从绵羊UniGene数据库中筛选微卫星标记的初步研究

为了利用生物信息学方法筛选绵羊微卫星标记,利用SSRIT和SSRFinder软件对绵羊UniGene数据库的4 081个簇进行搜索,筛选绵羊EST-SSRs标记。结果表明,从绵羊UniGene数据库中搜索到微卫星136个,含有微卫星的序列121个,占整个EST序列数据库的3.0%,其中双碱基重复47个,三碱基重复54个,四碱基重复3个,五碱基重复4个,六碱基重复28个。在这些微卫星序列中,AC/TG重复在双碱基类型中最丰富,CTG重复在三碱基类型中最常见,分别占双碱基和三碱基微卫星序列总数的64%和29%。根据筛选到的微卫星序列设计并合成引物30对,在设计的30对引物中,20对引物有扩增产物,且条带清晰,其中有2对引物在小尾寒羊品种内呈现多态。     

三疣梭子蟹微卫星文库的构建及序列分析

采用磁珠富集法筛选三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)的微卫星序列。经Sau3AI酶切后的200~1000bp DNA纯化片段,与两端已知序列的人工接头连接,用含有生物素标记的(CA)₁₂和(GA)₁₂探针杂交,根据磁珠的链酶亲和素与生物素特异结合的特性,捕获含微卫星序列的单链DNA,以此为模板用人工接头序列为引物进行PCR扩增,随后将获得的片段连接到PMD18-T载体上,转化至DH5α感受态细胞中,成功构建了微卫星富集文库。测序其中的60个阳性克隆,得到42条微卫星序列(基因登录号为:HQ283153-HQ283194),除探针使用的CA/GT、GA/CT重复外,还得到GAGT重复序列。42条微卫星序列中,完美型31个(占73.8%),非完美型9个(占21.4%),混合型2个(占4.8%)。完美型的比例显著高于非完美型,这与其他真核生物微卫星序列的特征相一致。39条微卫星序列的重复次数大于10(占92.9%),其中,重复次数在10~19次之间的有27个,20次以上的有12个。筛选出的微卫星位点可为今后三疣梭子蟹遗传多样性评价、种群遗传结构鉴定及资源保护研究提供一套有用的分子标记。     

乌鳢微卫星DNA分子标记的分离及筛选

利用磁珠富集法结合放射性同位素杂交方法分离乌鳢Ophiocephalus argus的微卫星分子标记,共获得阳性克隆1 200个,从中挑选466个进行测序,得到400个含有微卫星的序列（占86.6%）。结果表明：完美型微卫星座位325个,占76.11%;非完美型微卫星座位75个,占17.57%;复合型微卫星座位27个,占6.32%。在得到的微卫星序列中,重复单元除CAG/GTC外,还观察到二碱基重复单元。根据侧翼序列设计引物139对,选择合成50对,通过优化PCR反应条件,结果有27对引物可扩增出清晰可重复的目的条带,19对引物在黑龙江群体、山东群体乌鳢的DNA样本中表现出多态性。     

赤点石斑鱼微卫星DNA的筛选

提取赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)基因组DNA,经BamH I和Hind III双酶切并电泳回收300~1 000 bp的片段与经BamH I和Hind III双酶切的pUC18质粒重组,转化感受态大肠杆菌JM109,以α互补法筛选重组阳性克隆,建立赤点石斑鱼部分基因组文库。应用PCR混合池法筛选含核心序列为(CA)n和(GA)n微卫星位点的阳性克隆,经DNA测序,得到61个含微卫星序列的克隆,占总克隆数的2.89%。61个用于测序的克隆中共有111个不同类型的微卫星序列,其中(CA/TG)n重复类型57个,占51.4%;(AG/TC)n重复类型35个,占31.5%;其他重复类型19个,占17.1%。完美型、非完美型及复合型序列分别占48.7%、41.4%和9.9%。并在GenBank上注册了22个微卫星序列。     

“光合1号”中华绒螯蟹微卫星富集文库的构建与多态性标记的筛选

采用磁珠富集法(Fast isolation by AFLP sequences containing repeats,FIASCO)构建"光合1号"新品种中华绒螯蟹Eriocheir sinensis基因组微卫星文库。用PCR法对225个单菌落进行鉴定,共获得168个阳性克隆,测序发现有94个含有微卫星座位,其准确率为55.95%,其中单元重复次数为5～10的序列占34.04%,重复次数为10～20的序列占20.21%,重复次数大于20的序列占45.75%,重复次数最高达到92次;完美型微卫星座位69个(占73.40%),非完美型微卫星座位17个(占18.09%),混合型微卫星座位8个(占8.51%);根据微卫星侧翼序列设计并合成53对引物,检测结果显示,有31对(占58.50%)引物能够扩增出特异性条带;选择其中14对多态性良好的引物用于中华绒螯蟹辽河野生群体的遗传多样性分析,共检测到148个等位基因,单个位点等位基因数为7～13个,平均为10.6个,观测杂合度为0.214 3～0.666 7,期望杂合度为0.825 4～0.910 1,多态性信息含量为0.766 3～0.865 4。     

用磁珠富集法制备史氏鲟的微卫星分子标记

采用生物素-磁珠富集法与放射性同位素杂交法相结合的方式,研究了史氏鲟Acipenser schrencki基因组的微卫星资源。结果表明:在得到的1 400多个细菌中,有300多个阳性克隆,将其中96个进行测序,在这些序列中共有115个微卫星核心序列,含99个重复次数大于10次的微卫星核心序列。其中完美型标记40个,占40.4%;非完美型标记52个,占52.5%;混合型标记共7个,占7.1%。随机选取侧翼序列较长的50个序列,依据引物设计原理设计引物50对,经3次PCR筛选,有28对引物可得到稳定的特异性扩增;同时利用史氏鲟的6个个体检验了这些位点的多态性,并统计了等位基因数,发现有22对等位基因具有良好的多态性。     

磁珠富集法分离柿微卫星标记

【目的】分离柿属植物的微卫星标记,为柿种质资源的分类、进化等遗传研究奠定基础。【方法】提取磨盘柿(Diospyros kaki)基因组DNA后,用EcoRⅠ和MesⅠ2种内切酶酶切并连接接头,再用接头特异引物进行PCR扩增。扩增产物与生物素标记的(GA)15和(AC)15探针杂交,杂交复合物用链亲和素包裹磁珠进行结合,得到单链DNA目标片段,经PCR扩增,连接pGEM-T载体,转化入感受态大肠杆菌,得到微卫星富集小插入片段DNA文库。用Colony-PCR法筛选阳性克隆,进行测序分析。【结果】测序96个克隆,54个含微卫星序列,24个为有效微卫星序列,其中完美型(perfect)9个,占37.5%;非完美型(imperfect)7个,占29.2%;混合型(compound)8个,占33.3%(。GA)n重复最为常见。21条含微卫星序列已登录GenBank(Accession Number:EF567396~EF567416)。成功设计21对引物,经初步筛选,14对表现出多态性。【结论】试验方法分离柿基因组微卫星简便有效,得到的多态性引物可用于柿种质资源的遗传研究。     

长江上游特有鱼类红唇薄鳅微卫星DNA分离及序列特征分析

为筛选出特异性高的红唇薄鳅微卫星位点,采用生物素探针(AC)13杂交和FIASCO磁珠富集法从红唇薄鳅基因组DNA中分离出一批微卫星序列,并对其序列特征进行分析。结果显示,157个单克隆中,阳性克隆为131个,阳性克隆率为83.44%。排除重复序列后,共得到69条重复类型和重复次数不同微卫星序列,阳性富集率为52.67%。在这些微卫星序列中,共检测到110个微卫星位点,其中90个二碱基重复微卫星位点,14个四碱基重复微卫星位点,6个五碱基重复微卫星位点。二碱基重复中,以AC/TG重复最为丰富(73个位点),四碱基重复中,AAAG重复数目最多(6个位点),只发现了1种五碱基重复TCTTC(6个位点)。微卫星重复次数在6~10次之间最多(65.45%),20次以上的较少(0.91%)。二碱基重复微卫星的变异系数最大(36.52%),四碱基重复类型的变异系数最小(26.75%)。红唇薄鳅微卫星以完美型为主(63.64%),复合型次之(23.63%),非完美型最少(12.73%)。筛选出的这些微卫星位点将对红唇薄鳅及近缘种微卫星分子标记开发和应用提供依据。     

黄鳝EST-SSR标记的开发及其通用性检测

利用SSRrepeat软件对NCBI数据库中黄鳝肠道EST序列进行挖掘、验证,分析微卫星(SSR)在这些序列中的总体分布特点,并开发黄鳝EST-SSR引物。结果显示,在黄鳝肠道的814条EST序列中共搜索到51个SSR位点,分布在43条EST中,出现频率为6.27%。这些EST-SSR的平均长度为18.80 bp。其中,三核苷酸重复为主导类型,占总SSR的49.02%,其次为二核苷酸重复,占29.41%。四、五、六碱基重复序列分别占微卫星总数的3.92%、11.76%、5.88%。多态性引物验证结果表明,在设计合成的21对EST-SSR引物中,12对在黄鳝中获得有效扩增。其中7对引物显示出多态性,共扩增出29个等位基因;每个位点等位基因数为2~7个(平均4.14),观测杂合度(Ho)为0~0.857 1,期望杂合度(He)为0.135 1~0.822 7,多态信息含量(PIC)为0.123 8~0.781 1。在鲤形目和鲈形目中进行的跨物种扩增结果表明,12对引物中有7对引物在5个不同物种间得到成功扩增,5对引物在个别物种间表现出多态。研究获得的EST-SSR引物,可用于黄鳝的种资资源评价及遗传结构研究。     

鲢三、四核苷酸重复微卫星标记的筛选及其特征分析

通过磁珠富集法筛选鲢(Hypophthalmichtys molitrix)的三、四核苷酸重复微卫星分子标记。提取鲢血液大片段基因组DNA,用限制性内切酶Sau3AI进行酶切,蔗糖密度梯度离心收集400~900 bp长度的片段,构建鲢全基因组PCR文库,用生物素标记的微卫星探针(TGA)8、(CAG)8以及(AGAT)6进行筛选,磁珠富集含有微卫星序列的DNA片段,获得含有微卫星的单链序列;将这些序列通过PCR扩增,连接pMD 18-T载体,转入感受态大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,获得微卫星文库;再用γ-32P标记的放射性同位素探针进行二次杂交筛选,获得1 758个阳性克隆,选择测序348个克隆序列中,共含有280个微卫星座位,其中完美型167个(59.64%),非完美型28个(10%),混合型85个(30.36%)。Primer 3.0软件设计60对引物,并用珠江水系的野生鲢群体对引物进行多态性位点检测。统计软件分析显示其中22对具有较高的筛选效率和多态性,可作为鲢种质评价等遗传分析的工具。研究亮点:首次利用多碱基(三、四核苷酸重复)探针筛选出微卫星分子标记结合同位素探针进行两次筛选...     

利用双重抑制PCR技术分离鸭微卫星标记

用双重抑制PCR技术分离10对鸭的特异微卫星引物,应用于北京鸭、樱桃谷鸭、高邮鸭3个品种的基因组PCR扩增。结果表明:10对引物中有7对引物具有多态,3对呈高度多态,4对呈中度多态。7对引物在上述3个鸭品种中分别扩增出23、22、23个等位基因,其中15个等位基因为3个品种所共有;各位点产生4~7个等位基因,平均杂合度为0.494~0.650,平均多态信息含量为0.414~0.586,平均有效等位基因数为2.001~2.870。3个鸭品种的平均杂合度分别为0.578、0.566、0.594,平均多态信息含量分别为0.496、0.480、0.524;平均有效等位基因数分别为2.441、2.340、2.615,与实测平均等位基因数3.286、3.142、3.286较接近。     

鸭绿江鲤鱼种质资源的微卫星分析

研究采用17对微卫星分子标记,以黑龙江野鲤(HLJL)作为阳性对照、建鲤(JL)作为阴性对照,对2批采自鸭绿江的鲤鱼(YL1,YL2)进行遗传多样性的分析,对其杂合度等数据进行统计分析,以期通过对鸭绿江野生鲤鱼现存群体的种质鉴定,了解鸭绿江鲤鱼的遗传结构特征、种群历史,为其遗传资源的保护提供较为准确的相关信息和依据.试...     

双重抑制PCR技术分离鹅微卫星标记

用双重抑制PCR技术分离11对鹅的特异微卫星引物,应用于浙东白鹅和太湖鹅的基因组PCR扩增。结果表明：11对引物在浙东白鹅和太湖鹅中分别扩增出37和36个清晰条带,20个等位基因为两品种所共有,11对引物中有5对呈中等多态、6对呈高度多态。各位点产生2～6个等位基因,各位点的平均杂合度为0．456～0．772,以G07位点为最高,G06位点为最低;平均多态信息为0．375～0．737,以G07位点为最高,C01、G03和G11位点为最低。浙东白鹅和太湖鹅有效等位基因数分别为2．655和2．558,与实际测得的两品种平均值3．364和3．273较接近。研究结果表明,两品种的等位基因分布较为均匀,与鹅的实际品种特征一致,因此,双重抑制PCR技术适合于鹅的基因组结构研究。     

长毛兔微卫星标记初步分析

为在长毛兔群体中实施标记辅助选择，检测了200只长毛兔的sat13、so133、sat4、so144等4个微卫星位点，结果表明，这4个微卫星位点都具有高度的多态性，sat4位点杂合度（H）和多态信息含量（PIC）最高，分别为0.8920与0.8790。sat13和so144位点等位基因数为7个，而sat4和so133位点分别有10个等位基因。     

微卫星分子标记在昆虫分子生态学研究上的应用

微卫星又称为简单重复序列,由1～6个核苷酸串联重复而成。由于其具有基因组中分布广泛、共显性遗传、变异丰富、易于被扩增及对DNA要求质量低等优点,近年来被广泛用于昆虫学研究的各个领域。本文对微卫星的开发技术革新进行综述,以应用实例阐述微卫星分子标记在昆虫生态学研究中所起的作用,探讨微卫星在应用过程中存在的问题及解决方案,并讨论微卫星分子标记的发展趋势。     

灵昆鸡群体微卫星DNA遗传多样性研究

为阐明灵昆鸡群体遗传变异和遗传结构状况,采用23个家鸡特异性的微卫星标记对该鸡种自然群体中30个个体进行PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳分析,检测其等位基因。结果表明,共检测到174个等位基因,23个座位都呈现出多态性,23个微卫星座位的等位基因数在3～12个,平均等位基因数为7.5个。群体平均杂合度和平均多态信息含量分别为0.758和0.723。分析结果表明灵昆鸡自然群体遗传多样性较丰富。     

11个鸭种(群)遗传变异的微卫星标记分析

利用9个微卫星标记对高邮鸭、金定鸭、荆江麻鸭、山麻鸭、白羽番鸭、黑羽番鸭（纯黑）、黑羽番鸭（白头）、苏牧麻鸭、苏牧白羽鸭、苏牧黑鸭及龙白鸭11个鸭种（群）的平均基因杂合度、平均多态信息含量进行了分析。结果表明：11个鸭种（群）在9个微卫星座位上的基因频率存在一定差异．其平均基因杂合度为0．6599.平均多态信息含量为0．5966。其中．黑羽番鸭（白头）平均基因杂合度最高．为0．6948．遗传多样性最丰富;荆江麻鸭平均遗传杂合度最低,为0．5757。     

藏马微卫星标记遗传多样性研究

为研究西藏藏马种群的微卫星多态性,应用生物素标记的微卫星探针与藏马基因组酶切片段杂交,通过链霉亲和素包被的磁珠捕获150～1 000 bp含有微卫星序列的DNA片段,连接到pEASY-T1载体中,构建藏马基因组微卫星富集文库。结果表明:从2 380个转化子中随机挑取112个阳性克隆进行测序后,经筛选比对发现,从62个微卫星中筛选出39个在马属基因组卫星库中未被检测到的微卫星;成功设计了10对藏马微卫星引物,经聚合酶链式反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)方法检测到3个具有多态性的微卫星标记,其中有2个多态性信息含量(PIC)值均大于0.5。因此,这3个微卫星标记可应用于藏马遗传多态性检测、种群遗传结构等方面研究,为藏马遗传连锁图谱的构建、辅助育种、群体遗传学分析、基因组结构分析以及分子进化研究等提供依据。     

尖孢镰刀菌基因组SSR位点分析

为明确尖孢镰刀菌基因组中SSR位点的分布特点,本研究利用生物信息软件SSRIT对7条已公布的尖孢镰刀菌染色体基因组序列中的SSR位点进行了搜索,并用Excel软件对其进行统计分析。结果表明:基因组中7条染色体共有860个SSR位点,平均每条染色体出现122个SSR位点,大约每44.2kb出现一个长度不小于18bp的SSR位点。其中四、五核苷酸重复为主要重复类型,占全部SSR的比例分别为23.84%和32.56%;435种重复基元的分布情况存在差异,基元为ACAA/TTGT出现次数最多,为33次,其次为CAAA/TTTG,出现32次。说明尖孢镰刀菌基因组中含有丰富的SSR位点,为Genomic-SSR标记在尖孢镰刀菌鉴别中的应用奠定了理论基础。