对引物,外部引物的扩增片段大小为467 bp,内部引物的扩增片段大小为314 bp,建立了适合REV快速检测的套式PCR方法。采用该方法对REV毒株进行了检测,结果显示能扩增到314 bp的条带;禽流感病毒(H9亚型)、新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、减蛋综合征病毒、禽白血病病毒、禽呼肠孤病毒、马立克氏病病毒的扩增结果均为阴性。该方法第1次扩增的敏感性是100 pg,第2次扩增的敏感性是1 fg,第2次比第1次扩增的敏感性高105倍。所建立的套式PCR方法具有敏感性高、重复性好、特异性强等优点,可用于禽网状内皮组织增生病的临床诊断和分子流行病学调查。     

鸡痘病毒活疫苗污染禽网状内皮组织 增生症病毒的间接免疫荧光法检测研究

通过向无外源病毒污染的鸡痘病毒活疫苗中添加不同剂量的禽网状内皮组织增生症病毒(REV),然后用间接免疫荧光法(IFA)进行检测,确定了该IFA方法的最低检出量为每500羽份疫苗中污染20 TCID_(50)的REV。使用该方法对国内16家企业生产的60批鸡痘病毒活疫苗进行了检验,结果显示2个企业生产的4批疫苗REV检测为阳性。随机选取5批IFA检测阴性样品和4批IFA检测阳性样品,按鸡检查法进行外源病毒检验,结果两种方法对REV污染的检测结果的符合率为100%。     

Monoclonal-antibody-mediated enzyme-linked immunosorbent assay for detection of reticuloendotheliosis viruses

An enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) is described for the detection of reticuloendotheliosis viruses (REVs). The assay uses a mixture of monoclonal antibodies (MCAs) prepared against a 62-kilodalton REV envelope glycoprotein (gp62) to capture antigen, rabbit anti-REV serum as detection antibody, and peroxidase-conjugated anti-rabbit IgG as indicator antibody. The MCAs were reactive with REV strain T, chick syncytial virus, and duck infectious anemia virus but unreactive against Marek's disease and avian leukosis viruses. The ELISA was compared with complement fixation test and REV immunofluorescent assay of infected fibroblasts, plasmas, and egg albumen from infected chickens. The lower limit of gp62 detection was about 120 ng of REV protein. Limit dilution of infectious REV was detected after 7-8 days of cultivation of infected fibroblasts.     

ARV、REV与ALV三重RT-PCR检测方法的建立

根椐GenBank中已发表的禽呼肠孤病毒（ARV）、禽网状内皮增生病病毒（REV）、禽白血病病毒（ALV）等3种病毒基因组序列,设计了3对分别与ARV、REV和ALV某段基因序列互补的引物。在建立各病毒单项RT-PCR技术的基础上,优化三重RT-PCR反应条件,建立了3种病毒的三重RT-PCR技术。结果表明,用这3对引物对同一样品中的ARV、REV、ALV核酸模板进行三重RT-PCR扩增,可同时扩增ARV的247bp,ALV的675bp,REV的467bp的特异性片段,而对其他6种禽病病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,该三重RT-PCR技术能检出10pg的ALV、1pg的ARV和10pg的REV模板。用42份临床病料对本研究多重RT-PCR技术和单项RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为92%以上。表明建立的多重RT-PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这3种病毒的同时检测和鉴别诊断。     

商品肉鸡群中MDV、REV、CAV和ARV多重感染的检测

从山东省东营、日照、潍坊、聊城等地区自然发病和临床健康AA商品肉鸡群中分别采集脏器样品,用特异性核酸探针对样品进行马立克氏病病毒（Marek’s disease virus,MDV）、网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis virus,REV）、鸡传染性贫血病病毒（Chicken anemia virus,CAV）和禽呼肠孤病毒（Avian reoviruses,ARV）检测。结果显示,自然发病AA商品肉鸡群中MDV、REV、CAV和ARV的检出率均较高,分别为69．30％、57．46％、63．60％和67．11％;临床健康AA商品肉鸡群中MDV、REV、CAV的检出率分别为36．96％、43．48％和30．42％,且自然发病和健康鸡群中均存在不同病毒组合的多重感染,感染率分别为85．96％和43．46％。用x2检验进行分析发现,自然发病商品肉鸡群与临床健康商品肉鸡群中MDV、CAV、MDV＋REV、REV＋CAV的检出率和未检出的比例差异极显著（P〈0．01）;REV、MDV＋CAV检出率差异显著（P〈0．05）。对自然发病商品肉鸡的肝脏、脾脏、法氏囊中4种病毒检出率进行X2检验分析发现,MDV在脾脏中检出率显著高于肝脏和法氏囊;REV在法氏囊中检出率显著高于肝脏和脾脏,而CAV和ARV分别在脾脏和肝脏中检出率较高。结果表明,多种免疫抑制性病毒的共感染已普遍存在,是目前AA商品肉鸡易发病且生长缓慢的重要流行病学因素之一。     

禽网状内皮组织增生症病毒单抗制备及在外源病毒检测中的应用

为了建立外源病毒检验用间接免疫荧光染色方法,本研究将禽网状内皮组织增生症病毒囊膜蛋白gp90(SU)的基因合成后连接至原核表达载体中进行表达,获得REV-SU蛋白,通过Ni柱亲和层析获得纯化的重组蛋白,免疫BALB/C小鼠,应用杂交瘤技术获得1株分泌特异性抗REV SU蛋白的单克隆抗体杂交瘤细胞系(2A2株),该细胞株制备的腹水与不同REV毒株具有良好的反应性,荧光效价可达1：51200,与不同ALV毒株和其他常见禽的病原均没有交叉反应,特异性良好。采用该细胞株分泌的单克隆抗体建立的间接免疫荧光染色法能检出至少5个TCID50REV病毒感染量,与多克隆抗体作为检测一抗具有同等的效力,且检测背景更加纯净,适用于外源性REV病毒检验。     

鸡胚中人工感染网状内皮增殖病病毒的检测

为了模仿禽网状内皮增生病毒(REV)垂直感染鸡胚,在1和3日龄的发育SPF鸡胚人工接种不同剂量的REV,并继续孵化至12日龄.在将发育鸡胚制成成纤维细胞单层后,再用抗REV单克隆抗体11B118作间接荧光抗体反应检测REV.结果表明,从所有人工感染REV的鸡胚12日龄制备的成纤维细胞中均能在培养48h检测出REV.该方法可用于检测生产弱毒疫苗的SPF鸡胚及其相应细胞有无REV的污染.     

Enzootic reticuloendotheliosis in the endangered Attwater's and greater prairie chickens

Reticuloendotheliosis (RE) in captive greater prairie chickens (GPC, Tympanuchus cupido pinnatus) and Attwater's prairie chickens (APC, Tympanuchus cupido attwateri) was first reported in 1998. RE is caused by avian reticuloendotheliosis virus (REV), an oncogenic and immunosuppressive retrovirus infecting multiple species of wild and domestic birds. During August 2004 through May 2006 a captive population of prairie chickens was affected simultaneously with a neoplastic condition and also avian pox, the latter being detected in 7.4% (2 of 27) of all birds submitted for histopathology. A survey for REV was conducted in order to examine its possible role in mortality observed primarily in juvenile and adult specimens of prairie chickens. The investigative procedures included postmortem examinations, histopathology, molecular detection, and virus isolation. In total, 57 Attwater's prairie chickens and two greater prairie chickens were included in the study. REV infection was diagnosed using virus isolation or polymerase chain reaction (PCR) or both in 59.5% (28 of 47) of blood samples and/or tumors from suspect birds. Lymphosarcomas were detected in the tissues of 37% (10 of 27) of the birds submitted for histopathology. Such lymphosarcomas suggestive of RE represented the most frequent morphologic diagnosis on histopathology among 27 separate submissions of naturally dead prairie chickens. Overall, REV was detected or RE diagnosed in 34 of 59 prairie chickens (57.62%). The average death age of all birds diagnosed with lymphosarcomas on histopathology was 2.2 yr, ranging from <1 to 4 yr. Although deaths associated with neoplasia occurred in males and females in equal proportions based on submissions, overall more males were diagnosed as REV infected or RE affected (16 males vs. 7 females, and 11 birds of undetermined gender). Reticuloendotheliosis virus was confirmed as a significant cause of mortality in captive prairie chickens.     

Reticuloendotheliosis virus integration in the fowl poxvirus genome: not a recent event

Integration of reticuloendotheliosis virus (REV) into the genome of fowl poxvirus (FPV) has been reported recently. With a view to determine whether this event had occurred in the past, we screened by polymerase chain reaction (PCR) for the presence of REV provirus in the DNAs of nine avian poxviruses, some of which had been lyophilized 50 yr ago. For REV, 5' long terminal repeat (LTR) and REV envelope sequences were amplified, whereas for FPV, the major envelope antigen gene and the region flanking REV sequences were amplified. In six of seven FPV strains examined, the specific PCR amplicons were obtained for both REV provirus and FPV sequences. One isolate in which presence of REV 5' LTR and envelope was not detected by PCR, a LTR remnant was detected by Southern hybridization. Interestingly, no REV sequence was detected in either canary poxvirus or pigeon poxvirus genome. These observations indicate that REV integration in the FPV genome is not a recent phenomenon but probably occurred prior to 1949.     

琼脂免疫扩散试验和间接免疫荧光染色法在禽网状内皮组织增殖病流行病学调查中的应用

应用琼脂免疫扩散试验和间接免疫荧光染色法检测鸡血清中抗ＲＥＶ抗体有很强的特异性,用以检测黑龙江、山东、辽宁、广东等地１７０３份鸡血清,阴性率分别为１４％和２３％,证明上述四省均有禽网状内皮组织增殖病病毒感染。     

鸡传染性贫血病毒与禽网状内皮增生症病毒二重PCR检测方法的建立

当前养鸡业中鸡传染性贫血病毒、禽网状内皮增生症病毒混合感染的发生率日益增高,为提高CIAV、REV检测效率,根据GenBank上登录的CIAV全基因序列和REV的LTR序列分别设计了2对引物,建立了REV、CIAV二重PCR检测方法,另外还比较了2种不同的DNA提取方法。结果显示,该方法扩增目的条带清晰、敏感性高、特异性好。应用建立的方法对临床7份病料样品检测,检出5份CIAV、REV阳性,表明建立的二重PCR方法能有效用于CIAV、REV混合感染的临床诊断。