通过组织移植揭示鹿生茸区骨膜与鹿茸形态关系的研究

鹿生茸区骨膜是角柄和初角茸生长的组织基础,然而,控制鹿茸生长形状的信息存在于何处目前尚不清楚,本研究利用鹿生茸区骨膜移植试验来揭示这一问题。结果表明,在角柄发生前将鹿生茸区骨膜移植到鹿的前额皮下后,第1年诱发生长了角柄或单枝鹿茸,第2年再生了具有眉枝的典型二杠茸。这一结果表明,控制鹿茸形状的信息存在于鹿生茸区骨膜中,而不是所谓的鹿中枢系统的“鹿茸生长中心”中。     

鹿生茸区骨膜不同部位生茸潜力的研究进展

鹿茸是雄鹿的第二性征,是由雄鹿头部额外脊处的骨膜组织所形成的,这部分骨膜被称为"生茸区骨膜"。生茸区骨膜具有巨大的生茸潜力,将生茸骨区膜移植到鹿体的其它部位,能诱导异位鹿茸的发生;一片直径约2cm的生茸区骨膜组能够在约60d的内再生出约10kg左右的鹿茸组织。研究发现,生茸区骨膜不同区域具有不同的生茸潜力,分别负责形成鹿茸的不同分枝和主干;生茸区骨膜细胞为干细胞。鹿茸干细胞的发现,为研究鹿茸生物学特性和揭示鹿茸完全再生机制开辟了一条新的通路。     

鹿茸再生关键组织角柄骨膜基因组DNA甲基化分析

为研究鹿茸再生过程中的分子调控机制,利用荧光标记的甲基化敏感扩增多态性(Fluorescence-labeled methylation sensitive amplified polymorphism,F-MSAP)方法,分别从组织和细胞水平检测致敏区角柄骨膜(Potentiated pedicle periosteum,PPP)和休眠区角柄骨膜(Dormant pedicle periosteum,DPP)的基因组DNA甲基化水平。结果表明:无论在组织还是细胞水平,PPP的DNA甲基化水平均低于DPP,并且差异显著(P0.05)。通过人工制造致敏区角柄骨膜(artificial PPP,a PPP)对试验结果进行了功能验证,证明鹿茸再生过程中,DNA甲基化是重要的分子调控机制,DNA去甲基化是激活鹿茸角柄骨膜再生能力的先决条件。     

Notch信号通路在体外培养的鹿茸干细胞中的表达

Notch信号通路是一条进化上十分保守的信号转导系统,在调节干细胞增殖、分化和凋亡方面起到重要作用。研究表明,鹿生茸区骨膜和角柄骨膜分别含有鹿茸发生和再生的干细胞。应用RT-PCR的方法对离体培养生茸区骨膜和角柄骨膜细胞进行检测,得出Notch信号通路各信号因子在2种细胞中的表达情况。结果:Notch-1、Notch-2、Notch-4、Dll-4J、agged-1J、agged-2、Hes-1等信号因子在这2种干细胞中均有不同程度的表达,说明Notch信号通路可能参与了他们的增殖、分化的调控。     

鹿茸干细胞p21基因表达水平及其对细胞周期的影响

为初步探讨p21基因在基于鹿茸干细胞的鹿茸再生过程中所起的生物学作用,本研究利用qRT-PCR以及流式细胞术,以鹿脸部骨膜细胞(FPCs)为对照组,对鹿茸干细胞的生茸区骨膜细胞(APCs)和角柄骨膜细胞(PPCs)中p21基因mRNA表达水平和细胞周期分布进行了检测。进一步通过RNAi干扰技术,抑制APCs中p21基因表达水平,验证其对细胞周期分布的影响。结果表明,鹿茸干细胞中p21基因mRNA表达水平显著高于对照组细胞(APCs PPCs FPCs,P 0.05);相对于对照组细胞,鹿茸干细胞周期分布没有显著差异;低表达p21基因的APCs细胞周期无显著变化,说明p21基因表达水平的变化对鹿茸干细胞周期无直接影响。本研究为深入揭示该基因在鹿茸干细胞中高表达所起的生物学作用奠定了基础。     

梅花鹿角柄骨膜蛋白质组学初步研究

为了利用蛋白质组学技术探索鹿茸研究模型中的特异性蛋白,本试验探索了一套完整的梅花鹿角柄骨膜蛋白提取及纯化方法。角柄是雄鹿头上着生的永久性骨桩,鹿茸每年由该骨桩上脱落和再生。本试验采集了梅花鹿角柄骨膜,利用冷冻液氮研磨法提取蛋白样品。蛋白样品分别经过丙酮沉淀和TCA-丙酮沉淀处理。结果显示,TCA-丙酮沉淀处理后电泳图谱斑点清晰,分辨率较高,是双向电泳蛋白提取样品的较优处理方法。     

S100A4蛋白的生物学功能研究进展

S100A4是S100蛋白家族成员之一,是一种具有EF双螺旋结构域的Ca2+结合蛋白。S100A4在多数成体组织细胞中不表达,在多种肿瘤和干细胞等增殖细胞内高度表达。相关研究表明,S100A4蛋白的表达与细胞的异常增生及肿瘤的发生、发展有关,并可促进肿瘤细胞的转移、侵入以及瘤区血管的生成。本研究组发现,S100A4在鹿生茸区骨膜(鹿茸发生的组织基础)和角柄骨膜(鹿茸再生的组织基础)的组织细胞中均大量存在。与肿瘤细胞不同的是,鹿茸干细胞并没有因为S100A4的表达而发生异常的侵入和转移,其增殖、生长直至分化为形状规则的完整鹿茸受到了严格的调控。鹿茸是哺乳动物中唯一可以周期性再生的复杂器官,其再生的机制引起了越来越多的关注,S100A4作为一种在快速增殖细胞中高度表达的多功能蛋白,为我们揭示鹿茸的发生与再生机制提供了一个新的研究方向。     

鹿茸干细胞内[Na+]测定及其影响因素鉴定

为探索鹿茸的形态发生与鹿茸干细胞(包括发生干细胞和再生干细胞)内[Na~+]的关系有关,以鹿茸干细胞为模型,研究不同干性的哺乳动物干细胞内[Na~+]的差异,并鉴定引起这种差异的电压门控性钠离子通道(NaV)因素。采集并培养具有不同干性的梅花鹿鹿茸干细胞,包括生茸区骨膜细胞(AP细胞,鹿茸发生干细胞)和角柄骨膜细胞(PP细胞,鹿茸再生干细胞,其干性低于AP细胞),以鹿普通脸部骨膜细胞(FP细胞)作为对照,并采用CoroNa染色方法,通过荧光强度来分析不同类型细胞内[Na~+]的差异,结合PCR方法鉴定转录水平上NaV基因的差异,并分别用睾酮和MS-222对细胞进行处理,观测其对细胞内[Na~+]的影响。结果表明:鹿茸干细胞内[Na~+]高于FP细胞,其中AP细胞内[Na~+]高于PP细胞;NaV1.1基因在AP细胞中特异性转录;睾酮对这3种细胞内[Na~+]水平没有显著影响;但是,MS-222处理能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。本研究发现:鹿茸干细胞内[Na~+]与其干性一致,干性高的AP细胞内[Na~+]也相对较高;NaV1.1基因在转录水平上的差异,可能是造成AP细胞内[Na~+]高的主要原因;干扰NaV的MS-222能够在一定程度上降低细胞内[Na~+]。说明哺乳动物器官的发生和再生可能与低等动物器官上的发现类似,都与细胞内[Na~+]有关。     

梅花鹿异位生茸技术

技术简介鹿茸为梅花鹿雄性第二性征,对生于雄鹿头部两侧额外脊部,初角茸形成后,每年于4～5月份开始,再生一对,7～8月形成标准二杠茸,年产二杠茸鲜重3～5kg。本技术依据鹿茸发生再生机理,通过外科手术操作,对鹿头部两侧生茸部位及生茸部位中间偏前的部位进行人工处理,使不具有生茸能力的部位获得完全的生茸能力,并与次年开始,生一支标准二杠     

梅花鹿锯茸时出血特点及止血机理的研究

根据鹿茸的组织结构,阐明了锯茸时出血特点收取初角茸时呈渗出状出血;收取二杠茸时呈线状出血;收取三杈茸和怪角茸时呈喷射状出血,并且有节律地进行搏动.出血量则随着鹿茸的产量和茸围的增加而增多,但是当收取茸围为20.3±0.6cm的怪角茸时却不存在着这种明显的相关关系.同一茸形不同年龄的鹿,因茸重、茸围的不同出血亦有差别.锯茸时由于茸皮下和茸髓质的动脉、静脉血管被横断,还可能发生纵断,血流较急,它不同于一般的血管损伤,止血时又不能采用钳夹、结扎血管断端的方法控制血流,烧烙法也不适宜,因此研究锯茸止血机理时重要的是机械性止血,同时应有利于创面的愈合,对鹿茸的再生长无任何不良影响.     

梅花鹿鹿茸S100A4融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化

我们的前期研究表明,鹿茸发生和再生都是依赖干细胞的过程。鹿茸的干细胞存在于鹿未来鹿茸发生区的骨膜中,即生茸骨膜。AP细胞表达特有的分子S100A4,推测为鹿茸发生的关键调节分子。进一步从分子水平阐述S100A4在鹿茸发生中的调节机制需要高质量S100A4的纯品。为了解决这一问题,我们针对已从梅花鹿AP细胞反转录出的S100A4基因序列,设计了含有EcoR I和BamH I酶切位点的上下游引物,并扩增出了目的片段。其后将S100A4基因片段和PGEX-6P-1载体酶切并进行了连接,转入Top10F’感受态细胞中,涂板筛选出了阳性克隆,进行了菌液PCR及双酶切鉴定,再将重组质粒转入了BL21（DE3）pLys S表达菌株进行了IPTG诱导表达。用聚丙烯酰胺凝胶电泳及western blot鉴定表明融合蛋白成功表达,随后对融合蛋白进行了纯化。本研究成功地实现了鹿本身特有的S100A4基因的体外表达。     

梅花鹿Thymosin beta 10基因RNAi慢病毒载体的构建及其对鹿茸干细胞增殖的影响

利用慢病毒干扰系统,对梅花鹿生茸区骨膜干细胞(Antlerogenic periosteum cells,AP细胞)Thymosin beta 10(Tβ10)基因进行RNA干扰(RNA Interference,RNAi),并初步研究该基因对细胞增殖的影响。结果表明:试验设计的3条针对梅花鹿Tβ10基因的shRNA序列与载体质粒p LVTHM连接成功,与p SPAX2、p MD2.G质粒共转染HEK 293T细胞,获得的重组慢病毒成功感染了AP细胞;荧光定量PCR检测结果表明,RNA干扰后Tβ10基因的mRNA水平下调,MTT试验结果显示Tβ10基因的下调可以抑制AP细胞增殖。试验成功构建了针对梅花鹿Tβ10基因RNAi载体,并成功干扰了Tβ10基因在AP细胞中的表达,基因下调最高可达35.6%,并初步确定Tβ10基因下调可抑制AP细胞的增殖。     

圈养东北马鹿鹿茸生长研究

2012年3月8日至5月22日,对北京动物园圈养的一只雄性东北马鹿鹿茸生长进行了研究。每间隔8～12d对鹿茸进行拍照,按比例测算鹿茸的相对长度,在锯鹿茸当日测定鹿茸重量。结果表明：圈养条件下,东北马鹿鹿茸主干生长随时间变化呈＂S＂型生长曲线,即呈缓慢、快速和减速生长3个阶段。第1阶段为第0～29天,平均生长速度为0.17cm/d;第2阶段为第30～56天,平均生长速度为1.30cm/d;第3阶段为第57天后,鹿茸平均生长速度为0.94cm/d。鹿茸3个阶段生长速率差异显著（P〈0.01）。第72天鹿茸锯下时重量4.0kg,平均增重0.05kg/d;右角主干长度54.5cm,平均生长速度0.76cm/d;左角主干长度56.5cm,平均生长速度0.78cm/d。     

鹿茸·鹿花盘蛋白提取物对小鼠相关指标的影响

[目的]研究鹿茸、鹿花盘蛋白提取物对小鼠相关指标的影响,为鹿蛋白质药理作用研究提供科学依据。[方法]提取鹿茸、鹿花盘蛋白,给小鼠灌胃,研究其对小鼠体重、胰腺系数、肾脏系数的影响。[结果]驯鹿茸蛋白提取物可增加小鼠体重,梅花鹿茸、鹿花盘蛋白对小鼠体重有抑制作用;3种蛋白提取物对小鼠胰腺、肾脏系数无影响。[结论]3种蛋白对小鼠体重有调节作用;3种蛋白对小鼠无明显毒性作用。     

梅花鹿鹿茸生长及骨化与碱性磷酸酶的关系

选用５头雄性梅花鹿、测定鹿茸生长速度,相对骨质密度,血清碱性磷酸酶活力,结果表明,在整个鹿茸生长期内,鹿茸生长速度,相对骨质密度,ＡＫＰ活力均有显著变化,在生长期骨化程度低且增长缓慢,而生长速度显著加快。在骨化期,骨化程度较高且迅速增加,生长速度迅速下降,骨化完成时停止生长;ＡＫＰ活力在生长期与生长速度同步升高,在骨化期下降。锯掉单侧茸后,ＡＫＰ活力明显下降。     

饲粮不同蛋白质能量水平对四岁梅花鹿生茸的影响

为探讨四岁梅花鹿生茸期饲粮适宜营养水平，本研究采用2(CP18％和15％)×2(GE17.15MJ/kg和16.32MJ/kg)二因子交叉设计，选用四岁(三锯)梅花公鹿40头，分为四个试验组，进行了饲养试验和消化试验。试验结果表明，饲粮蛋白质水平对鹿体增重有极显著影响(P＜0.01)，饲粮蛋白质水平为18％处理组鹿的体增重显著高于15％蛋白组；鹿茸产量组间差异不显著(p＞0.05)；饲粮粗蛋白质水平对蛋白质消化率有极显著影响(P＜0.01)，高蛋白组显著高于低蛋白组；饲粮能量浓度对粗纤维消化率影响显著(p＜0.05)，高能量组显著高于低能量组；四岁梅花鹿生茸期饲粮中能量、蛋白质适宜水平分别约为16.4MJ/kg(GE)和15.9％(CP)；平均每头鹿每天对消化能和可消化蛋白质的需要量分别为33.94MJ和330～360g。     

器官再生的研究进展——以鹿茸再生为特例

鹿茸作为哺乳动物唯一能够完全再生的附属器官,近年来对它的研究发展迅速,由于鹿茸生长与肢体发育过程非常相似,人们越来越倾向于以鹿茸再生作为肢体再生研究的模型。介绍了器官再生的研究现状,综述了鹿茸再生的研究进展,展望了鹿茸作为医学模型应用于肢体再生的可能性。