秦川牛PDHB基因重组腺病毒载体的构建与鉴定

[目的]旨在通过构建秦川牛丙酮酸脱氢酶β亚基(Pyruvate dehydrogenase β subunit,PDHB)基因的重组腺病毒载体,为研究PDHB基因在牛前体脂肪细胞分化过程中的功能做准备。[方法]根据牛PDHB基因mRNA序列(GenBank Accession No.NM_001035435)设计引物,克隆该基因的编码区(Coding Sequence, CDS)序列。测序验证后将其重组到穿梭载体pAdTrack-CMV上,经PmeⅠ线性化后,转化到含有pAdEasy-1腺病毒骨架载体的E. coli BJ5183感受态细胞中进行同源重组,以获得重组质粒pAd-PDHB。再将经PacⅠ酶切线性化的pAd-PDHB转染到HEK 293A细胞中,进行病毒包装并扩增高滴度病毒Ad-PDHB,绿色荧光蛋白(GFP)标记法测定病毒滴度。将高浓度的Ad-PDHB病毒感染牛肌内前体脂肪细胞,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测PDHB的表达量。[结果]经测序验证,本实验克隆获得的牛PDHB基因CDS与数据库GenBank收录的序列一致。将PDHB基因CDS与穿梭载体pAdTrack-CMV重组并转染HEK 293A细胞后成功获得了重组腺病毒Ad-PDHB,其滴度为1.66×10⁹ PFU.mL^-1。腺病毒Ad-PDHB侵染牛肌内前体脂肪细胞后,PDHB在mRNA的表达水平比对照组高25.5倍。[结论]成功克隆了秦川牛PDHB基因并构建了重组腺病毒质粒pAd-PDHB,并获得能够在牛肌内前体脂肪细胞中过表达PDHB基因的高滴度重组腺病毒Ad-PDHB。     

干扰Smad3促进山羊脂肪细胞分化

旨在克隆山羊Smad3的基础上,明确其组织和细胞表达谱,最终阐明干扰Smad3基因对山羊肌内和皮下脂肪细胞分化的影响。本研究选用5只体况良好的1周龄简州大耳羊,空腹24 h后屠宰并采集相应组织和细胞进行试验。利用RT-PCR技术克隆山羊Smad3基因cDNA区序列并进行生物信息学分析,利用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)技术检测Smad3基因的组织和细胞时序表达水平;并且合成靶向Smad3的siRNA,采用油红O染色从形态学上明确干扰Smad3对山羊前体脂肪细胞成脂分化的影响,利用qPCR检测干扰Smad3对脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、PPARγ、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF6、KLF7、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15以及Smads相关基因Smad2、Smad4、Smad7和TGF-β1基因mRNA表达水平的影响,探讨可能的作用机制。结果,获得山羊Smad3基因1 449 bp,其中CDS区序列为1 278 bp,编码425个氨基酸;Smad3在山羊各组织中具有广泛表达特性,且在肾脏中的表达水平最高(P0.01);Smad3均在山羊肌内和皮下两种脂肪细胞诱导分化的36 h表达量最低,极显著低于在未分化前体脂肪细胞中的表达丰度(P0.01);干扰Smad3后发现显著促进了山羊肌内和皮下脂肪细胞中脂滴的聚集,且脂肪细胞分化标志基因、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15的表达水平显著上升(P0.05),Pref-1的相对表达水平极显著下降(P0.01),同时干扰Smad3基因下调了Smad2、Smad4和Smad7基因的相对表达水平(P0.05)。研究结果指出,干扰Smad3促进山羊脂肪细胞分化,且可能通过调控脂肪细胞分化标志基因C/EBPα、C/EBPβ、LPL、SREBP1、AP2、Pref-1、KLF3、KLF4、KLF8、KLF9、KLF10和KLF15等及协同Smad2、Smad4和Smad7的表达来实现的。     

过表达FGF10促进山羊皮下前体脂肪细胞分化

本研究在构建山羊FGF10过表达腺病毒载体的基础上,阐明过表达FGF10基因对山羊皮下前体脂肪细胞分化的影响及可能的作用机制。本试验利用胶原酶消化法分离获得山羊皮下前体脂肪细胞,采用AdEasy腺病毒包装系统成功构建过表达腺病毒pAdTrack-CMV-FGF10,并感染细胞。采用油红O染色方法从形态学上观察FGF10对成脂分化的影响;利用qPCR技术检测脂肪细胞分化标志基因、脂代谢相关基因、成纤维细胞生长因子受体(fibroblast growth factor receptors,FGFRs)和Kruppel样因子家族(Kruppel like factors,KLFs)mRNA的相对表达变化。结果显示,在过表达FGF10后的第2天,皮下脂肪细胞中脂滴聚集显著多于对照组,C/EBPα、LPL、ACACA、FGFR1和FGFR3的相对表达水平极显著上调(P0.01),FASN和ATGL的相对表达水平分别出现显著上调(P0.05)和显著下调(P0.05),同时,过表达FGF10显著上调KLF家族成员KLF8-10、16和17基因mRNA相对表达水平(P0.05),显著下调KLF1、2、4和15基因的相对表达水平(P0.05)。结果表明,过表达FGF10基因可能通过调控C/EBPα、LPL、FASN、ACACA、ATGL和KLFs部分成员的表达促进山羊皮下前体脂肪细胞的分化及脂滴聚集,结果为进一步阐明其调控山羊不同部位脂肪沉积的分子机理提供重要的数据支撑。     

小窝蛋白-1在猪前体脂肪细胞分化中的作用及其机理

以体外培养1日龄猪皮下前体脂肪细胞为研究对象,通过脂质体LipofectamineTM2000介导小窝蛋白-1（Caveolin-1,CAV1）过表达载体pEGFP-N1-CAV1及CAV1的干扰片段siRNA-CAV1分别转染猪皮下前体脂肪细胞,采用RT-PCR定量分析转染后24、48、72、96h的CAV1mRNA表达量以及转染后72h脂肪细胞分化相关基因的mRNA表达量;其后又进行了CAV1过表达或干扰且诱导分化后甘油三脂含量以及脂肪细胞分化相关基因的mRNA表达量测定。结果显示,过表达CAV1基因上调前体脂肪细胞分化相关基因PPARγ、C/EBPβ、AP2、GPDH的表达量,干扰CAV1基因下调C/EBPβ、PPARγ、AP2、LPL、VLDLR的表达量;诱导分化后干扰组C/EBPβ、LPL、VLDLR的表达量仍显著降低,而甘油三脂含量检测结果说明过表达CAV1基因能促进脂肪细胞分化,提示CAV1可能通过C/EBPβ、LPL、VLDLR等基因影响猪前体脂肪细胞分化。     

Wnt10b对山羊前体脂肪细胞分化相关基因表达的影响

旨在利用RNA干扰技术,明确Wnt10b基因对山羊前体脂肪细胞分化的影响。设计合成山羊Wnt10b siRNA序列,利用胶原酶消化法获得山羊皮下和肌内前体脂肪细胞。利用有效的siRNA序列干扰山羊皮下和肌内前体脂肪细胞Wnt10b基因表达后,检测其对细胞分化及脂肪细胞分化标志基因表达的影响。结果表明,筛选获得有效的山羊Wnt10bsiRNA序列,转染山羊皮下和肌内前体脂肪细胞后,Wnt10b被显著干扰,其mRNA表达量分别下调63%(P0.01)和67%(P0.01);油红O染色结果显示,干扰Wnt10b基因可明显抑制山羊皮下和肌内脂肪细胞的脂滴积聚;且干扰Wnt10b基因后,在皮下前体脂肪细胞分化过程中C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和Pref1基因出现极显著下调(P0.01),LPL出现显著下调(P0.05);而在肌内前体脂肪细胞分化过程中,AP2和LPL基因出现极显著下调(P0.01),C/EBPβ出现显著下调(P0.05),Pref1出现极显著上调(P0.01)。本试验发现,Wnt10b基因可能通过调控C/EBPβ、PPARγ、SREBP1和LPL的表达来促进山羊皮下前体脂肪细胞分化,通过调控AP2、LPL、C/EBPβ和Pref1的表达来促进山羊肌内前体脂肪细胞分化。     

microRNA-425-5p对3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响

为了探究miR-425-5p对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响效应,本试验采用实时荧光定量PCR检测miR-425-5p组织和细胞表达水平;运用CCK8、EdU、油红染色、甘油三酯含量分析等分别检测miR-425-5p对前体脂肪细胞增殖、分化的影响;利用生物信息学软件和双荧光素酶报告试验分别预测、验证miR-425-5p调控前体脂肪细胞分化的靶基因。结果表明,miR-425-5p在肥胖小鼠脂肪组织中低表达,在前体脂肪细胞增殖、分化过程中动态表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可促进前体脂肪细胞增殖,抑制脂肪细胞分化标志基因(PPARγ、C/EBPα、FAS等)表达,减少脂滴和甘油三酯积累;抑制miR-425-5p表达可抑制前体脂肪细胞增殖,阻止前体脂肪细胞诱导分化。在前体脂肪细胞分化过程中,过表达或抑制miR-425-5p可分别抑制或促进IGF1基因表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可抑制IGF1基因3′-UTR荧光活性,而突变miR-425-5p种子序列与IGF1基因3′-UTR的绑定位点可解除该抑制效果。综上所述,miR-425-5p可促进3T3-L1前体脂肪细胞增殖,并可直接靶向IGF1负向调控其分化。     

过表达DGAT2基因对延边牛前体脂肪细胞分化的影响

【目的】探究二酰基甘油酰基转移酶2(DGAT2)对牛前体脂肪细胞分化的影响及其对脂质代谢相关信号通路的调控作用。【方法】利用ADV1穿梭质粒构建包含目的基因的重组穿梭质粒,将重组穿梭质粒与骨架质粒pGP-Ad-Pac载体共转染293A细胞,制得过表达腺病毒载体Ad-DGAT2,用Ad-DGAT2与Ad-NC(阴性对照组)感染牛前体脂肪细胞;用油酸诱导分化96 h后,利用油红O染色观察脂滴生成情况,并检测甘油三酯(TAG)和脂联素(ADP)含量;通过实时荧光定量PCR检测脂肪生成相关基因表达情况;最后对其进行转录组测序,筛选差异表达基因并进行GO功能注释和KEGG通路富集分析。【结果】过表达DGAT2基因可显著增加脂滴数量及TAG、ADP含量(P<0.05),可显著上调磷酸甘油途径DGAT1、甘油磷酸酰基转移酶4(GPAT4)、酰甘油磷酸酯酰基转移酶4(AGPAT4)以及脂质代谢途径中过氧化物酶体增殖活化受体γ(PPARγ)、脂肪分化相关蛋白(PLIN2)、CCAAT/增强子结合蛋白α(C/EBPα)和硬脂酰辅酶A去饱和酶(SCD)的mRNA表达水平(P<0.05)。转录组测...     

鸡KLF3基因的表达规律及其对脂肪细胞分化的影响研究

为研究鸡KLF3(Gallus gallus Krüppel-like factor 3,gKLF3)基因的表达规律及其对脂肪细胞分化的影响,利用qRT-PCR检测了其在肉鸡脂肪组织和脂肪细胞中的表达特点,并利用基因过表达技术研究gKLF3基因对脂肪细胞分化的影响。结果显示,gKLF3在2~10周龄肉鸡腹部脂肪组织中持续表达,10周龄高脂肉鸡腹部脂肪组织gKLF3表达量显著高于低脂肉鸡(P0.05);gKLF3在鸡成熟脂肪细胞的表达量低于前脂肪细胞(P0.01);体外培养的鸡前脂肪细胞经油酸诱导分化后,gKLF3基因表达量均有低于对照组的趋势;过表达gKLF3基因有抑制脂肪细胞分化,以及抑制C/EBPα、FAS基因表达(P0.01)的趋势。研究结果表明,gKLF3基因在鸡腹部脂肪组织生长发育过程中发挥重要作用,其可能是通过抑制C/EBPα、FAS基因表达进而抑制脂肪细胞分化实现的。     

秦川肉牛脂肪细胞PLIN2基因干扰siRNA筛选及过表达载体效率检测

试验旨在获得秦川牛肉用新品系（以下简称"秦川肉牛"）具有高干扰效率的脂肪细胞分化相关蛋白2（PLIN2）基因干扰siRNA及高过表达效率的基因超表达载体,为后续研究PLIN2基因在秦川肉牛脂肪细胞分化过程中的功能提供试验依据。通过采用siRNA介导的靶基因沉默技术合成靶向牛PLIN2 mRNA序列的si-PLIN2及构建真核pcDNA3.1（+）-PLIN2过表达载体,利用FuGENE6低毒性转染试剂配制转染复合物,转染秦川肉牛脂肪细胞并进行诱导分化。采用实时荧光定量PCR检测技术检测各试验组与对照组中PLIN2基因的相对表达量,并计算目的基因干扰及过表达效率;采用Western blotting方法检测蛋白水平的表达情况;采用BODIPY脂滴染色的方法观察表型。结果表明,转染秦川肉牛前体脂肪细胞后干扰组3对si-PLIN2（si-PLIN2_01、si-PLIN2_02和si-PLIN2_03）与对照组（si-PLIN2-NC）相比,PLIN2基因表达量下降（P<0.01）,干扰效率分别为71%、54%和50%;蛋白水平检测发现,si-PLIN2_01、si-PLIN2_03组蛋白水平表达与对照组（si-PLIN2-NC）相比出现下降趋势;脂滴染色后发现,干扰组与对照组相比,脂滴数目明显减少。过表达组pcDNA3.1（+）-PLIN2与对照组相比,PLIN2基因表达量显著上调,达35倍,脂滴数目明显增多。综上所述,siRNA介导的PLIN2基因沉默或pcDNA3.1（+）介导的体外表达载体均可以成功实现对PLIN2基因在秦川肉牛脂肪细胞分化过程中的干扰或超表达,并影响脂肪细胞分化过程中脂滴的形成数量。本研究为进一步探究PLIN2在秦川肉牛脂肪细胞分化过程中的功能奠定基础。     

Perilipin在牛脂肪细胞分化过程中的表达模式

本实验旨在对牛Perilipin家族蛋白进行生物信息学分析,预测各成员蛋白之间的互作关系并探究Perilipin基因在牛脂肪细胞分化过程中的表达模式.采用I型胶原酶消化法分离培养牛前体脂肪细胞,并对脂肪细胞进行油红O染色;qPCR检测Perilipin在牛脂肪细胞分化(0、2、4、6、10 d)过程中的相对表达量;并利...     

microRNA-425-5p对3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响

为了探究miR-425-5p对小鼠3T3-L1前体脂肪细胞增殖、分化的影响效应,本试验采用实时荧光定量PCR检测miR-425-5p组织和细胞表达水平;运用CCK8、EdU、油红染色、甘油三酯含量分析等分别检测miR-425-5p对前体脂肪细胞增殖、分化的影响;利用生物信息学软件和双荧光素酶报告试验分别预测、验证miR-425-5p调控前体脂肪细胞分化的靶基因。结果表明,miR-425-5p在肥胖小鼠脂肪组织中低表达,在前体脂肪细胞增殖、分化过程中动态表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可促进前体脂肪细胞增殖,抑制脂肪细胞分化标志基因(PPARγ、C/EBPα、FAS等)表达,减少脂滴和甘油三酯积累;抑制miR-425-5p表达可抑制前体脂肪细胞增殖,阻止前体脂肪细胞诱导分化。在前体脂肪细胞分化过程中,过表达或抑制miR-425-5p可分别抑制或促进IGF1基因表达;与阴性对照相比,过表达miR-425-5p可抑制IGF1基因3′-UTR荧光活性,而突变miR-425-5p种子序列与IGF1基因3′-UTR的绑定位点可解除该抑制效果。综上所述,miR-425-5p可促进3T3-L1前体脂肪细胞增殖,并可直接靶向IGF1负向调控其分化。     

草原红牛AIDA基因克隆、生物信息学分析及真核表达载体的构建

本研究旨在对草原红牛AIDA基因进行克隆、生物信息学分析和差异表达研究,并构建真核表达载体,以期在细胞水平上探究AIDA基因对牛前体脂肪细胞分化的影响。应用RT-PCR方法从草原红牛脂肪组织中扩增AIDA基因编码区,测序鉴定后对其核苷酸和氨基酸序列进行生物信息学分析,同时利用实时荧光定量PCR技术研究AIDA基因在草原红牛9个组织(心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、胃、肠、肌肉、脂肪)和前体脂肪细胞成脂分化过程中的表达规律;构建真核表达载体pBI-CMV3-AIDA,转染草原红牛前体脂肪细胞,通过实时荧光定量PCR方法检测AIDA基因在mRNA水平上的表达情况。结果显示,AIDA基因编码区全长921 bp,编码306个氨基酸,含有4个潜在的糖基化位点和29个潜在的磷酸化位点;亚细胞定位主要分布于细胞质、细胞核和线粒体上。AIDA基因在草原红牛9个组织中均有表达,其中在肾脏组织中表达量最高,显著高于其他组织(P0.05)。成脂分化结果表明,AIDA基因mRNA表达量在分化的第2天达到最高,随着脂肪细胞的成熟,其表达量逐渐降低;双酶切及测序结果表明,试验成功构建了AIDA基因的真核表达载体pBI-CMV3-AIDA,且过表达组AIDA基因mRNA表达量极显著高于对照组(P0.01)。本试验成功构建了AIDA基因真核表达载体,并在草原红牛前体脂肪细胞中高度表达,该结果为体外研究牛AIDA基因对脂肪合成代谢及其机体代谢的调节机制提供了基础材料。     

秦川牛ACTC1基因的表达特性分析

试验旨在揭示ACTC1基因在秦川牛中的时空表达规律,为进一步研究ACTC1基因在肉牛肌肉发育和脂肪沉积等方面的功能奠定基础。利用实时荧光定量PCR技术检测了ACTC1基因在24月龄成年秦川牛13种组织和4日龄新生秦川牛12种组织中的表达规律,同时研究分析了该基因在秦川牛成肌细胞和前体脂肪细胞不同分化阶段(0、2、4、6、8 d)的表达特性。结果显示,ACTC1基因在秦川牛心脏中的表达量最高,骨骼肌中次之;除瘤胃和肾脏外,24月龄成年牛各组织中的表达量显著或极显著高于4日龄新生牛(P0.05;P0.01);ACTC1基因在成肌细胞中的表达随着分化程度的增加呈现先升高后降低的趋势,在成肌细胞分化第2、4、6和8天ACTC1基因的表达量与第0天相比差异极显著(P0.01),分别是第0天的2.6、4.7、5.6和4.2倍,这与成肌细胞的分化速率一致;在脂肪细胞中ACTC1基因的表达趋势为先降后升,第2、4天的表达量与第0天相比差异极显著(P0.01),从分化第2天开始表达量随脂肪细胞分化程度增加而增加。ACTC1基因在不同年龄牛肌肉组织(心肌和骨骼肌)中的表达量最高,且其表达特性与肌细胞分化整体趋势一致;另外,ACTC1基因在脂肪细胞中的表达也有一定的规律。综上所述,推测ACTC1基因可能会影响牛肌肉组织的生长发育和脂肪沉积。     

miR-130b靶向PPARγ抑制家兔前体脂肪细胞分化

旨在探究miR-130b是否可通过靶向PPARγ抑制家兔前体脂肪细胞的分化。采集初生新西兰仔兔肾周脂肪细胞进行原代培养,鸡尾酒法诱导分化后,用RT-qPCR分别测定前体脂肪细胞分化第0、第2、第6、第10天miR-130b表达量及PPARγ(Peroxisome Proliferators-Activated Receptorγ,PPARγ)和C/EBPα(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)mRNA的表达量,生物信息学软件鉴定miR-130b的同源性,预测miR-130b的靶基因;前体脂肪细胞转染miR-130bmimic和miR-130binhibitor后,检测miR-130b、PPARγ和C/EBPα的表达差异,用油红O染色鉴定前体脂肪细胞分化程度。结果表明:1)在前体脂肪细胞分化过程中,miR-130b、PPARγ和C/EBPα表达量存在差异;分化第8天时,油红染色发现大量橘红色脂滴;生物信息学软件预测PPARγ可作为miR-130b的靶基因,且miR-130b在哺乳动物中具有较高的同源性。2)过表达miR-130b后,mimic组PPARγ和C/EBPα的表达量极显著低于NC组(P0.01)。3)抑制表达miR-130b后,inhibitor组PPARγ的表达量极显著高于inhibitor NC组(P0.01),inhibitor组C/EBPα表达量显著高于inhibitor NC组(P0.05)。4)油红O染色显示分化程度:inhibitor组NC组mimic组。综上所述,miR-130b在家兔前体脂肪细胞分化过程中差异表达,且可通过靶向PPARγ抑制前体脂肪细胞分化。     

柠檬苦素对牛前体脂肪细胞分化过程中核纤层蛋白基因表达的影响

核纤层位于核膜内侧,主要由核纤层蛋白构成,对细胞核起重要的机械支持作用。编码核纤层蛋白的基因突变能导致人类肌肉、脂肪等组织病变,统称为核纤层病。为了研究柠檬苦素对牛前体脂肪细胞分化过程中核纤层蛋白基因表达的影响,试验利用qRT-PCR技术分析了编码核纤层蛋白的LMNA、LMNB1和LMNB2基因在牛前体脂肪细胞诱导分化过程中的表达变化,同时在细胞培养基中添加柠檬苦素,以分析柠檬苦素对细胞分化和核纤层蛋白编码基因表达的影响。结果表明:在培养基中添加柠檬苦素能够有效抑制牛前体脂肪细胞向成熟脂肪细胞的分化,试验组细胞中脂质沉积量极显著低于对照组(P0.01)。LMNA基因在牛前体脂肪细胞中具有较高的表达水平,添加柠檬苦素的试验组LMNA基因表达水平有降低的趋势。试验组LMNB1和LMNB2基因表达量在诱导分化的第0.5天极显著低于对照组(P0.01),在诱导分化的10~12 d试验组LMNB1基因表达量显著高于对照组(P0.05)。LMNA、LMNB1和LMNB2基因在牛前体脂肪细胞诱导分化过程中具有相似的表达变化趋势,均在诱导分化开始的0.5~1 d表达量升高。说明柠檬苦素在牛前体脂肪细胞早期分化时具有抑制核纤层蛋白基因表达的作用,而在分化后期则能够促进核纤层蛋白基因表达。     

水牛miRNA-155重组腺病毒载体的构建及生物信息学分析

旨在利用Admax系统构建miRNA-155的腺病毒表达载体,获得含有miR-155的腺病毒颗粒,同时对miR-155的预测靶基因进行生物信息学分析,为研究水牛卵丘细胞中miRNA-155的功能奠定基础。根据GenBank中牛的序列,通过RT-PCR扩增得到pri-miRNA-155序列,并连接到腺病毒载体pDC316-mCMV-EGFP,测序并进行生物信息学分析。将pDC316-mCMV-EGFP-pri-miRNA-155与pBHGloxdelE13cre在HEK-293细胞中包装获得Ad-miRNA-155病毒颗粒,感染水牛卵丘细胞后,利用RT-qPCR技术检测miRNA-155及部分靶基因表达量。TargetScan网站预测获得miRNA-155的靶基因,并利用KOBAS 3.0对预测靶基因进行GO和KEGG富集分析。结果表明,成功构建腺病毒重组载体pDC316-mCMV-EGFP-pri-miRNA-155,水牛pre-miR-155与黄牛、马、家兔、原鸡、猕猴、狼、树鼩的同源性均达95%以上,且miR-155在进化过程中高度保守。Ad-miR-155感染水牛卵丘细胞后,miR-155的表达水平显著上升(P0.01),预测靶基因Wee1、CD44、TRPS1表达水平显著降低(P0.01)。最后对miR-155预测靶基因进行生物信息学分析发现,miR-155可能通过PI3K-AKT、mTOR及MAPK等信号通路作用于卵丘细胞进而调控水牛卵母细胞体外成熟。     

全反式视黄酸对3T3-L1前脂肪细胞分化及PPARγ和C/EBPα mRNA表达的影响

本研究旨在探讨全反式视黄酸(all trans retinoic acid,ATRA)对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响及其机制。培养3T3-L1前脂肪细胞,分别设置对照组以及10-9、10-8、10-7、10-6和10-5 mol/L ATRA的处理组,油红O染色观察3T3-L1前脂肪细胞分化的形态变化;油红O染色提取法分析不同浓度ATRA对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响;Real-time PCR技术检测脂肪细胞分化相关基因过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator activated receptor,PPARγ)、CCAAT/增强子结合蛋白α(CCAAT/enhancer binding proteinα,C/EBPα)mRNA水平的表达。结果表明:10-7、10-6和10-5 mol/L的ATRA抑制3T3-L1前体脂肪细胞的分化(P0.01),而10-9和10-8 mol/L的ATRA对3T3-L1前体脂肪细胞分化没有显著影响(P0.05)。10-5 mol/L的ATRA处理的前脂肪细胞,分化相关基因PPARγ和C/EBPαmRNA的表达减少,与空白对照组比较差异有统计学意义(P0.01)。结果显示,高浓度的ATRA可以抑制3T3-L1前脂肪细胞分化,减少脂肪细胞分化过程中脂质的堆积,机制可能与其抑制脂肪细胞分化相关基因PPARγ和C/EBPαmRNA表达有关。     

过表达circNMT1促进水牛脂肪细胞的成脂分化

旨在鉴定非编码RNA circNMT1,明确其组织和细胞的表达模式,以及探究过表达circNMT1对脂肪细胞分化的影响。本试验以30月龄中国沼泽水牛(信阳水牛,n=3)的心、肝、脾、肺、肾、背最长肌、背部皮下脂肪组织和前体脂肪细胞以及3T3-L1细胞为试验材料。通过半定量PCR和实时荧光定量PCR (real-time quantitative PCR,qRT-PCR)技术对circNMT1进行鉴定、细胞定位并明确其时空表达模式。进一步分别将其过表达到3T3-L1和水牛前体脂肪细胞中,利用形态学方法及定量方法检测过表达后脂滴累积情况,同时采用qRT-PCR检测脂肪标志基因相对表达水平的变化。结果表明,circNMT1是真实存在且稳定表达的circRNA,在水牛前体脂肪细胞的细胞核和细胞质中均表达,且在脂肪组织和成熟的脂肪细胞中高表达(P<0.001)。功能获得性试验表明,在3T3-L1细胞和水牛脂肪细胞,circNMT1显著促进脂肪细胞的脂滴积累,并且显著提高成脂标志基因PPARG、C/EBPα和FABP4的相对表达水平(P<0.01)。circNMT1可能是水牛脂肪细胞分化的正调控因子,这为circNMT1在水牛脂肪细胞中的调节作用提供了新见解。     

猪流感病毒NP基因重组复制缺陷型腺病毒的构建与表达

以含有猪流感病毒A/Swine/Guangdong/9/2005(H3N2)NP基因的重组质粒pMD18-NP为模板,利用带特定酶切位点的引物PCR扩增NP基因,将其亚克隆至质粒pIRES2-EGFP中,再次将含有NP及EGFP的基因片段克隆到腺病毒的穿梭质粒pDC315,构建重组穿梭质粒pDC315-NP-EGFP。利用脂质体转染法将穿梭质粒pDC315-NP-EGFP和腺病毒骨架质粒pBHGloxΔE1,E3Cre共转染HEK293细胞,基于腺病毒感染后形成的典型细胞病变及EGFP基因在细胞中的表达筛选到重组腺病毒rAd-NP-EGFP。经PCR和Western blotting鉴定,结果表明NP基因已被重组到腺病毒的基因组中,并能够伴随病毒的复制而表达,表达蛋白具有良好的生物学活性。重组腺病毒rAd-NP-EGFP经增殖、纯化后其TCID50可达1.26×1010/mL,为进一步研究该重组病毒的免疫原性奠定了基础。