玉米泛素延伸蛋白基因ZmERD16的克隆、序列特征和表达分析

在前期研究中发现一个玉米苗期早期应答干旱的EST序列与拟南芥泛素延伸蛋白ERD16序列同源性很高。本研究根据拟南芥AtERD16序列,应用同源克隆技术分离出玉米泛素延伸蛋白基因,命名为ZmERD16。ZmERD16的开放阅读框为390 bp,编码129个氨基酸,等电点pI为 9.94,分子量为14.7582 kD。ZmERD16蛋白包含1个泛素单体蛋白,其后融合了53个氨基酸的核糖体多肽,属于泛素延伸蛋白亚族。ZmERD16具有4个外显子3个内含子的基因组结构,其启动子区域具有多个干旱、病害、水杨酸、乙烯、真菌等胁迫响应应答元件。蛋白结构预测显示ZmERD16无跨膜结构,定位于细胞质和细胞核中。利用实时荧光定量PCR对ZmERD16的组织表达特异性和在不同胁迫条件下的表达谱分析表明,ZmERD16在各组织中均表达,其表达量受盐、脱水、PEG、低温、高温、茉莉酸甲酯和水杨酸等多种胁迫信号诱导。推测ZmERD16可能参与玉米的多种胁迫信号传导和逆境应答进程。     

玉米热激蛋白基因ZmHSP90-1的克隆及表达分析

HSP90是普遍存在于原核和真核细胞中的一种高度保守的分子伴侣。本研究从玉米中克隆了一个HSP90同源基因, 命名为ZmHSP90-1基因, 并对其进行了初步的序列分析。该基因cDNA序列全长2 371 bp, 开放阅读框2 094 bp, 编码697个氨基酸, 蛋白质分子量约79.98 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明, ZmHSP90-1基因编码蛋白含ATPase位点和HSP90保守结构域, 并与拟南芥、水稻等多种物种的热激蛋白高度同源; 进化树分析表明ZmHSP90-1与拟南芥AtHSP90.1基因关系较近, 蛋白序列相似性达88.3%。目的蛋白亚细胞定位显示, ZmHSP90-1蛋白在细胞质中表达。实时荧光定量PCR分析表明, ZmHSP90-1对非生物胁迫高温、高盐、ABA、低温、干旱均具有明显的应答反应。推测ZmHSP90-1是玉米的一个胁迫相关基因。     

玉米分子伴侣基因ZmBiP2在逆境下的功能分析

BiP(binding protein)基因编码的蛋白是一类重要的分子伴侣,在动植物的逆境胁迫响应过程中具有重要的作用。从玉米抗旱自交系旱21中分离到分子伴侣基因ZmBiP2,序列分析结果显示,该基因开放阅读框长1989 bp,编码含663个氨基酸的蛋白,包含热激蛋白家族特有的TVIGIDLGTTYSC保守结构域和ATP结合位点。实时荧光定量PCR结果显示,Zm Bi P2基因在玉米的雄穗和子房中表达量最高;在盐、甘露醇胁迫条件下,该基因在植株的地上部分上调表达。过量表达Zm Bi P2基因的拟南芥转基因株系在种子萌发时期对盐和甘露醇胁迫的耐受能力减弱,在苗期对盐胁迫敏感。推测在植物响应非生物胁迫的过程中,过量表达的ZmBiP2蛋白可能发挥负调节蛋白的功能。     

玉米干旱诱导表达基因ZmCKS2的克隆与表达分析

在本实验室前期研究的干旱胁迫相关的抑制差减文库(SSH)中,发现一个玉米干旱胁迫诱导表达的EST序列,与拟南芥AtCKS2和AtCKS1基因有较高的同源性。应用生物信息学手段和同源克隆的方法,分离得到该基因,命名为ZmCKS2。序列分析表明该基因开放阅读框区267bp,编码88个氨基酸。ZmCKS2蛋白含有真核生物中高度保守的CKS(cyclin-dependent kinase regulatory subunit)结构域。应用在线分析软件预测该基因上游2kb序列表明,该序列具有启动子的核心序列和增强子序列,同时还具有与干旱等多种逆境胁迫相关的调控序列。应用实时荧光定量PCR分析表明该基因在幼穗中表达量最高,且受干旱和MeJA诱导上调表达,受低温和外源ABA诱导下调表达。     

青稞hblt4.2基因的克隆及功能分析

根­据大麦blt14.2基因序列设计引物, 用青稞的DNA为模板扩增低温反应基因的全长序列, 命名为hblt14.2, 在GenBank登录号为EF514912。该基因含470 bp, 包括249 bp的开放阅读框、69 bp的5''非翻译区和152 bp的3''非翻译区, 编码82个氨基酸残基, 富含Gly、Ala、Leu和Val氨基酸, 与其他冷诱导基因编码蛋白具相似性。与大麦blt14.2基因具98.9%同源性, 所编码的蛋白存在2个氨基酸的差别。将hblt14.2基因连接CaMV35S启动子和NOS终止子后定向插入质粒pCAMBIA1301的多克隆位点中, 构建植物表达载体pCAMBIA-BI-hblt, 通过农杆菌介导转化烟草, 并对转基因烟草进行抗寒性检测。结果表明, 青稞hblt14.2基因与植物的抗寒性有一定关系。     

玉米中QM同源基因的克隆及其差异表达分析

利用cDNA-AFLP技术和5'' RACE技术在玉米自交系黄早四Ht2上分离并克隆了QM（编码核糖体蛋白L10）同源基因(命名为ZmQM)。其cDNA全长为967 bp, 开放阅读框为738 bp,。该基因编码245个氨基酸的ZmQM蛋白,分子量为27.78 kD, 等电点(pI)为10.69, 预测含蛋白酶C磷酸化位点、N-酰基化位点和酰胺化等位点。玉米ZmQM蛋白与包括人类等l3个物种QM蛋白的同源性比较发现, 氨基酸序列相似性为66%~92%。RT-PCR分析表明, 在接种玉米大斑病菌(Exserohilum turcicum) 1号小种12 h后, 黄早四Ht2中ZmQM基因表达量较黄早四中明显上调,推测ZmQM基因可能参与黄早四Ht2对玉米大斑病菌1号小种的抗性反应。     

甘蔗Na~+/H~+逆转运蛋白基因的克隆与表达分析

Na~+/H~+逆向转运蛋白基因SOS1(salt overly sensitive 1)是植物耐盐性的必需基因之一,在植物抵御盐胁迫过程中发挥十分重要的作用。本研究以小麦EST序列KJ563230为探针,利用电子克隆技术结合RT-PCR,获得一条甘蔗SOS1基因的cDNA序列,命名为ScSOS1(GenBank登录号为KT003285)。序列分析结果表明,该基因全长1403 bp,包含一个1272 bp的开放阅读框,编码423个氨基酸的蛋白质。ScSOS1蛋白的相对分子质量为47.6 kD,理论等电点(pI)为9.12。氨基酸序列分析表明,ScSOS1蛋白具有一个CAP-ED superfamily结构域。生物信息学预测显示,ScSOS1的编码蛋白为亲水性蛋白,不存在信号肽,二级结构元件多为无规则卷曲,主要参与中间代谢。实时荧光定量PCR分析表明,ScSOS1基因的表达具有组织特异性,在甘蔗叶鞘、蔗皮、蔗髓、侧芽和根中均有表达,其中在叶鞘中的表达量最高,根中的表达量最低。此外在NaCl、PEG、ABA、SA和MeJA的胁迫过程中,该基因表达均受到调控,其中受NaCl和PEG诱导后上调表达,均在24 h表达量达最高,分别约为对照组的1.5倍和4.0倍。推测该基因的表达与甘蔗耐盐性和抗渗透胁迫有关。     

小麦TaCRF2基因的克隆及其在烟草中的初步功能验证

通过RT-PCR从小麦cDNA中扩增获得一个锌指蛋白基因TaCRF2, 该基因的cDNA长度为847 bp, 序列分析表明它编码一个含有280个氨基酸的蛋白质。在线软件预测该蛋白质的相对分子质量为30.97 kD, 等电点为7.03, 且在C-末端含有一个典型的RING-H2型锌指蛋白结构域, 在N-末端含有两个跨膜结构域。氨基酸序列比对发现, TaCRF2与水稻中的一个RING型锌指蛋白(ABF95226)的相似度为82%。亚细胞定位分析显示, 该蛋白分布在细胞核和细胞膜上。Real-time PCR表达特性分析显示, TaCRF2基因的表达受干旱、盐和ABA的强烈诱导, 低温对该基因的表达量影响不明显。初步功能验证发现过表达TaCRF2基因增强了转基因烟草对干旱和盐胁迫的耐性。     

白菜脱水应答转录因子BpDREB1基因的克隆及功能研究

DREB1/CBF类转录因子在植物抵抗外界胁迫上起重要作用,利用这些基因改良作物抗逆性具有重要意义。本研究在白菜中分离到一个DREB类转录因子基因BpDREB1 (EF219470)。该基因序列全长647 bp,推测编码蛋白含213个氨基酸,相对分子量为23 kD,理论等电点为5.11,与白菜中该类转录因子序列同源性为94%。进化树表明,BpDREB1属于DREB亚家族中A1亚族。基因的诱导表达模式分析显示,BpDREB1被低温强烈、迅速诱导表达,并对干旱胁迫也有一定程度的响应,但对高盐处理几乎没有响应。过表达BpDREB1的转基因拟南芥经低温诱导后,其体内可溶性糖及脯氨酸含量大幅度提高。以上结果显示BpDREB1转录因子基因具有家族成员基因结构的特征,在低温、干旱应答途径中起重要作用。     

棉花转录因子基因GhMYB的克隆及特征分析

从棉花中克隆了1个MYB基因,命名为GhMYB(Gen Bank No.HQ234875)。该基因c DNA全长1264bp,具有1个774 bp的开放阅读框,5'非编码区为250 bp,3'非编码区为240 bp,编码256个氨基酸,预测分子量约为28.867 k Da,等电点为8.56,推测的氨基酸序列中含有2个高度保守的SANT结构域。GhMYB基因组序列长度为1355 bp,包含2个外显子和1个内含子。氨基酸同源分析发现,GhMYB与来自可可、陆地棉和巴旦木的MYB同源性较高。亚细胞定位结果表明,GhMYB:GFP融合蛋白定位于细胞核中。SDS-PAGE电泳分析表明,p ET-28a-GhMYB最佳诱导表达条件为1.0 mmol·L-1 IPTG在37℃下诱导4 h。电子表达谱分析表明,GhMYB基因在棉铃中特异表达,在根和叶中受水涝胁迫的诱导表达。     

谷子逆境应答相关的钙依赖蛋白激酶基因SiCDPK1的克隆与表达

CDPK是一类重要的钙信号感受蛋白和响应蛋白,在植物非生物胁迫应答方面具有重要的作用。为探究耐旱作物谷子CDPK在抗逆胁迫中的应答机制,本文利用RT-PCR技术从谷子幼苗cDNA中克隆到一个与逆境胁迫相关的CDPK基因,命名为SiCDPK1 (GenBank登录号为KC249975.1)。以拟南芥CDPK基因序列为查询序列,预测谷子基因组含有28个CDPK基因。其系统发育分析表明,谷子CDPK基因家族由4个亚类组成,其中SiCDPK1属于第II亚类,其全长1596 bp,编码531个氨基酸,预测蛋白分子量为59.5 kD,等电点pI为5.94,含有典型CDPK的保守结构。启动子调控区含有与多种逆境胁迫相关的调控元件。实时定量结果显示,SiCDPK1基因受PEG、ABA、高盐、自然干旱胁迫诱导表达。本试验为谷子抗逆应答机制的深入研究奠定了良好的理论基础。     

一个玉米类ABC1基因ZmABC1-10的克隆及其对镉等非生物胁迫的应答

镉是一种非必需的重金属元素, 对动植物有严重毒害作用。几个与ABC1(activity of the bc1 complex)家族有关的基因参与植物镉胁迫的应答。本研究从玉米中克隆并鉴定了一个类ABC1基因, 命名为ZmABC1-10。该基因cDNA全长2 519 bp, 包含一个2 250 bp的开放阅读框, 编码一个预测的叶绿体膜蛋白。启动子顺式元件扫描发现该基因含有大量的非生物胁迫、光以及植物激素应答元件。表达模式分析表明, 该基因主要在叶片、茎秆等绿色组织中表达。镉处理实验表明, 该基因能够被诱导并且受植物发育时期的调控。除镉之外, 该基因还受多种非生物因素包括ABA、H₂O₂、干旱和黑暗的共同调控。此外, 本研究利用基因组序列信息共鉴定出19个玉米ABC1基因。对植物界8个代表性物种中148个ABC1蛋白进行系统发育分析表明, 在长期进化过程中植物ABC1蛋白已经发生了分化; 物种特异性扩张是植物中该家族进化的主要动力。这些结果表明ZmAbc1-10是一个镉应答因子并且可能在植物对非生物胁迫的适应中发挥重要作用。     

玉米液泡ATP酶亚基A基因的克隆及表达分析

V-ATPase在植物应对非生物胁迫中起着十分重要的作用, 对其关键亚基基因的克隆及分析有助于阐释其在逆境下的调节及响应机制。本文利用RACE技术从玉米自交系CN165花期水分胁迫下的总RNA中克隆出液泡ATP酶亚基A基因, 命名为ZmVHA-A。该基因cDNA全长2 414 bp, 含5′-UTR(293 bp)、3′-UTR(257 bp)及编码区(1 863 bp), 编码620个氨基酸。序列比对及结构域预测结果表明, ZmVHA-A基因编码的氨基酸序列与亲缘关系比较接近的禾本科作物如水稻、小麦和大麦的氨基酸序列同源性分别达92.7%、89.8%和89.8%, 且在编码蛋白的氨基酸序列上有两个与核苷酸的磷酸基团相互作用的保守结构域“GAFGCGKT”和“PSVNWLISYS”, 可见该亚基是相对保守的。Northern杂交分析结果表明, ZmVHA-A基因在花丝中被水分胁迫诱导表达且在苗期对盐胁迫、冷处理和ABA处理具有不同的表达响应方式, 因此认为VHA-A基因是一个比较保守的功能亚基,并且通过转录表达调节参与了V-ATPase对逆境胁迫的适应。     

甜菜组学技术研究进展

转录组学、蛋白组学、基因组学和代谢组学等组学技术具有高通量、高灵敏度和系统性等优点，已成为在分子水平上研究植物应对生物胁迫和非生物胁迫的强有力工具。本研究综述了近年来国内外在甜菜组学技术方面的相关研究，包括甜菜在生物和非生物胁迫下的抗逆分子机理研究、细胞质雄性不育(CMS)结构基因和基因辅助甜菜育种功能研究，这些研究对于培育优良甜菜品种具有重要的理论价值。下一步应加强多种组学结合的研究策略，并结合基因功能鉴定发掘更多的甜菜优质基因资源。     

玉米生长素响应因子家族基因的表达模式分析

生长素响应因子(auxin response factor,ARF)是一类重要的转录因子,通过特异性地结合生长素响应元件调节下游靶基因的转录,参与诸多植物生长发育过程的调控。玉米中有许多ARF家族基因,但其表达模式有待深入研究。本研究分析了玉米ARF家族基因在不同组织器官中的表达,发现除ARF10、ARF16和ARF34组成型表达外,其余32个ARF基因的表达水平在生殖器官中要明显高于营养器官。对ARF基因启动子区的顺式作用元件分析显示,28个ARF基因的启动子区含有逆境胁迫相关顺式元件,实时定量PCR分析结果显示,多个ARF基因分别响应冷、热、盐和渗透胁迫。研究结果不仅暗示了ARF家族基因在玉米生殖生长和非生物逆境胁迫响应中的重要性,也为全面解析ARF基因在玉米中的生物学功能提供有用信息。     

玉米胁迫诱导表达基因ZmSNAC1的功能分析

NAC转录因子是具有多种生物功能的植物特异转录调控因子,在植物生长发育、器官建成、激素调节和抵抗逆境等方面发挥着重要的作用。我们之前分离得到1个受干旱、盐、冷等非生物逆境胁迫和植物激素ABA诱导显著上调表达的玉米NAC家族成员ZmSNAC1,过表达转基因株系在苗期的耐脱水能力较野生型株系明显提高。在此基础上,本研究进一步对ZmSNAC1过表达转基因株系在植株生殖生长发育时期的抗旱性和耐盐性进行功能鉴定。结果表明,在干旱胁迫条件下,野生型株系相比转基因株系较存活率提高50%~52%,相对电导率降低17%~21%,叶绿素含量提高36%~47%,脯氨酸含量提高了17%~23%;在300mmol L^-1 NaCl胁迫条件下,转基因株系的存活率提高36~40%。ZmSNAC1可能作为一个正向调控因子在逆境胁迫信号转导过程中发挥重要作用。     

玉米HD-ZIP I亚家族基因鉴定及表达分析

转录因子是植物响应逆境胁迫的重要调节因子,在其整个生长发育过程中发挥着重要的作用。HD-ZIP家族蛋白是植物中特有的一大类转录因子,包含4个亚家族(HD-ZIP I^IV),其中HD-ZIP I亚家族成员主要参与干旱、渗透压等极端环境和ABA及乙烯等激素处理的响应过程。本文采用隐马可夫模型(HMM)在玉米参考基因组中鉴定到17个HD-ZIP I亚家族成员,这些基因不均匀分布于玉米6条染色体上,与水稻的亲缘关系要近于拟南芥。玉米HDZIP I亚家族基因在玉米7种组织中表现出多种表达模式,具有明显的组织表达特异性。另外, HD-ZIP I亚家族基因对高盐、淹水及冷害等不同的逆境胁迫处理呈现出不同的响应模式及响应程度差异。5种不同激素处理后,玉米HD-ZIP I亚家族基因也表现出复杂的响应模式。这些结果为进一步解析玉米HD-ZIP I亚家族基因的生物学功能和作用机理提供了一定的参考价值。