盐胁迫下红花基因组DNA甲基化的MSAP分析

以红花幼苗为研究材料,经200mmol.L-1 NaCl溶液分别处理4、8、12h,以未经盐胁迫处理为对照(CK),对DNA甲基化变化特征进行MSAP(甲基化敏感扩增多态性)分析。选用13对选扩引物,共检测到3 140个基因位点。甲基化水平分析表明,CK,4、8、12h处理样本中总甲基化率分别为31.8%、27.1%、31.0%和31.3%。进一步对不同处理时间红花基因组DNA甲基化模式的变化特征进行分析表明,NaCl处理4h后DNA的去甲基化模式调整占优势,而处理8h及12h后DNA甲基化水平恢复到CK水平,甲基化及去甲基化模式调整基本一致。上述结果显示,盐胁迫条件下红花基因组DNA甲基化状态发生了一定变化,并且这种变化与盐胁迫程度相关,推测DNA甲基化修饰可能参与了红花的盐胁迫应答。     

水稻干旱胁迫诱导DNA甲基化时空变化特征分析

 【目的】研究水稻抗旱导入系DK106和旱敏感轮回亲本IR64苗期和分蘖期干旱胁迫前后DNA甲基化的变化情况,并比较分析叶片和根部DNA甲基化变化特征,探讨DNA甲基化在水稻干旱胁迫反应中的作用。【方法】用甲基化敏感扩增多态性技术（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）和高效液相层析（high performance liquid chromatography,HPLC）方法分析DNA甲基化变化情况;从聚丙烯酰胺凝胶回收甲基化多态性片段并克隆测序及序列比对。【结果】MSAP分析结果显示,水稻基因组中约有20%的CCGG位点发生了胞嘧啶甲基化;水分胁迫导致DNA甲基化平均水平明显增加,其中根部增加幅度尤为明显;DNA甲基化水平及状态变化在品种间存在差异,同时具有时期及组织特异性。对干旱胁迫特异诱导DNA甲基化片段序列分析结果表明,基因编码区和非编码区发生DNA甲基化的频率基本相同。【结论】干旱胁迫反应过程中DNA甲基化表现出一定时空特异性和品种特异性,且与品种抗旱性差异相关。     

河八王杂交种F1、BC1及其亲本DNA甲基化水平和模式变化

为分析河八王及后代基因组DNA甲基化水平和遗传模式变化,以河八王及其后代F_1和BC_1为材料,采用甲基化敏感扩增多态性技术(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)结合毛细管电泳技术(Capillary electrophoresis,CE)分析亲本及后代基因组DNA甲基化水平和遗传模式变化规律。结果表明:母本‘GT05-3256’的MSAP比率是59.6%,父本‘GXN1’则是60.5%,其杂交种F_1的MSAP比率是56.4%～59.0%,均低于双亲;BC_1的母本‘YC94-46’的MSAP比率是59.4%,父本‘T6-3’则是59.0%,BC_1MSAP比率是56.9%～69.8%,整体平均为62.8%,平均值高于双亲。BC_1世代总甲基化水平略高于F_1世代水平。F_1和BC_1基因组CCGG位点发生甲基化的方式整体上以内部胞嘧啶双链甲基化为主。在F_1和BC_1中均检测到70种甲基化类型,并进一步分为A、B、C、D和E等5大类,其中A类是亲本向杂交种的甲基化遗传类型;B类是去甲基化类型,表示杂交种相应于其亲本的甲基化减弱;C类是过或超甲基化类型,表示杂交种相应于其亲本的甲基化增强;D类是次甲基化类型,杂交后代甲基化水平比双亲均要低;E类为不定类型。结果显示,B、C、D、E是杂交种的甲基化变异类型;F_1的甲基化遗传类型(A类)比例明显低于BC_1,但变异类型B、C、D、E高于BC_1;杂交形成F_1和BC_1过程中,基因组DNA普遍发生了超甲基化修饰。     

冷驯化草莓组培苗DNA甲基化水平及模式的变化

DNA甲基化是植物表观遗传的重要方式之一,非生物胁迫会引起植物DNA甲基化水平及模式的改变。为探讨草莓的低温响应与DNA甲基化的关系,本文以章姬组培苗为材料,利用甲基化敏感多态性技术(MSAP)检测冷驯化(4℃)不同时间及恢复后的植株DNA甲基化水平及模式变化。结果表明,14对选择性引物在冷驯化过程中共检测出2499个基因位点;冷驯化过程中,DNA总甲基化水平整体呈下降趋势,0 d、1 d、3 d、5 d、7 d和10 d,基因组MSAP比率分别为27.17%、20.73%、25.77%、22.69%、22.69%和22.41%,恢复5 d后MSAP比率上升为26.05%;在DNA甲基化模式变化方面,有甲基化和去甲基化现象发生,且以去甲基化现象为主。回收、克隆并测序某些草莓基因组的甲基化修饰位点,分离得到5条存在甲基化修饰的基因组DNA序列。BLAST比对分析表明,在这些序列中都存在明显的"CCGG"二核苷酸成簇富集现象,与MSAP结果一致。     

干旱胁迫诱发的玉米DNA甲基化变异的研究

本实验以玉米品种B73和H99为实验材料,分别对其进行干旱胁迫处理(0天、5天、7天、9天、11天),用MSAP方法分析干旱胁迫条件下的玉米基因组DNA甲基化变化情况。结果表明,干旱胁迫下,玉米DNA甲基化修饰发生了明显的改变,包括甲基化水平变化和模式变化;B73与H99的甲基化变异程度存在差异,其中B73在处理7天时检测到的变异率最高,为32.48%,H99在处理9天后的变异率最高,为30.00%。本研究初步分析了玉米在干旱胁迫下所发生的表观遗传学变异的频率及其与玉米抗逆性之间可能存在的关系,为进一步研究植物抗干旱胁迫的机制和培育抗干旱玉米新品种提供理论依据。     

盐胁迫下盐穗木DNA甲基化程度与去甲基化酶基因(Ros1)表达的相关性研究

【目的】甲基化和去甲基化协同调控的DNA甲基化直接影响逆境胁迫相关基因的表达,植物的DNA去甲基化主要由去甲基化酶基因Ros1(Repressor of Silencing 1)介导的碱基切除修复实现。开展盐穗木(Halostachys caspica)DNA甲基化程度与HcRos1表达动态变化的分析,有助于阐明DNA甲基化应答盐胁迫的分子机制。【方法】利用qRT-PCR测定盐胁迫下盐穗木幼苗同化枝和根基因组DNA的甲基化程度,探讨DNA的甲基化程度与去甲基化酶基因HcRos1表达的相关性。【结果】在相同NaCl浓度胁迫不同时间下盐穗木同化枝和根中DNA甲基化程度呈现先升高后降低的趋势,盐穗木同化枝中的DNA甲基化程度大多高于根中的基因组甲基化程度,且均在24 h达到最高DNA甲基化程度。而在不同浓度NaCl胁迫处理24 h时,盐穗木同化枝和根中DNA甲基化程度也是先升高后降低的趋势,盐穗木同化枝中的基因组甲基化程度高于根中的基因组甲基化程度,且多在100 mmol/L达到最高DNA甲基化程度。HcRos1的基因表达量在低浓度NaCl胁迫下变化不大,但在700 mmol/L NaCl胁迫72 h时则显著升高。【结论】HcRos1表达量与DNA甲基化水平呈明显的负相关,盐胁迫能够提高HcRos1的表达,降低基因组DNA的甲基化程度,增强植物的耐盐性。     

NaCl胁迫下二倍体和同源四倍体西瓜幼苗DNA甲基化差异分析

【目的】研究二倍体和同源四倍体西瓜幼苗NaCl胁迫后形态学指标差异和DNA甲基化变化情况,分析不同倍性西瓜幼苗之间耐盐差异,结合形态学指标从表观遗传学角度解释二倍体和四倍体抗逆性差异机制。【方法】以3组不同倍性（二倍体、四倍体）西瓜幼苗为研究对象,待长至三叶一心时,用含有0、100、200、300和400 mmol·L^-1 NaCl的1/2 Hoagland营养液处理西瓜幼苗,NaCl处理8 d之后,鉴定西瓜幼苗受到的盐害指数,并运用甲基化敏感扩增多态性（methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP）技术,分析NaCl处理8 d之后二倍体和四倍体西瓜幼苗叶片基因组DNA甲基化水平和模式的变化。【结果】NaCl处理后,形态学指标比较发现,随着NaCl浓度的增加,三组西瓜幼苗的受伤害程度都随着增加,在不同的西瓜品种之间受伤害程度有差异,但是同一品种内同一NaCl浓度下,西瓜幼苗受伤害程度二倍体大于四倍体;从甲基化水平看,西瓜幼苗基因组DNA全甲基化率、半甲基化率、总甲基化率都随着NaCl浓度的增加而降低,同一NaCl浓度处理下甲基化率二倍体大于四倍体,二倍体和四倍体西瓜甲基化水平与其受伤害程度呈正相关;从甲基化模式来看,NaCl胁迫后DNA的去甲基化比率降低,超甲基化比率升高,并且其变化幅度是四倍体大于二倍体,不同倍性西瓜幼苗的甲基化模式与其受伤害程度呈负相关。【结论】NaCl胁迫后西瓜幼苗基因组DNA的甲基化状态发生了变化,并且这种变化与NaCl胁迫程度高度线性相关,西瓜幼苗通过降低甲基化率和降低去甲基化比率来应对NaCl胁迫,四倍体较二倍体有更低的甲基化比率和去甲基化比率,抗逆性四倍体强于二倍体。     

低温胁迫下水稻基因组DNA甲基化的MSAP分析

[目的]研究低温胁迫对水稻幼苗DNA甲基化水平及模式变化。[方法]以水稻幼苗为材料,利用66个不同的引物组合对来自对照(CK)、4℃低温胁迫1 d(T_1)、4℃低温胁迫2 d(T_2)、4℃低温胁迫3 d(T_3)和恢复2 d(T_4)的水稻DNA样品进行甲基化敏感扩增多态性(MSAP)分析,探讨低温胁迫和恢复后,DNA的甲基化水平及模式变化。[结果]甲基化水平分析表明,CK、T_1、T_2、T_3处理样本中总甲基化率分别为37.19%、33.79%、33.67%和32.67%。进一步分析表明低温胁迫处理导致水稻DNA总甲基化水平降低,然而恢复处理组(T_4)减缓了这种趋势。[结论]水稻基因组部分位点的甲基化可能参与了水稻对低温胁迫的响应。     

萝卜-芥蓝异源四倍体F4和F10世代DNA甲基化变异的MSAP分析

以人工合成的萝卜-芥蓝异源四倍体的F4和F10世代为材料,用MSAP法检测2种材料DNA甲基化变异情况,以期为远缘杂交后不同世代间基因组DNA甲基化遗传和变异规律提供实验依据。结果表明:F4代和F10代甲基化程度分别为30.61%和33.10%,共检测12种甲基化变异模式,可以分为5种类型,甲基化变异位点占所有甲基化位点的41.71%。用甲基化抑制剂5-氮胞苷处理F4代,F10代材料,检测到甲基化程度分别为20.67%和25.75%,F代比F代受到了更大冲击,说明不稳定世代对环境的影响更加敏感。     

水稻Osrdr1突变体全基因组CCGG位点甲基化的研究

DNA胞嘧啶甲基化变异调控植物基因组内功能基因表达和转座子转座活性,影响植物生长和发育的稳定性。RNA-dependent RNA polymerase 2(RDR2)基因参与RNA-directed DNA methylation(RdDM)途径指导合成CHH(H=G、T、A)甲基化,CHH甲基化在基因和转座子上表现不同,是目前DNA胞嘧啶甲基化的研究热点之一。拟南芥中RDR1基因与RDR2属于同一家族,最新研究结果证实,RDR1基因不仅可以指导CHH甲基化形成,并且其功能缺失会不同程度影响CG和CHG甲基化。前期研究工作表明,水稻中其同源基因OsRDR1功能缺失可在特异位点影响DNA胞嘧啶甲基化,但是否大规模影响全基因组DNA甲基化尚不明确。在此基础上,采用甲基化敏感多态性扩增(Methylation sensitive amplification polymorphism,MSAP)技术研究OsRDR1基因功能缺失突变体全基因组CCGG位点的甲基化情况。结果同野生型比较分析发现,OsRDR1基因功能缺失没有引起全基因组CCGG位点甲基化水平的显著变化,但一定程度产生CHG去甲基化变异。由于MSAP试验方法的局限性,关于Osrdr1突变体全基因组DNA胞嘧啶甲基化变异还需更深入研究论证。     

干旱胁迫和复水下不同薄壳山核桃品种的生长和光合特性

为研究干旱胁迫和复水下不同薄壳山核桃Carya illinoinensis品种水分状态和光合特性变化规律,以‘波尼’‘Pawnee’‘马罕’‘Mahan’‘斯图尔特’‘Stuart’‘莫汉克’‘Mohawk’‘金华’‘Jinhua’‘绍兴’‘Shaoxing’‘钟山25号’‘Zhongshan 25’为材料,测定光合参数、叶绿素质量分数、水分利用效率(EWU)等指标。结果表明:干旱胁迫抑制了不同薄壳山核桃品种株高、地径生长及生物量积累,一定程度上提高根冠比。随着干旱胁迫程度的加深,所有植株的净光合速率(Pn),气孔导度(Gs),蒸腾速率(Tr),叶片相对含水量(CRW)和叶绿素质量分数逐渐降低;水分利用效率逐渐升高,且在第17天时达到最高值。复水3 d后,不同品种薄壳山核桃各项指标均有不同程度的恢复,‘波尼’和‘马罕’恢复速率最快,其净光合速率分别恢复了76.1%和69.4%;复水8 d后,所有植株的各项指标基本恢复至或接近对照水平。不同薄壳山核桃品种耐旱性表现为‘马罕’‘波尼’‘绍兴’‘钟山25号’‘金华’‘斯图尔特’‘莫汉克’。     

干旱胁迫下复苏植物牛耳草基因组DNA甲基化分析

利用甲基化敏感扩增多态性(methylation sensitive amplified polymorphism,MSAP)技术,研究干旱复苏过程中,牛耳草叶片DNA甲基化水平及动态变化情况.5对引物对共扩增出376个CCGG位点,其中188个位点发生了甲基化或去甲基化变化.处理组总甲基化水平均高于对照组,且均以Ⅰ型CHG(半甲基化)位点为主,占约32.3%~40.2%.牛耳草干旱复苏过程DNA甲基化和去甲基化同时发生,但以去甲基化为主.此外,qRT-PCR技术检测Bh Dnmt2、Bh CMT2等DNA甲基化相关酶基因在干旱复苏过程中的表达,发现均有明显变化.综上,DNA甲基化参与了牛耳草的抗旱复苏过程,可能是通过甲基化/去甲基化调节基因表达,从而参与牛耳草的抗旱分子反应.     

春小麦对生殖生长期阶段性干旱与复水的光合生理响应

【目的】探究不同抗旱能力小麦品种对阶段性干旱及复水的光合及荧光生理响应.【方法】以春小麦品种‘西旱2号’和‘永良4号’为材料,采用盆栽法,花期控水,灌浆期复水,测定光合与荧光特性参数.【结果】干旱胁迫造成小麦叶片叶绿素含量、净光合速率(P_n)下降,气孔导度(G_s)、胞间CO_2浓度(C_i)减小.轻度干旱胁迫(田间持水量的55%～60%)复水后,2个品种光补偿点变低,饱和点增高;当中度干旱胁迫(田间持水量的45%～50%)复水后,‘西旱2号’光强利用范围较充分供水(田间持水量的70%～75%)CK增宽,‘永良4号’则变窄.PSⅡ实际光合效率(ΦPSⅡ)、表观光合电子传递速率(ETR)、光化学淬灭系数(qP)、最大荧光(F_m)、PSⅡ原初光能转化效率(F_v/F_m)下降,初始荧光(F_0)升高,且随胁迫程度的加深变化幅度增大,‘永良4号’较‘西旱2号’变化幅度更大,表现出‘西旱2号’的抗旱性优势.轻度干旱复水各指标均可恢复,部分表现出补偿效应,中度干旱胁迫复水后,‘西旱2号’的ΦPSⅡ、ETR、qP和F_m恢复至CK水平,而F_0和F_v/F_m未能恢复.‘永良4号’仅ETR和qP恢复至CK水平,而ΦPSⅡ、ETR、F_0和F_v/F_m均未能恢复.【结论】轻度干旱胁迫,复水后小麦品种荧光特性表现一定的补偿效应;中度干旱胁迫复水后,抗旱性强的品种基本可恢复正常水平,而抗旱性弱的品种由于缺水对光系统的严重损伤,使其难以恢复正常水平.     

火龙果组培苗DNA甲基化变化及应答赤霉素效应

以火龙果优良品种‘紫红龙’组培苗为试材,利用MSAP分子标记,探讨了棱数变异现象与DNA甲基化可能存在的联系,分析了培养时间及继代次数对组培苗DNA甲基化的影响;通过在培养基中添加0(对照)、1.5、3.0、4.5及6.0mg/L GA,处理5d后,检测DNA甲基化变化,阐述赤霉素对DNA甲基化变化的影响。结果显示:棱数变异与DNA甲基化水平变化并不存在相关性,而与少数位点的甲基化状态有关;随培养时间的延长和继代次数的增加,组培苗DNA甲基化水平呈现出升高的趋势;随GA质量浓度的增加,外胞嘧啶半甲基化水平呈先升高后降低的趋势,与内源GA含量变化趋势一致,而内胞嘧啶全甲基化水平呈先降低后升高的趋势;外源GA影响了内源GA的积累,与对照相比,DNA甲基化变异率分别提高3.6%、4.5%、3.1%和2.7%,表明火龙果组培苗DNA甲基化对低浓度GA敏感,而对高浓度GA敏感性降低。     

干旱及复水对‘红富士’苹果生长及果实品质和产量的影响

本文以多年生‘红富士’(Malus domestica Borkh.‘Red Fuji’)/M26为试材,设置正常灌溉、持续干旱和干旱不同天数后复水三组处理,探究不同程度干旱对‘红富士’生理生化特性的影响以及果实品质和产量随干旱时间延长的变化规律。结果表明:随干旱处理时间延长,叶片光合性能、叶绿素含量呈先升后降趋势;超氧化物歧化酶(SOD)活性及可溶性蛋白含量也表现出先升后降;过氧化物酶(POD)活性和脯氨酸(Pro)含量呈上升的趋势,以上指标在干旱胁迫60～70 d之间变化最剧烈;干旱胁迫引起植株产量下降,但轻度干旱胁迫有利于果实着色,使果实颜色更深,干旱20d后进行复水处理的植株其果实品质保持在较高水平。     

重金属铅镉对濒危植物中华水韭(Isoetes sinensis)DNA甲基化的影响

为研究古老植物对重金属胁迫的分子水平的响应,探究重金属对濒危植物DNA甲基化影响的特点,选择两种重金属Pb和Cd对濒危植物中华水韭进行胁迫处理,每种重金属设置3个处理浓度,胁迫处理至第28 d选取叶片,采用MSAP(甲基化敏感扩增多态性)技术测定DNA甲基化程度。试验结果表明:重金属铅和镉均能够对中华水韭DNA甲基化产生影响,甲基化总体水平基本一致(对照、Pb处理和Cd处理分别为46.96%、48.23%和48.1%),但全甲基化水平(Pb处理是28.34%,Cd处理是20.25%)均低于对照(33.91%),而半甲基化水平(Pb处理是19.89%,Cd处理是27.85%)均高于对照(13.04%)。甲基化增强的变化,以无甲基化或内外侧胞嘧啶半甲基化向内外侧胞嘧啶全甲基化变化的模式为主。去甲基化的变化,以内外侧胞嘧啶全甲基化向无甲基化或内侧胞嘧啶半甲基化或全甲基化变化的模式为主。铅和镉胁迫在导致中华水韭DNA甲基化增强所占比率方面几乎相等(39.04%和39.71%),而在去甲基化所占比率方面镉(46.86%)高于铅(33.92%)。     

高粱DNA甲基化变异的分子杂交验证

以2个高粱(Sorghum bicolor L.)亲本纯系及其F1杂交种为材料,利用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)方法,对DNA甲基化水平和模式的遗传和变异进行了研究.结果表明:亲本纯系的大部分胞嘧啶甲基化位点稳定遗传给其F1杂交种,但3.94%的位点表现出了变异,即未从亲本遗传给杂交种,并通过Southern杂交方法进一步验证了杂交种和纯系亲本间的DNA甲基化模式的遗传和变异.     

毛白杨MSAP体系优化及DNA甲基化的初步分析

首次利用MSAP技术开展毛白杨DNA甲基化研究。在优化选择性扩增体系的基础上,对毛白杨亲子代的CCGG位点甲基化相对水平、CCGG位点胞嘧啶甲基化模式的遗传变异进行了初步分析。结果表明:①引物H/M+3、引物E+A+2、dNTP、Taq酶、预扩增产物稀释倍数分别为0.03 nmol、0.03 nmol、0.20 mmol/L、1 U(或1.5U)、40倍时组成的20μL反应体系经PCR扩增后电泳,可得到品质最佳的银染谱带。②毛白杨CCGG位点甲基化相对水平约为26.75%～29.39%,CNG甲基化相对水平低于CG甲基化相对水平,子代的甲基化相对水平低于亲本的甲基化相对水平。③子代中发生遗传变异的CCGG位点数之比为1∶1。遗传自亲本的CG甲基化位点数高于遗传自亲本的CNG甲基化位点数,遗传自父本的甲基化位点数高于遗传自母本的甲基化位点数;子代甲基化位点的变异以去甲基化为主,发生CG甲基化变异的位点数与发生CNG甲基化变异的位点数之比为1∶1。     

转AtDME1基因‘84K’杨的获得及目的基因诱导表达分析

目的DNA甲基化是一种重要的表观遗传标记，在植物生长发育、环境响应等过程中发挥重要作用。本研究将拟南芥去甲基化基因AtDME1导‘84K’杨基因组中，通过化学诱导表达实验，研究AtDME1基因在转基因杨树中的诱导表达特性，为建立杨树甲基化诱导变异体系，进而实现杨树品种改良等奠定良好基础。方法以白杨派优良品种84K杨无菌苗叶片为受体材料，采用农杆菌介导法将化学诱导启动子与AtDME1基因导入‘84K’杨；经过潮霉素筛选、常规PCR检测及DNA测序等方法对抗性植株进行鉴定。通过化学诱导剂17-β-雌二醇对随机挑选的1个转基因株系离体叶片进行诱导处理，处理时间为0、3、6、12、24、48、96、144 h，采用qRT-PCR检测处理叶片中外源基因AtDME1的表达量变化。结果本研究中，潮霉素分化筛选共获得了抗性芽224个，经生根筛选获得6株抗性植株，经分子检测证实这6株抗性植株均为转AtDME1基因植株，扩繁后分别标号为转基因AD-1 ~ 6。qRT-PCR检测结果显示，化学诱导剂17-β-雌二醇处理3 h时，目的基因AtDME1的表达量基本达到最大值，效果持续至12 h后逐渐减弱。结论化学诱导剂17-β-雌二醇能迅速有效地调控转基因杨树中AtDME1基因的表达，为进一步研究DME1基因在杨树基因组甲基化调控方面的作用机制奠定基础，也为杨树化学诱导表达特性的研究做好了铺垫。      

农杆菌介导的水稻‘绥8’转化研究

以‘绥8’成熟胚为外植体,研究了愈伤组织的诱导、筛选、再生情况,并对转化植株进行PCR和抗旱性鉴定,以建立高效的愈伤诱导、农杆菌转化和再生体系。结果表明:‘绥8’材料成熟胚易消毒,不易染菌;铺种使用2NBK培养基,可诱导出大量长势良好的愈伤组织,不需切芽;转化后的愈伤组织不需要恢复阶段,在筛选过程中愈伤长势良好但是颜色较浅,区分抗性愈伤较难;分化时绿点率和分化率很高。PCR鉴定证明外源基因成功转化到‘绥8’基因组中,其转化率和阳性率分别为17%和70%。对转基因植株进行抗旱性鉴定,20%PEG胁迫复水后,与野生型相比,表现出良好的抗旱性。