抗旱基因8981转化‘吉粳88’的研究

以‘吉粳88’成熟胚为外植体,用农杆菌介导法转入抗旱基因8981,对转化过程中愈伤组织的诱导、转化、筛选等条件进行研究,建立一个稳定、高效的农杆菌介导的遗传转化体系,并对获得的转基因植株进行PCR鉴定、除草剂抗性检测和抗旱性鉴定分析。结果表明:‘吉粳88’在诱导愈伤的过程中,不需要切芽;当菌液浓度OD600=0.2,浸染时间为20min时,转化效率最高且效果最好;在筛选培养前,需要经过恢复培养。PCR检测证明8981基因已整合到‘吉粳88’基因组中,抗性检测发现转基因植株对除草剂和PEG胁迫都有一定的抗性。     

农杆菌介导遗传转化获得转CP4基因籼稻的研究

  目的  建立籼稻‘中恢161’Oryza sativa subsp. indica ‘Zhonghui 161’农杆菌Agrobacterium tumefaciens介导的转化体系。  方法  以籼稻‘中恢161’的成熟胚为材料,设置了5个草甘膦质量浓度(100、200、300、400和500 mg·L?1)进行胚性愈伤组织的草甘膦敏感性试验。利用农杆菌介导法,将草甘膦抗性基因CP4-EPSPS导入‘中恢161’的胚性愈伤组织中,转化后的胚性愈伤组织分别在含有300、350和400 mg·L?1草甘膦的选择培养基上进行抗性筛选。抗性愈伤组织进一步分化、成苗。  结果  草甘膦质量浓度为300~400 mg·L?1时,愈伤组织褐化率约50%,具有很好的选择效果。经统计,300、350和400 mg·L?1草甘膦抗性筛选后,愈伤组织阳性率分别为40.16%、61.72%和84.04%,抗性愈伤组织的分化率为46.43%,成苗率为32.84%。共获得67株再生小苗,经PCR检测,43株成功转入CP4基因,再生植株阳性率为64.18%。  结论  建立了‘中恢161’农杆菌介导的转化体系。图5参20     

优良小麦转基因受体品种的筛选及成熟胚半胚培养的研究

为了筛选具有良好组织培养特性的优良小麦品种作为转基因受体,使转基因小麦能尽快得到应用,对4个小麦品种的幼胚和成熟胚以及7个小麦品系的成熟胚进行离体培养,考察其组织培养特性.结果表明,11个品种(系)的成熟胚成愈率都达90%以上,但不同成熟胚来源的愈伤组织的植株再生率存在很大差异:7个小麦品系的植株再生率都低于20%,而4个小麦品种的植株再生率都达35%以上,幼胚成愈率及植株再生率都分别达90%和62%以上.该研究为小麦的遗传转化提供了几个新的优良受体品种.该研究进行成熟胚培养时,采用半胚培养的方式,一方面有效地克服了成熟胚在诱导培养基上直接萌发的现象,另一方面提高了成熟胚来源的愈伤组织分化为多苗的能力.该再生体系可作为小麦胚培养的参考.     

不同接种方式对水稻成熟胚组织培养的影响

以水稻成熟胚为外植体,采用4种不同的接种方式,对7个水稻品种的成熟胚进行了愈伤组织诱导和再分化试验,分析比较不同成熟胚接种方式的愈伤组织诱导率、愈伤组织质量和植株再生率.结果表明:将胚从种子上切下而直接接种在培养基上的接种方式,愈伤组织诱导率最高,愈伤组织质量最好,可以在短时间内获得大量胚性愈伤组织,其愈伤组织可在较短的时间内分化出较多的再生植株,是一种简单、方便、效果好的诱导水稻愈伤组织和再生植株的理想方法.     

根癌农杆菌介导的小麦成熟胚遗传转化研究

以小麦栽培品种郑麦9023成熟胚半胚愈伤组织作为受体材料,通过农杆菌菌株GV3101将目的基因导入受体材料并对转化过程进行了优化。考查了MS培养基中NH4NO3浓度对组织培养的影响,以及高渗处理对转化过程的作用。结果显示,2.5倍的NH4NO3浓度可明显提高愈伤组织再生率,高渗处理对愈伤组织再生率的提高也有帮助。经抗性筛选和PCR鉴定,共得到了4株转基因小麦植株,平均转化效率为0.18%。     

农杆菌介导法获得草地早熟禾转Bt基因植株

以草地早熟禾品种超级伊克利成熟种子为外植体材料,当愈伤组织诱导培养基中琼脂的用量增加至16g/L时,诱导产生的颗粒状胚性愈伤组织占愈伤组织总数的40%以上。愈伤组织经携带pGBI4AB农杆菌LBA4404的感染和共培养后,在继代培养基上添加50mg/L筛选剂G418,可较好地筛选出具有卡那霉素抗性的愈伤组织,进而获得具有卡那霉素抗性的再生植株。PCR分子检测结果表明,Bt基因已导入转化植株。生物学抗虫性鉴定结果显示,转Bt基因当代植株对1～2龄棉铃虫具有不同程度的抗性。     

草莓‘甜查理’和‘章姬’花药培养及单倍体植株的获得

为筛选草莓花药培养及单倍体植株最适宜的培养条件,以草莓栽培品种‘甜查理’和‘章姬’为材料,研究不同预处理方式、花序以及激素种类和配比对草莓花药愈伤组织诱导和分化效率的影响。结果表明:在4℃低温预处理过程中,始终保持花蕾表面湿润状态较自然状态下更能提高草莓花药愈伤的诱导率,最佳处理时间为72h;北京地区越冬栽培的草莓第1、2花序的花药较第3、4花序花药具有更好的培养效果;筛选出最佳愈伤诱导培养基,其中‘甜查理’愈伤诱导效率最高达到91.67%,‘章姬’为87.28%;筛选出最佳分化培养基,其中‘甜查理’最高分化率达到19.10%,‘章姬’为10.59%。共获得花药培养植株688株,其中‘甜查理’445株,‘章姬’243株。‘甜查理’再生植株中八倍体(2n=8x=56)、四倍体(2n=4x=28)植株所占百分比分别为90.43%和7.62%,其他为非整倍体植株。‘章姬’再生植株中八倍体和四倍体植株所占百分比分别为93.42%和4.32%,其他为非整倍体植株。建立了草莓花药培养高频诱导体系并获得了单倍体植株。     

甜玉米成熟胚和幼胚再生性比较分析

采用21种不同基因型的甜玉米,以成熟胚和幼胚两种不同外植体,对其愈伤组织的诱导、继代培养和分化进行了研究.结果表明,玉米的成熟胚和幼胚与愈伤组织诱导率相关,但两种外植体诱导出的愈伤组织状态明显不同,幼胚诱导出的愈伤组织状态普遍比成熟胚的好.对愈伤组织状态进行了分类,研究了出愈率、克隆力、芽点数与植株再生的关系,结果表明出愈率、克隆力与再生能力有较大的相关性.     

微弹轰击小麦幼胚愈伤组织的影响因素研究

【目的】优化小麦基因枪转化技术体系,为提高小麦基因枪转化效率提供参考。【方法】以小偃22为材料,采用基因枪法分析小麦幼胚愈伤组织诱导时间、微弹轰击金粉用量及筛选分化培养基类型对基因枪遗传转化频率的影响,并对转化植株进行了检测。【结果】在相同条件下,小麦幼胚经过9d的愈伤组织诱导时再生植株率最高,达到4.24%;同一条件下,金粉用量为60μg/枪的再生植株率最高,达到3.90%;使用1/2MS培养基添加NAA1.0mg/L和KT 1.0mg/L进行转化细胞筛选与分化的效果最好,再生植株率为3.72%;对转化抗性再生植株的特异PCR检测表明,目的基因已整合到小麦染色体组中。【结论】小麦幼胚通过9d的愈伤组织诱导,基因枪轰击金粉用量为60μg/枪,使用筛选分化培养基1/2MS+KT 1.0mg/L+NAA 1.0mg/L+双丙氨膦2.0mg/L+蔗糖30g/L+Ag 5.0g/L进行转化细胞的筛选与分化,可获得较高的抗性再生植株率。     

甜玉米成熟胚的组织培养及其植株再生研究

以45种甜玉米为材料,对成熟胚愈伤组织的诱导和继代培养、植株再生、再生苗移栽等方面进行了研究。45种基因型玉米成熟胚经诱导多可产生愈伤组织,但各种基因型之间愈伤组织诱导率差异较大,变异范围为0~100%。不同基因型愈伤组织的增殖力也有显著差异。将愈伤组织转入分化培养基,选系B12-2-2和A50可再生出完整植株。     

根癌农杆菌介导的水稻两用不育系培矮64S遗传转化体系的建立

以水稻两用不育系培矮64S成熟胚为外植体,以不同组合培养基为诱导和继代培养基,建立了适合水稻培矮64S转化的高效再生体系,并通过农杆菌EHA105介导,将大肠杆菌C1基因转入培矮64S,获得再生植株.结果表明.J0N1D3为合适的愈伤组织诱导培养基,诱导率达56.44%;通过潮霉素筛选后,获得的抗性愈伤组织分化率为73.08%,经分化,获得133株再生植株;随机挑选67株再生植株经PER检测,其中46株检测到目的条带,阳性检出率占68.66%;对PCR阳性植株进行荧光定量实时PCR分析,结果表明C1基因能在转基因植株中表达.通过对T1代PCR分析,得到目的条带,表明C1基因能在转基因后代稳定遗传.     

重穗型恢复系蜀恢527成熟胚高频率植株再生及其基因转化的研究

以籼稻重穗型恢复系蜀恢527的成熟胚为外植体,研究了影响其愈伤组织诱导及植株再生频率的各种因素。结果表明。在基本培养基NMB中添加2．0mg／L的2,4-D有利于蜀恢527成熟胚愈伤组织的诱导和继代培养;MS＋6-BA2．0mg／L＋KT2．0mg／L＋NAA0．25mg／L的分化培养基有利于愈伤组织的分化;继代两次的愈伤组织分化率最高。利用本研究建立了适合蜀恢527成熟胚遗传转化的高效植株再生体系,在此基础上利用农杆菌介导法将稻瘟病抗性基因Pi-d2导入蜀恢527并获得了经PCR检测为阳性的转化植株。     

基因枪法将细胞周期蛋白基因CycD2导入小麦的研究

以小麦品种绵阳11作为基因枪转化的靶材料,用含有细胞周期蛋白基因CycD2和新霉素磷酸转移酶基因NPTII的质粒PBI121轰击小麦成熟胚性愈伤组织,在含有遗传霉素G418的筛选培养基对愈伤组织进行筛选后诱导得小麦再生植株,经PCR检测有4个转基因小麦植株呈阳性,South-ern-blot鉴定后进一步证明CycD2基因已经被成功导入小麦并整合到小麦基因组中。     

小麦成熟胚愈伤组织的诱导及植株再生体系的研究

以小麦的成熟胚为外植体,通过胚性愈伤组织诱导进行植株再生.研究结果表明,在MS+2,4-D(3.0 mg/L)+VB1(1.0 mg/L)的培养基中,成熟胚可较高频率的诱导产生愈伤组织,诱导率为72.3%,但愈伤组织质量较差;在低浓度2,4-D和添加了ABA的继代培养基中,愈伤组织质量明显改善,胚性愈伤组织增加.筛选继代的胚性愈伤组织置于分化培养基MS+6-BA(1.0mg/L)+KT(4.0 mg/L)+NAA(0.3 mg/L)中,分化率达73.18%.该研究建立了一套有效的以成熟胚为外植体的小麦组织培养再生体系.     

三个苜蓿品种植株高频再生体系的研究

以适宜于西北地区生长的‘甘农1号’杂花苜蓿、‘甘农3号’紫花苜蓿,‘新疆和田大叶’紫花苜蓿3个品种的不同部位外植体为供试材料,进行了植株体外再生的研究.结果表明,苜蓿基因型、外植体来源、外源激素种类及浓度、激素处理时间、培养基蔗糖浓度等因素均影响细胞的生长发育和植株再生.‘甘农1号’苜蓿下胚轴愈伤组织诱导率和体细胞胚形成率最高,可达97.2%和70.9%,‘新疆和田大叶’苜蓿下胚轴次之,‘甘农3号’出愈率和体细胞胚形成率均最低;苜蓿愈伤组织诱导以2.0mg/L 2,4-D单独处理或2.0mg/L 2,4-D+0.5mg/L KT组合处理为最佳,在此激素组合处理下,下胚轴愈伤组织诱导率最高可达97.2%,激素处理时间以20d为宜;体细胞胚的发育则以2mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA的激素组合处理为宜,在此激素组合处理下,体细胞胚形成率最高可达70.9%.适宜的生根培养基为1/2MS+1.0mg/L IBA+1%蔗糖+0.7%琼脂.体细胞胚形成阶段培养基添加25~30g/L的蔗糖有利于愈伤组织分化.     

葡萄风信子体细胞胚再生体系的建立及抗生素敏感性试验

【目的】建立葡萄风信子体细胞胚再生体系,通过外部形态判断愈伤组织的类型,并探索胚性愈伤组织对头孢霉素和潮霉素的敏感性。【方法】以多年生葡萄风信子‘蓝穗’的盛花期叶片为试验材料,通过正交试验筛选胚性愈伤组织诱导时适宜的植物生长调节剂质量浓度及配比;石蜡切片法观察不同愈伤组织内部的细胞结构,诱导具有胚性的愈伤组织形成体细胞胚,进而获得再生植株;在培养基中加入头孢霉素或潮霉素,观察2种抗生素对胚性愈伤组织生长和体细胞胚发生的影响。【结果】葡萄风信子胚性愈伤组织诱导的适宜培养基为MS+0.5mg/L 2,4-D+0.1mg/L TDZ,在该培养基上诱导率高达100%。石蜡切片观察发现,外观质地紧密、节状或块状的愈伤组织为胚性愈伤组织。胚性愈伤组织在不含任何激素的MS培养基上可诱导形成体细胞胚,在光照条件下体细胞胚伸长并生根,最后形成成熟小鳞茎。头孢霉素质量浓度超过500mg/L时,葡萄风信子胚性愈伤组织的生长和体细胞胚的发生受到强烈抑制;引起胚性愈伤组织褐变的潮霉素临界质量浓度为90mg/L。【结论】建立了葡萄风信子体细胞胚再生体系,90mg/L潮霉素可作为区分转化与非转化葡萄风信子胚性愈伤组织的有效选择压。     

超甜玉米自交系成熟胚愈伤组织诱导及再生方法研究

研究超甜玉米自交系1132成熟胚愈伤组织诱导和植株再生频率的影响因素,丰富诱导愈伤组织的外植体来源。以1132成熟胚为材料,通过比较研究蔗糖、脯氨酸、2,4-D等因素对愈伤组织诱导率和分化再生的影响,确定适合1132成熟胚外植体愈伤组织诱导和再生的方法。结果表明,蔗糖浓度40g/L,脯氨酸1.4g/L、2,4-D浓度为4 mg/L的诱导培养基上愈伤组织出现最早,且愈伤组织诱导率最高,达到75%。在继代培养基中2,4-D浓度为2 mg/L,其他相同的条件下,愈伤组织继代性最好,最易产生胚性愈伤组织。植株再生培养通过含60g/L蔗糖的MS培养基培养2~3周,后转入含30g/L蔗糖的MS培养基培养再生植株的方法最好,可实现芽和根的同步再生。利用1132成熟胚诱导产生愈伤组织,并分化再生植株是对幼胚再生体系的有效补充,可以克服玉米基因工程育种研究中幼胚受季节限制的不利条件,丰富甜玉米基因工程育种中外植体的来源。     

基因枪介导大麦基因转化体系的建立

为了进一步提高基因枪转化效率，研究建立了以澳大利亚品种Franklin幼胚为受体的高效基因枪介导转化体系。结果表明，经愈伤组织诱导、筛选培养，从519块愈伤组织中获得16株再生苗，植株再生率高达3．0％。对长势良好的9株再生苗除草剂抗性检测和目的基因的PCR、PCR-Southern检测证实7株为转基因植株，并经过对外源基因(TrxS)表达活性检测表明，转基因大麦中Trxh的活性是CK的3．3倍，为基因枪高效转化提供了成功的证据。     

冬小麦‘东农冬麦1号’成熟胚组织培养及再生体系建立

‘东农冬麦1号’是目前黑龙江省高寒地区首个可越冬冬小麦品种,建立高效稳定组织培养再生体系,对品种改良和功能基因组学研究具有重要意义。研究以‘东农冬麦1号’成熟胚为外植体,探讨培养基类型、接种方式、添加物组合浓度、2,4-D、6-BA和KT浓度等因素对愈伤组织诱导、分化及植株再生影响。结果表明,不同培养基类型对冬小麦成熟胚诱导率影响无显著差异。接种方式对成熟胚愈伤组织分化率影响极显著,胚切伤略带胚乳法成熟胚刮碎法完整胚法。诱导培养基附加适量添加物有利于愈伤组织分化,正交试验获得添加物最佳配比为100 mg·L-1谷氨酰胺+0.1 mg·L-1NAA+0.3 g·L-1肌醇+1 g·L-1脯氨酸+0.5 mg·L-1ABA。2,4-D浓度显著影响成熟胚愈伤组织分化率和成苗率,随2,4-D浓度升高,诱导率呈先升高后降低趋势,而分化率和成苗率均下降。分化培养基中6-BA对成苗率影响差异极显著,4 mg·L-1时达到最大;KT对愈伤组织分化要高于6-BA,但对成苗率影响明显低于6-BA。该体系所获冬小麦愈伤组织分化率和成苗率分别可达93.33%和66.64%。     

日本落叶松体细胞胚胎发生的研究

[目的]对日本落叶松体细胞胚胎发生进行系统研究。[方法]以日本落叶松5个品种的未成熟合子胚为外植体,研究基本培养基、品种基因型、杂交系和纯系品种对日本落叶松愈伤组织诱导的影响,以及ABA对体细胞胚成熟及植株再生的影响。[结果]通过对日本落叶松胚性愈伤组织的诱导和体细胞胚的成熟培养获得再生植株。2种基本培养基中,DCR对胚性愈伤组织的诱导频率最高,达54.0%;落叶松品种之间的愈伤组织诱导率有差异,以杂交品种愈伤组织的诱导率最高,达71.4%,优于纯系的落叶松品种（27.3%～50.0%）;在体细胞胚的成熟培养过程中,ABA可严重影响体细胞胚的发育,并影响到其以后的萌发能力和植株再生。[结论]杂交品系更有利于胚性愈伤组织诱导,ABA对日本落叶松体细胞胚胎发育起重要作用。