水牛BMP1基因对颗粒细胞增殖与凋亡的功能研究

本研究旨在探讨BMP1基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖与凋亡的影响,采用qRT-PCR检测体外培养0、24、48、72和96h水牛颗粒细胞中BMP1基因的表达规律,通过在水牛颗粒细胞培养液中添加BMP1基因重组蛋白和抗BMP1抗体,观察其对体外培养水牛颗粒细胞增殖变化的影响,并应用qRT-PCR和Western blotting方法检测与细胞增殖和细胞凋亡相关因子表达的变化规律。结果显示,随着颗粒细胞体外培养时间的延长,BMP1基因的相对表达量显著上调(P0.05),96h培养组BMP1表达最高。添加BMP1重组蛋白可显著促进水牛颗粒细胞的体外增殖(P0.05),并能够显著上调细胞周期关键蛋白Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA mRNA表达水平(P0.05),同时显著抑制了细胞凋亡信号通路中促凋亡相关因子(Fas、FasL、TNFR1、TNF-α、Cytochrome C、Apaf1、Chop、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9)mRNA表达(P0.05)。Western blotting检测结果表明,BMP1重组蛋白能够抑制Fas、Bax和Caspase-9蛋白表达,蛋白与mRNA表达一致。而添加抗BMP1抗体的试验则得出相反的结果。综上表明,BMP1基因能通过调控相关基因的表达促进体外培养水牛颗粒细胞的增殖并抑制其凋亡,在水牛卵泡发生过程中具有重要的调控功能,为阐明BMP1基因参与家畜卵泡发生的分子机制奠定基础。     

圆弧青霉菌毒素—青霉酸对小鼠脾脏组织细胞凋亡和Bcl-2、Bax及Fas/FasL基因mRNA表达的影响

为探讨圆弧青霉菌毒素—青霉酸对小鼠脾脏组织的毒性作用,采用TUNEL法和RT-PCR对染毒后脾脏细胞凋亡和Bcl-2、Bax及Fas/FasL等凋亡相关基因mRNA表达的影响进行研究。结果表明,随着青霉酸染毒剂量的增加,脾脏组织中细胞凋亡数量逐渐增多。染青霉酸低剂量组脾脏组织中Bcl-2、Fas和FasL的表达增加,Bax表达下降,高剂量组和中剂量组中Bax、Fas和FasL表达增加,Bcl-2表达下降,说明青霉酸可能通过促使Bax、Fas/FasL表达增加和Bcl-2表达降低来诱导小鼠脾脏细胞的凋亡。     

玉米赤霉烯酮对雌性大鼠卵巢颗粒细胞凋亡相关蛋白Fas及FasL表达的影响

为了研究玉米赤霉烯酮(ZEA)对大鼠卵巢颗粒细胞Fas和FasL蛋白表达的影响。将36只8周龄雌性SD大鼠随机分为试验组和对照组,处理组腹腔注射5mg/kg ZEA玉米油溶液,对照组注射等剂量玉米油溶液。2组在注射后6、12、18、24、36、48h各处死3只,取出卵巢组织,4%多聚甲醛固定,免疫组化方法检测不同时间卵巢颗粒细胞Fas和FasL蛋白的表达情况。结果显示:试验组卵巢颗粒细胞Fas和FasL蛋白表达量均明显高于对照组(P<0.05),且随着时间的推进呈现动态变化。试验组Fas在各时间点表达量均显著高于对照组,且在18h时表达量最高,之后逐渐下降;试验组FasL表达量显著升高,在18和24h表达量显著上调。ZEA诱导大鼠卵巢颗粒细胞凋亡过程中,可能激活Fas和FasL相关的死亡受体信号通路。     

FOXO3基因过表达对鹅卵泡颗粒细胞凋亡和自噬相关基因mRNA表达水平的影响

本研究首先克隆鹅FOXO3基因编码区(CDS)序列,构建FOXO3基因的真核表达载体,然后将其转染至鹅卵泡颗粒细胞中,利用荧光定量PCR方法检测FOXO3基因对细胞凋亡和自噬相关基因mRNA表达水平的影响。结果显示,本研究成功克隆了鹅FOXO3基因CDS序列,并由此构建了真核表达载体pcDNA3.1-FOXO3。鹅卵泡颗粒细胞FOXO3基因过表达实验发现,过表达组凋亡相关基因Bax、Bcl-2、Caspase3、Fasl的mRNA表达水平较对照组均升高(P<0.05),而自噬相关基因LC3和Beclin1的mRNA表达水平较对照组均降低(P<0.05)。本研究结果表明,FOXO3基因可能影响鹅卵泡颗粒细胞中凋亡及自噬相关基因的表达,进而调控颗粒细胞的凋亡和自噬。     

湖羊PGR基因对卵泡颗粒细胞体外增殖与凋亡的影响

旨在探究孕酮受体(progesterone receptor,PGR)基因对湖羊卵泡颗粒细胞体外增殖与凋亡的影响。利用RT-PCR技术扩增和克隆获得PGR基因编码序列(CDS),通过生物信息学软件对其氨基酸序列及同源性进行比对;用所获得序列构建过表达载体和干扰siRNA,分别转染湖羊颗粒细胞,并用CCK8技术检测颗粒细胞的细胞活力;采用RT-qPCR和Western blot技术,检测细胞周期和凋亡的相关基因或蛋白表达水平。结果显示,羊PGR基因的CDS区全长2736 bp,编码911个氨基酸;与其他物种氨基酸序列的同源性为39.66%~95.44%。干扰PGR基因通过下调CDK4、Bcl-2和上调Caspas3、Caspase8、BAX基因mRNA的表达(P<0.05),进而抑制颗粒细胞的增殖,但对CyclinD1未产生影响(P>0.05);过表达PGR基因通过上调CDK4、CyclinD1、Bcl-2和下调Caspase3、Caspase8、BAX基因mRNA的表达(P<0.05),进而促进颗粒细胞的增殖;BAX蛋白表达变化与对应mRNA的表达趋势一致(P<0.05);过表达PGR基因显著上调PCNA基因表达,而干扰PGR基因则下调PCNA蛋白表达(P<0.05)。研究表明,PGR基因通过调控细胞周期和凋亡关键基因的表达,影响湖羊颗粒细胞的增殖与凋亡,进而调节湖羊卵泡发育。     

p38MAPK抑制剂SB202190对猪颗粒细胞活力的影响

p38MAPK是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated potein kinase,MAPK)家族成员,是细胞内重要的信号转导系统之一,对细胞的生长、分化、凋亡具有重要影响及作用。为探究p38MAPK信号对猪卵巢颗粒细胞增殖和凋亡的影响及其可能作用机制,研究以体外培养的猪卵巢颗粒细胞为模型,在培养液中分别添加浓度为0、1、10、20μmol/L的p38MAPK特异性抑制剂SB202190。以免疫细胞化学染色法鉴定体外培养猪卵巢颗粒细胞,通过CCK-8法检测其增殖活性,应用Annwxin V-FITC/PI及细胞周期试剂盒染色检测细胞凋亡及细胞周期状况,以实时定量PCR检测猪卵巢颗粒细胞中凋亡、周期相关基因的相对表达水平。结果表明,添加p38APK信号抑制剂SB202190可抑制体外培养猪卵巢颗粒细胞的增殖活性,20μmol/L处理组与其他组相比呈显著性差异(P0.05);20μmol/L SB202190添加处理未显著影响颗粒细胞的凋亡水平,而该浓度SB202190可将大部分细胞阻滞在G1/G0期,与对照组相比差异显著(P0.05);基因相对表达水平检测显示SB202190添加可抑制Fas、FasL、CDK-4的表达,而同时促进Bcl-2、Bax、P27的表达(P0.05),对Caspase-3的表达没显著影响(P0.05)。综上所述,SB202190通过调控猪卵巢颗粒细胞的周期来影响其增殖作用,但对其凋亡没有影响。     

INHA基因干扰对马关无角山羊卵巢颗粒细胞的影响

为了揭示INHA基因在马关无角山羊卵泡发育过程中的作用,为山羊多胎性状的研究提供理论依据,以高繁殖力地方品种--马关无角山羊的卵巢颗粒细胞为研究对象,采用siRNA技术,对卵巢颗粒细胞所分泌的糖蛋白激素基因INHA进行了干扰,Western blot法检验了干扰后INHA蛋白的表达量,Real-time PCR法检测了干扰后凋亡家族主要基因、主要生长因子及激素受体的mRNA表达量变化。Western blot结果显示,干扰48h后的INHA蛋白的表达量极显著低于正常组和阴性对照组(negative control,NC)(P0.01);Real-time PCR结果显示,凋亡促进基因Bax在转染后,表达量极显著低于正常组和NC组(P0.01),凋亡抑制基因bcl-2和bcl-xl基因在转染后,表达量极显著高于正常组和NC组(P0.01);主要生长因子IGF-1和IGF-2基因在转染后,mRNA的表达量明显减少(P0.01),其中IGF-1的表达量降低最为明显;激素受体FSHR和LHR基因mRNA的表达量极显著低于正常组和NC组(P0.01)。由此推测,INHA基因可能是通过影响卵巢颗粒细胞凋亡/增殖,进而影响了卵泡的发育。     

CRABP1过表达载体的构建及其对猪卵泡颗粒细胞凋亡的影响

本实验通过构建猪视黄酸结合蛋白1(Cellular Retinoic Acid-Binding Protein1,CRABP1)过表达载体并揭示其对猪卵泡颗粒细胞凋亡的效应。从猪卵巢组织中提取RNA,反转录获得cDNA样本,利用PCR克隆CRABP1基因,并使用T4连接酶将其连入pcDNA3.1载体,进一步转化到感受态细胞中,通过PCR、双酶切及测序鉴定后提取去内毒素质粒。随后将构建好的CRABP1过表达质粒转染猪卵泡颗粒细胞,利用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测其转染效率及其对凋亡相关基因的影响,再将CRABP1过表达质粒转染至猪颗粒细胞24 h后添加1 nmol/L全反式视黄酸(All-trans Retinoic Acid,ATRA),检测其凋亡相关基因的表达变化。结果显示:CRABP1扩增片段序列与参考序列一致,将CRABP1过表达质粒转染猪颗粒细胞24 h后,其CRABP1基因表达量极显著升高,说明CRABP1过表达载体构建成功;CRABP1过表达载体单独转染颗粒细胞后,其可促进猪颗粒细胞促凋亡基因Bax、Caspase-3和Fas的mRNA表达,并且CRABP1过表达可逆转ATRA对猪颗粒细胞的抑凋亡作用。结果表明猪CRABP1过表达载体构建成功,其可介导ATRA调控猪卵泡颗粒细胞凋亡。     

含CpG序列PRRSV ORF5基因真核表达质粒在小鼠的细胞免疫应答

为了提高猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)基因免疫的效果,构建含CpG基序和PRRSV ORF5的真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5.经酶切鉴定和序列测定,将重组质粒转染COS-7细胞,经间接免疫荧光试验证实CpG-pVAX1-ORF5可表达PRRSV GP5蛋白.免疫SPF小鼠,检测鼠的脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平.结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导小鼠产生针对PRRSV的细胞免疫.     

SMAD1基因对黔北麻羊卵巢颗粒细胞的影响及组织表达分析

旨在验证SMAD1基因在转录组测序中单羔组对多羔组上调的结果,并探究SMAD1基因对黔北麻羊产羔性状的影响。本试验选取健康、体重45 kg、4岁左右的单、多羔黔北麻羊母羊为研究对象,采用qRT-PCR法检测SMAD1基因在单、多羔组黔北麻羊母羊子宫、输卵管、垂体、下丘脑及卵巢组织的表达水平,PCR扩增黔北麻羊SMAD1基因CDS区,构建pEGFP-N3-SAMD1重组质粒,利用脂质体转染法转染pEGFP-N3-SAMD1重组质粒进入卵巢颗粒细胞,分为超表达SMAD1试验组和pEGFP-N3空载体对照组,通过检测培养基中雌二醇和孕酮的浓度,利用CCK-8法和Annexin V-FITC法检测超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖、凋亡的影响,qRT-PCR检测超表达SMAD1基因对SAMD1、GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3基因mRNA表达的影响,来探究SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的影响。结果表明,SMAD1基因在黔北麻羊各组织中均有表达。组间比较可知,卵巢和下丘脑组织单羔组极显著高表达于多羔组(P0.01),输卵管组织中单羔组显著高表达于多羔组(P0.05),其他组织未达到差异显著性(P0.05)。本研究成功克隆了SMAD1基因CDS序列,未发现突变位点,并将pEGFP-N3-SAMD1重组质粒转染进入卵巢颗粒细胞,转染试验组培养基中E2含量在12、48 h显著高于对照组(P0.05),P4含量在12 h显著高于对照组(P0.05);超表达SMAD1基因对细胞增殖在24 h达到显著促进作用(P0.05),48、72 h达到极显著促进作用(P0.01),并且发现超表达SMAD1基因对卵巢颗粒细胞的凋亡具有抑制作用,与SMAD1基因对卵巢颗粒细胞增殖具有促进的结果是相符的。SMAD1基因超表达后繁殖相关基因GnRHR、FSHR、BMP4、TIMP3 mRNA的表达极显著降低(P0.01)。综上表明,SMAD1基因超表达可提高E2、P4的生成,有助于黔北麻羊发情及妊娠的维持,促进细胞增殖,抑制细胞凋亡,也极显著抑制繁殖相关基因mRNA的表达,而这些繁殖相关基因都能够调控卵泡数、卵泡的发育与形成以及排卵。因此,SMAD1基因能够抑制这些基因的表达,致使黔北麻羊单羔组受胎率低,进而降低产羔数,这为产羔性状相关基因的研究提供了理论基础,初步认为SMAD1基因可作为探究影响山羊产羔性状的候选基因。     

RNA干扰INHα基因对绵羊颗粒细胞周期及凋亡相关基因表达的影响

旨在研究RNA干扰INHα基因对绵羊颗粒细胞周期及凋亡相关基因表达的影响,明确抑制素对绵羊颗粒细胞的局部调节作用,为今后提高动物的繁殖力奠定基础。选用1.0~1.5岁的小尾寒羊,从卵泡(3~7mm)中分离培养颗粒细胞,将siINHα和siNC(阴性对照)转染颗粒细胞,以未转染的细胞为空白对照(Control),利用脂质体介导法进行转染,荧光定量RT-PCR检测INHα基因的沉默效率、细胞周期和凋亡相关基因的变化,流式细胞仪检测细胞周期的分布变化。结果表明,siRNA转染绵羊颗粒细胞48h后,INHα基因的沉默效率达85%以上。与阴性对照相比,细胞周期相关基因Cyclin D1和CyclinB1mRNA的表达水平分别降低了0.2倍和0.7倍(P0.05),而p21的mRNA表达水平升高了0.9倍(P0.05);细胞凋亡通路中的促凋亡因子Bax、p53和Caspase3的mRNA表达量分别升高了1.8倍、3.6倍和0.4倍(P0.05),而抗凋亡因子Bcl-2mRNA表达量不受影响,阴性对照与空白对照差异不显著(P0.05)。与阴性对照相比,细胞周期的分布显著改变,干扰组G1细胞比例显著升高(P0.05),S期细胞比例显著降低(P0.05),而阴性对照与空白对照间无显著差异(P0.05)。综上表明,INHα作为绵羊颗粒细胞中关键的调控因子,通过调控绵羊颗粒细胞的生长和凋亡参与调控绵羊卵泡排卵的过程。     

Ghrelin对雌激素诱导小鼠胸腺萎缩过程中细胞因子及凋亡相关蛋白基因表达的影响

应用光镜和实时定量PCR技术研究了Ghrelin对雌激素诱导小鼠胸腺萎缩过程中胸腺形态学以及部分细胞因子和凋亡相关蛋白基因表达的影响。结果显示,注射Ghrelin后,雌激素诱导的小鼠萎缩胸腺在形态学上基本恢复到正常水平,胸腺中IL-6、TGF-[31、Caspase3、FADDmRNA含量显著降低,Caspase9、FasLmRNA含量略为下降,而IL-7、Bcl-2mRNA含量有所上升。结果表明,Ghrelin可能通过促进胸腺上皮细胞的增殖以及阻断Caspase级联程序和Fas／FasL凋亡信号通路抑制胸腺细胞的凋亡,从而逆转雌激素诱导的小鼠胸腺萎缩。     

氧化应激通过Fas/FasL信号通路调控奶牛子宫内膜细胞凋亡

胚胎早期死亡及流产严重影响母牛的繁殖性能,造成极大的经济损失。本研究利用不同浓度双氧水(H₂O₂)处理子宫内膜细胞6 h,通过流式细胞仪、酶标仪分别进行细胞内活性氧(ROS)水平、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性以及还原型谷胱甘肽(GSH)与氧化型谷胱甘肽(GSSG)比值检测,建立子宫内膜细胞氧化应激模型。在此基础上,利用流式细胞仪检测细胞凋亡和生长周期,利用荧光定量RT-PCR和Western blot检测Fas/FasL信号通路关键基因的mRNA和蛋白表达水平,并利用慢病毒介导的RNA干扰(RNAi)抑制子宫内膜细胞中Fas基因表达,进一步验证Fas/FasL凋亡通路是否参与氧化应激诱导的子宫内膜细胞凋亡。所有试验都重复3次以上。结果发现,利用200 μmol·L^-1 H₂O₂处理子宫内膜细胞6 h,细胞内ROS阳性水平急剧增加(P < 0.05),SOD和CAT活性以及GSH与GSSG比值都显著降低(P < 0.05),说明H₂O₂处理对子宫内膜细胞造成氧化应激损伤。在此处理条件下,生长周期中S期比例显著降低(P < 0.05),凋亡比例显著提高(P < 0.05);Fas/FasL凋亡通路中关键基因Fas、Caspase 8和Caspase 3的mRNA表达水平显著升高(P < 0.05);培养液中FasL浓度以及Fas、Caspase 8和Caspase 3蛋白表达水平显著升高(P < 0.05)。进一步研究发现,抑制Fas基因表达在一定程度上降低了氧化应激诱导的细胞凋亡比例以及Fas/FasL凋亡通路中关键基因的表达水平。总之,本研究结果表明,氧化应激通过激活Fas/FasL信号通路促进奶牛子宫内膜细胞凋亡,这为解释氧化应激对子宫内膜细胞的不利影响提供了新的见解。     

RNA干扰水牛MTPN基因对颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低MTPN基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖、凋亡及雌激素、孕酮分泌的影响。应用RNAi技术敲低颗粒细胞中MTPN基因的表达水平,通过实时荧光定量PCR方法检测体外培养水牛颗粒细胞中MTPN基因及增殖和周期相关基因的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖,借助流式细胞仪检测细胞周期的分布,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中雌激素与孕酮含量。结果显示,经siRNA(si-MTPN)转染颗粒细胞后,MTPN基因相对表达量下降60%(P0.01);细胞增殖受到显著抑制(P0.05),G1期细胞数量下降,S期细胞数量上升,G2期细胞数量极显著上升(P0.01),细胞被阻滞在G2期;增殖与周期相关基因Cyclin D2、Cytochrom C表达量显著上升(P0.05),Caspase9、Fas基因表达量极显著上升(P0.01);ELISA检测雌激素和孕酮分泌水平均显著下降(P0.05)。综上表明,敲低MTPN基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养水牛颗粒细胞的增殖及雌激素、孕酮的分泌水平,为阐明MTPN基因参与家畜卵泡发生的分子机制提供参考。     

低氧促进小鼠卵泡颗粒细胞凋亡

为研究低氧是否能促进小鼠卵泡颗粒细胞凋亡,将体外培养的小鼠卵泡颗粒细胞分成对照组和低氧处理组。对照组的细胞一直在常规的二氧化碳培养箱内培养,低氧处理组的细胞先在常规二氧化碳培养箱内培养一段时间后放入三气培养箱内(1%的氧气,5%的二氧化碳,94%的氮气)培养,一定时间后收集两组细胞样:用流式细胞仪结合Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡情况;用荧光定量PCR检测HIF1α及BNIP3基因在两组细胞中的mRNA转录水平;用TUNEL染色法检测两组细胞的DNA断裂情况;在小鼠颗粒细胞中过表达HIF1α,检测BNIP3基因的mRNA转录情况。结果表明:与对照组相比,低氧处理能够显著促进体外培养的小鼠卵泡颗粒细胞凋亡;低氧处理组HIF1α和BNIP3基因的mRNA转录水平显著高于对照组;低氧处理的小鼠卵泡颗粒细胞内有明显的核固缩现象,但DNA断裂多发生在胞质内;在小鼠颗粒细胞中过表达HIF1α能够引起BNIP3的mRNA转录水平升高。这些结果表明低氧处理能促进小鼠卵泡颗粒细胞的凋亡及细胞内HIF1α与BNIP3基因的表达量升高;由低氧处理后小鼠卵泡颗粒细胞内DNA断裂多发生在细胞质内,推测低氧引起小鼠颗粒细胞凋亡可能是通过线粒体凋亡途径实现的。     

玉米赤霉烯酮对体外培养猪卵巢颗粒细胞的影响

以原代培养的猪卵巢颗粒细胞为模型,设立玉米赤霉烯酮(ZEA)对照组(0.0 mg/L)及高(80.0 mg/L)、中(20.0,40.0mg/L)、低(0.2,2.0mg/L)剂量组,比较不同质量浓度ZEA对体外培养猪卵巢颗粒细胞的影响。形态学观察发现,随着ZEA质量浓度的增加,颗粒细胞呈散在生长,体积缩小变圆,数量减少;高剂量组(80.0mg/L)中,76.96%细胞均已脱壁死亡。MTT法表明,ZEA对卵巢颗粒细胞具有生长抑制作用;免疫荧光结果显示随ZEA质量浓度的增加,细胞凋亡率逐渐升高,高质量浓度组细胞增殖率仅为1.01%;Western blot检测结果显示经ZEA处理,Fas、FasL、FADD、Caspase-10的表达量均明显上调,且存在质量浓度-效应关系。结果表明,ZEA能诱导卵巢颗粒细胞凋亡,并显著上调Fas、FasL、FADD、Caspase-10的表达,可通过死亡受体通路介导卵巢颗粒细胞发生凋亡。     

肿瘤转移抑制因子(Kisspeptin)对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响

肿瘤转移抑制因子(Kisspeptin)在颗粒细胞上有表达,但其对颗粒细胞凋亡的作用尚不清楚,本试验旨在利用流式细胞术和荧光定量PCR的技术研究Kisspeptin对牛卵巢颗粒细胞凋亡的影响。向DMEM-F12培养液中分别添加0、100 nmol/L的Kp-10培养牛颗粒细胞,24 h后收集细胞,用流式细胞技术检测细胞凋亡和细胞周期,用荧光定量PCR技术检测Caspase-3、Bcl-2、Fas和Fasl的m RNA表达。结果表明:Kisspeptin可显著促进牛颗粒细胞凋亡,且伴随着Caspase-3、Fas和Fasl m RNA表达上调及Bcl-2 m RNA表达下调(P0.01);流式细胞分析表明,Kisspeptin可使牛颗粒细胞在G1期增加、S期下降(P0.05)。研究结果说明,Kisspeptin可促进牛颗粒细胞凋亡,这一作用可能通过上调促凋亡基因Caspase-3、Fas、Fasl和下调抗凋亡基因Bcl-2的m RNA表达实现。     

干扰Sirt2表达对绵羊颗粒细胞增殖、凋亡及抗氧化能力的影响

Sirt2对雌性动物的生殖具有重要调节作用,实验旨在探讨小干扰RNA(siRNA)干扰颗粒细胞Sirt2表达后,对绵羊卵巢颗粒细胞增殖、凋亡及抗氧化能力的影响。首先利用免疫荧光染色检测FSHR以鉴定颗粒细胞纯度,qRT-PCR检测干扰效率,随后利用MTT法检测干扰Sirt2表达后对细胞增殖的影响,最后利用qRT-PCR检测凋亡相关基因Caspase-3、Bax、Bcl-2及抗氧化相关基因FoxO3a、SOD2、CAT、GPX4的表达,利用DCFH-DA探针检测活性氧(ROS)水平。结果显示:10 nmol/L si-Sirt2转染颗粒细胞24 h后能抑制Sirt2的表达(P0.05),且对细胞增殖无显著性影响;干扰Sirt2表达后可促进促凋亡基因Caspase3和Bax的表达(P0.05)、抑制抗凋亡基因Bcl-2的表达(P0.05),提高细胞内ROS水平并降低抗氧化相关基因FoxO3a、SOD2、CAT、GPX4的表达(P0.05)。因此,干扰绵羊颗粒细胞Sirt2表达不会影响细胞增殖,但会促进细胞凋亡并对细胞抗氧化能力产生不利影响。     

过表达和干扰GDF9基因对番鸭颗粒细胞凋亡和周期的影响

实验旨在探究生长分化因子9(Growth Differentiation Factor,GDF9)基因对番鸭颗粒细胞的影响，本研究构建了GDF9过表达载体（pEX-2-GDF9）以及干扰GDF9小RNA (siRNA-GDF9-530、siRNAGDF9-978、siRNA-GDF9-1320)，分别转染至原代番鸭颗粒细胞内，通过流式细胞术检测GDF9基因对细胞周期和凋亡的影响；荧光定量PCR技术检测转染后颗粒细胞周期和凋亡相关基因的表达量。结果显示，过表达GDF9基因将番鸭颗粒细胞阻滞在G0/G1期，S期细胞极显著减少，且Bax基因和Caspase-3基因表达量极显著（或显著）上调，说明过表达GDF9促进了颗粒细胞凋亡；干扰GDF9基因表达后，G0/G1期细胞极显著减少，S期细胞极显著增加，且CDK-2、Bcl-2、CCND1 mRNA极显著上调，CCNE1 mRNA显著上调。综上可知，GDF9基因表达促进颗粒细胞凋亡、抑制细胞周期进程。该结果可为番鸭的卵泡发育机制研究提供理论基础。     

卵泡抑制素与GFP融合基因疫苗pEGISI的构建及表达

为构建卵泡抑制素与绿色荧光蛋白(GFP)融合基因疫苗pEGISI,将pcISI中的乙肝表面抗原(HBsAg)S基因及插入S基因中的抑制素(INH)基因片段酶切回收;PCR扩增pcISI中INH基因片段,调整阅读框,一起融合到pEGFP-N1中EGFP基因的5'端,构建ISI-EGFP融合表达质粒pEGISI。酶切和测序鉴定表明,重组质粒pEGISI构建成功。将pEGISI转染293T细胞,16h后检测到绿色荧光,48h检测到强烈荧光,说明融合基因在293T细胞获得高表达;ELISA检测证实,表达产物ISI-EGFP融合蛋白具有INH的抗原抗体反应原性。质粒pEGISI的成功构建及表达为抑制素基因免疫的机理及安全性研究奠定了基础。