Illumina MiSeq高通量测序分析核桃内生细菌多样性

应用Illumina Mi Seq高通量测序技术测定核桃内生细菌的16S r DNA-V4变异区序列,使用Uparse等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTUs)数量,分析内生细菌的丰度和α-多样性。获得了用于分析的有效序列63 183条,OTU数为103。稀释曲线表明测序深度充分,OTU数量接近于饱和。核桃样品的Chao1指数为105.143,Shannon多样性指数为1.823。核桃内生细菌主要分布于鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas,27.27%)、盐单胞菌属(Halomonas,27.27%)、土壤杆菌属(Agrobacterium,45.45%),这3个属是核桃内生细菌优势菌属。     

高通量技术分析‘砂蜜豆’甜樱桃不同组织内生细菌多样性

为探明甜樱桃内生细菌种群结构及多样性，以‘砂蜜豆’甜樱桃根、主干树皮和枝条3个组织的内生细菌为研究对象，对其16S rRNA V3～V4区进行高通量测序。结果表明，‘砂蜜豆’甜樱桃不同组织内生细菌群落多样性及功能存在较大差异。不同组织中共获得有效序列9 665 813条，聚类为1 386个OTU(operational taxonomic units)，隶属于20个门、43个纲、79个目、162个科和346个属。在门水平，变形菌门（Proteobacteria）在各组织中的丰度均最高，是最优势菌门。在属水平，根部内生细菌的优势菌属为链霉菌属（Streptomyces）、类固醇杆菌属（Steroidobacter）和乳酸杆菌属（Lactobacillus）；枝条内生细菌中鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）的相对丰度较高；主干树皮内生细菌的优势菌属为拟杆菌属（Bacteroides）。PICRUSt (phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states)基因预测表明，内生细菌...     

白芨内生细菌组成及多样性分析

[目的]调查白芨内生细菌种类及多样性,为更好地保护和开发利用白芨资源提供科学依据.[方法]应用Illumina MiSeq高通量测序技术测定白芨内生细菌的16S rDNA-V4变异区序列,应用Qiime和Mothur等软件整理和统计样品序列数目和操作分类单元(OTUs)数量,分析物种丰度及分布的差异.[结果]获得用于分析的有效序列和OTU数为49550/48;稀释曲线表明测序深度充分,OTU的数量接近于饱和.白芨内生细菌主要分布于鞘脂单胞菌属(Sph ingomonas,3226%)、地杆菌属(Pecobacter,16.13%)、盐单胞菌属(Halomonas,16.13%)、土壤杆菌属(Agrobacterium,12.90%)、Kaistobactc届(6.45%)、希瓦氏菌属(Shcwanclla,6.45%)、假单胞菌属(Pseudomonas,6.45%)和短波单胞菌属(Brevundimonas,3.23%)8个属.[结论]鞘脂单胞菌属、地杆菌属、盐单胞菌属和土壤杆菌属是白芨内生细菌的优势种群.Illumina MiSeq高通量测序技术能准确反映植物内生微生物的种类组成和真实比例,在植物内生微生物研究中具有明显的优势和可行性.     

桑树内生细菌多样性及内生拮抗活性菌群的研究

为探究桑树内生细菌多样性,获得拮抗性内生菌,开发利用桑树内生菌资源,通过非培养法构建16S rDNA文库,并结合组织分离培养法对桐乡青(桑树品种)内生细菌的种群特征进行了研究.非培养法研究结果显示所构建文库的111个阳性克隆属于22个分类单元,其分属于3门10属,其中,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、Massilia和甲基杆菌属(Methylobacterium)为优势菌属;使用不同培养基通过培养法从桐乡青茎中获得25个内生细菌分离株,基于16S rDNA序列系统发育分析其属于15个分类单元,其分属于3门12属,其中肠杆菌属(Enterobacter)、芽孢杆菌属(Bacillus)和泛菌属(Pantoea)为优势菌属.培养法得到的内生细菌种群与非培养法差异较大,仅假单胞菌属(Pseudomonas)和鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)为共同菌属,且培养法得到的内生细菌多样性和均匀度指数(H'2.54,D 0.91,J 0.79)均高于非培养法(H'2.21,D 0.84,J 0.48).采用抑菌圈法,以10株植物病原菌作为指示菌,结果显示多达18株桑树内生细菌对一种或多种病原菌有抑制作用.综上结果表明,桑树内生细菌具有丰富的多样性,并且包含大量具有抗菌活性的菌株,以桐乡青材料为例,抗菌活性菌株约占其内生细菌的72%.     

烟草不同部位内生细菌的多样性

为了揭示烟草不同器官中内生细菌的分布规律,应用Illumina测序平台的MiSeq高通量测序仪对烟草根、茎、叶中内生细菌的16S rDNA-V4区扩增子进行测序,对测得数据进行生物信息学分析,评价物种α多样性和β多样性。经FLASH软件对序列进行拼接,茎、叶、根样品分别获得36 129、60 312、52 573条原始序列,经Qiime软件过滤,再剔除宿主的叶绿体和线粒体序列,最终分别得到35 190、58 938、51 268条有效序列,在97%的序列相似性水平上,这些有效序列被Uparse软件划分为1 447、1 141、1 220个操作分类单元(OTUs)。序列比对结果表明,在根、茎、叶中芽球菌属(Blastococcus)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)为优势菌。类诺卡氏菌属(Nocardioides)、链霉菌属(Streptomyces)、Gemmatimonadaceae属、Gaiella属、壤红杆菌属(Solirubrobacter)、假单胞菌属(Pseudomonas)细菌表现出组织专一性,主成分分析表明,根和叶中内生细菌群落结构最为相似。烟草植株内蕴含丰富的细菌资源,受组织结构及成分因素影响表现出器官差异性,即茎根叶。通过对烟草不同部位内生细菌多样性进行研究,可为烟草植物生物活性内生菌株的发掘利用提供理论依据。     

湘南脐橙柑橘黄龙病的PCR检测及内生细菌的分离

为确保湘南脐橙产业发展安全,严格防控柑橘黄龙病,从湘南地区几个脐橙种植园采集柑橘黄龙病疑似病株样品和健康植株样品,利用文献报道的柑橘黄龙病PCR检测常用引物对样品进行分子检测,并从病株组织中分离内生细菌进行分析鉴定。结果表明:在柑橘黄龙病的常规PCR检测中,湘南脐橙总核酸对P400引物的灵敏度最高,是湘南地区脐橙中柑橘黄龙病害常规PCR检测的最佳引物,其次为P535引物,而OI和16S这2对引物的灵敏度较低;对脐橙中柑橘黄龙病病株组织内生细菌的分离鉴定发现,柑橘中可培养内生细菌主要归类为7个属,分别为短杆菌属(Curtobacterium)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、异常球菌属(Deinococcus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、甲基杆菌属(Methylobacterium)、微杆菌属(Microbacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus);其中,LB和1/10LB培养基中的优势菌属为短杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和芽孢杆菌属;而脐橙树叶汁培养基中的优势菌属为短杆菌属、鞘氨醇单胞菌属和微杆菌属。     

采用16S rRNA高通量测序技术分析鲜奶中微生物的多样性

[目的]本研究以16S rRNA为分子标记,采用高通量测序技术分析探讨3种水平体细胞鲜奶样品中细菌种类、菌群多样性和菌群结构。[方法]选取江苏某牧场45头奶牛鲜奶样品,分为健康、亚临床乳腺炎型和临床乳腺炎型3组,并对临床型奶样进行细菌培养鉴定,同时分别提取各组鲜奶样品中细菌总DNA,根据16S rRNA V4—V5区设计引物进行扩增测序,利用生物信息学软件对测序结果进行分析。[结果]对体细胞数1×10~6 mL~(-1)的奶样进行细菌培养,鉴定出奶牛乳腺炎致病菌为无乳链球菌。对序列进行相似性聚类分析,得到394个可操作分类单位(OTU)。通过对OTU的聚类分析发现3组样品之间部分OUT水平存在明显差异。物种及丰度分析显示,门水平上的优势门为厚壁菌门(Firmicutes)、蓝藻门(Cyanobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、放线菌门(Actinobactice);属分类水平上的优势属为芽胞杆菌属(Bacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、海洋杆菌属(Oceanobacillus)、沙雷菌属(Serratia)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和vadinBC27 wastewater-sludge group。其中临床组沙雷菌属和鞘氨醇单胞菌属显著高于其他2组,而海洋杆菌属的相对丰度降低。[结论]该牧场奶牛乳腺炎致病菌为无乳链球菌,为乳腺炎临床的抗生素选择和治疗提供了依据和借鉴。     

氧化钙对西瓜枯萎病及根际细菌群落的调控

测定连作5年和施加氧化钙的西瓜植株定植40 d后的枯萎病发生率,利用Illumina Hiseq高通量测序方法,对土壤进行16S rDNA测序,比较施加氧化钙后西瓜根际土壤的细菌种群特征。结果显示:连作5年土壤的西瓜枯萎病发病率为87.5%,施加氧化钙的发病率为35.4%,氧化钙对西瓜枯萎病的相对防效达59.5%;施加氧化钙的连作土壤细菌多样性指数和细菌丰富度都大于连作的;连作与施加氧化钙都使得土壤的优势菌群发生变化;在属水平上相对丰度排名前30的土壤细菌中,与发病率呈显著正相关的有Mizugakiibacter、Crenotalea、罗河杆菌属(Rhodanobacter)、不动杆菌属(Acidibacter)、戴氏菌属(Dyella)和Bryobacter,呈显著负相关的有黄色土源菌属(Flavisolibacter)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)、出芽单胞菌属(Gemmatimonas)、丰收神菌属(Opitutus)、德沃斯氏菌属(Devosia)。     

基于高通量测序技术研究云南玉米根际微生物群落多样性

研究不同海拔高度和玉米品种类型对玉米根际微生物多样性的影响,利用Illumina Miseq高通量测序对云南不同海拔和品种类型的玉米根际细菌和真菌多样性进行分析。玉米根际细菌和真菌OTU数量和Chao1指数随海拔升高而增加,且饲料玉米高于鲜食玉米,不同海拔和品种类型的玉米根际微生物多样性差异明显。玉米根际细菌的优势菌群为变形菌门、拟杆菌门和放线菌门,鞘氨醇单胞菌属(5.91%)和芽孢杆菌属(8.88%)为玉米根际的优势属,但高海拔地区的玉米根际特异检测到芽单胞菌属(4.34%);水恒杆菌属(6.10%)为鲜食玉米的优势属;玉米根际真菌的优势菌群为子囊菌门、担子菌门和接合菌门,被孢霉(7.42%)、镰孢霉属(10.88%)和青霉菌属(4.03%)是优势属。海拔高度和品种类型是影响玉米根际微生物群落多样性的重要因子。     

烟草连作病害土壤与连作非病害土壤的细菌群落差异性比较

通过对烟草连作病害土壤、连作非病害土壤及新垦植烟土壤细菌群落结构间的差异性比较，为以微生物手段减少烟草连作病害提供一定的理论依据。采用宏基因组高通量测序技术，测定分析三类土壤的细菌群落结构。结果表明，连作病害土壤细菌总OTUs与独有OTUs最多，群落结构相似，同源性高；连作病害土壤中的蓝细菌门（Cyanobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、假单胞菌属（Pseudomonas）、铁矿沙单孢菌属（Arenimonas）、厌氧绳菌属（Bellilinea）、节杆菌属（Arthrobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）、类诺卡氏菌属（Nocardioides）占比显著高于连作非病害土壤和新垦土壤。连作非病害土壤样本间细菌群落结构差异较大，同源性较低。新垦土壤细菌慢生根瘤菌属（Bradyrhizobium）、酸土单胞菌属（Aciditerrimonas）、分枝杆菌属（Mycobacterium）、鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、红游动菌属（Rhodoplanes）5个属所占比例较高，但硝化螺旋菌属（Nitrospira）占比较低，细菌群落结构...     

高通量测序分析蚕豆种子内生细菌的多样性

为了分析蚕豆种子内生细菌的多样性,采用Illumina MiSeq高通量测序技术,从日本大白皮（S18P23.1、 S18P23.2）和启豆2号（S18P24.1、S18P24.2）的种子获得16S RNA V3～V4区有效序列133 855条。将高于97％相似度的序列划分为一个操作分类单元（operational taxonomic unit, OTU）,优化后得到1 598个OTUs。内生细菌种群分析结果表明,拟杆菌门（Bacteroidetes,丰度为30%～33%）、变形菌门（Proteobacteria, 23%～25%）、厚壁菌门（Firmicutes, 23%～25%）和放线菌门（Actinobacteria, 5%～7%）为两个蚕豆品种共有的优势菌门,但属水平的优势菌群在供试蚕豆种子中均有差异。这些结果表明,蚕豆种子具有丰富的内生细菌资源,含有多种具有益功能性状的细菌类群,值得进一步跟踪研究这些益生菌在蚕豆种植到土壤后的变化规律;启豆2号种子中益生菌的种类和丰度高于日本大白皮,值得进一步分离和研究这些益生菌的益生或促生特性,筛选获得在食品和生物肥料等领域有应用潜力的菌株。     

泰山白首乌根际土壤真菌多样性分析

为了解泰山白首乌根际土壤微生物群落结构和组成，充分利用根际微生物资源，采用Illumina MiSeq高通量测序技术，分析测定来自山东省莱芜市莲花山（LW）和济南市历下区（LX）、长清区（CQ）3个产地的泰山白首乌根茎10和20 cm深度根际土壤真菌群落的丰富度和多样性。结果表明，6个样品共得到真菌1 589个OTUs，分属于11门35纲84目142科237属。子囊菌门（Ascomycota）和被孢霉门（Mortierellomycota）是6个样品共同的优势菌门。样品CQ20的群落丰度和多样性最高，样品LX20的真菌群落分布最均匀；随着地下根茎深度加深，真菌微生物群落的丰度和多样性增大。不同产地和根茎深度样品间土壤真菌群落存在显著差异，上述结果为优选根际促生菌、提高仿野生种植技术提供了理论依据。     

杂交玉米农大108及其亲本种子内生细菌群落的多样性

 【目的】 研究不同基因型玉米对其种子内生细菌群落结构的影响。【方法】通过构建16S rDNA文库的非培养方法,对杂交玉米组合农大108正、反交及其亲本种子内生细菌群落多样性进行研究。【结果】 两后代种子内生细菌分别含46和42个OTU,第一优势菌属均为Pseudomonas,丰度分别为34.29%和34.00%;亲本玉米黄C和178种子内生细菌分别含17和11个OTU,第一优势菌属分别为Enterobacter及Burkholderia,丰度分别为49.13%和89.72%。母本玉米黄C种子内生细菌群落中Roseateles、Enterobacter、Pseudomonas及Sphingomonas 4个菌属与父本178种子内生细菌群落中Pseudomonas、Ralstonia、Paenibacillus及Bacillus 4个菌属存在其正交后代种子中。母本178种子内生细菌群落中Acinetobacter、Pseudomonas、Ralstonia、Paenibacillus及Bacillus 5个菌属与父本黄C种子内生细菌群落中Roseateles、Citrobacter、Pantoea、Pseudomonas、Stenotrophomonas及Escherichia 6个菌属存在其反交后代种子中。【结论】遗传相关的杂交玉米农大108正、反交后代其亲本在内生细菌群落结构具有一定的关联性。     

茶树根和叶内生细菌的多样性及来源分析

以碧香早和茗丰作为研究对象,采用高效液相色谱等方法测定茶叶中的化学成分,并运用高通量测序技术对比分析不同茶树品种的鲜叶和根部的微生物群落。结果显示：碧香早和茗丰茶鲜叶的优势细菌门为Proteobacteria、Bacteroidetes等,优势细菌属为Chryseobacterium、Sphingomonas、Rhizobium、Methylobacterium和Aureimonas等;茶树根系中的优势细菌门主要是Proteobacteria、Actinobacteria和Firmicutes等,优势细菌属为Planococcaceae、Rhizobium和Sphingomona;碧香早叶片中内生菌群的丰富度高于茗丰的,茗丰根系中的内生菌丰富度高于碧香早的;茶树根系内生细菌的多样性高于茶鲜叶的;茶树根和叶的内生菌OTU数少于土壤微生物的;同源性分析表明,茶树叶片内生菌主要来源于叶表,而根部内生细菌主要来自土壤;茗丰鲜叶中的茶氨酸、氨基酸、可可碱、咖啡碱、儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、麦芽糖含量均显著高于碧香早的,碧香早鲜叶中的表没食子儿茶素、蔗糖含量和酚氨比...     

高通量测序法分析感杨树灰斑病前后叶围微生物多样性

采用高通量测序法,探究小黑杨(Populus simonii×P.nigra)灰斑病(Coryneum populinum Bres.)病叶与健康叶之间共生细菌和真菌群落结构的差异。结果表明:小黑杨叶片感病前后细菌与真菌的OTU变化巨大,2组样品共有的细菌种类有27个,仅占细菌总数的5.49%,共有真菌种类有22个,仅占真菌总数的0.71%。2组样品中菌落结构基本相同,但相对丰度差异较大,在门水平下,变形菌门(Proteobacteria)是优势细菌,子囊菌门(Ascomycota)是优势真菌。在属水平下,鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)是健康叶中的优势细菌,假单胞菌属(Pseudomonas)是病叶中的优势细菌;枝孢属(Cladosporium)是健康叶中的优势真菌,镰刀菌属(Fusarium)是病叶中的优势真菌,其次是棒盘孢属(Coryneum)。     

2种栽培环境对铁皮石斛内生细菌多样性的影响

  目的  揭示不同栽培环境对铁皮石斛Dendrobium catenatum内生细菌群落结构的影响，解析与石斛多糖含量存在潜在关联的功能菌种。  方法  针对温室人工基质培养和仿野生立木附生培养2种栽培体系下的铁皮石斛C9品系根、茎、叶等各部组织内生细菌，采用Illumina测序平台的Miseq进行高通量测序分析其菌落结构和多样性，同时利用逐步回归法分析内生细菌分布与组织多糖质量分数的关联性。  结果  铁皮石斛在2种栽培环境不同组织中的菌群结构差异显著（P < 0.05），附生立木仿野生环境比温室环境下物种丰富度更高。同时，根部所含分类操作单元（OTUs）数量最多（112~630个），叶部则最少（28~73个）。其中，厚壁菌门Firmicutes（16.7%~34.9%）、拟杆菌门Bacteroidetes（8.7%~35.6%）和变形菌门Proteobacteria（15.9%~42.0%）的OTUs占优势。从菌种生理功能上看，固氮相关的菌种如弗兰克菌科Frankiaceae在树培环境下相对丰度更高，推测可能受树培寡氮环境的影响使固氮菌富集。逐步回归分析结果显示:不动杆菌Acinetobacter在根、茎、叶不同组织中的相对丰度与多糖质量分数变化关联度最大，其次为假单胞菌Pseudomonas。  结论  铁皮石斛内生细菌资源相当丰富，而栽培方式影响菌群分布，且与石斛多糖质量分数具有关联性。     

小豆和绿豆茎基感病部位真菌群落结构研究

为了解小豆和绿豆茎基感病部位的真菌组成,采用Illumina高通量测序对小豆和绿豆茎基感病部位的真菌群落结构进行分析。结果表明,小豆和绿豆6个茎基感病部位真菌群落样品测序优化后共得到231个OTU （operational taxonomic units）,共同OTU为97个。2种作物茎基感病部位真菌群落中共同的优势菌门为子囊菌门（Ascomycota）,优势菌纲为粪壳菌纲（Sordariomycetes）,优势菌目为肉座菌目（Hypocreales）,优势菌科为从赤壳科（Nectriaceae）。对优势菌属分析发现,小豆和绿豆茎基感病部位镰刀菌属（Fusarium）处于绝对优势,相对丰度分别为32.94%和18.38%。Alpha多样性指数结果表明,绿豆茎基感病部位的真菌群落丰度高于小豆茎基感病部位的真菌群落丰度,但二者真菌群落多样性相似,为进一步研究小豆和绿豆茎基感病部位真菌群落的致病机理提供了理论依据。     

不同农用酵素的微生物多样性和群落结构

为分析不同农用酵素的微生物多样性和群落组成,利用高通量测序技术,比较分析了5种菌剂（岛本酵素菌等）、8种液态农用酵素（玉米、蓖麻、黄蒿、木麻黄、青蒿、荆条等秸秆为原材料）、7种固态农用酵素（荆条、黄蒿、青蒿、玉米、鬼针草等秸秆为原材料）的细菌和真菌多样性以及其群落组成。结果表明,岛本酵素菌细菌和真菌的OTU数量分别为292和54;在液态农用酵素中,细菌的OTUs数量为61~467,真菌OTU数量为7~44,由于原材料差异,不同酵素的细菌和真菌群落组成差异较大;固态农用酵素具有较多的OTUs（细菌1 015~1 474,真菌58~93）,显著高于菌剂和液态农用酵素;其中变形菌门（Proteobacteria）、拟杆菌门（Bacteroides）和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度分别为26.0%~47.5%、9.4%~33.3%、10.7%~28.6%,为细菌群落组成中的优势菌门;真菌群落组成上的优势菌门为子囊菌门（Ascomycetes）。综上所述,微生物群落多样性和组成因剂型和材料的不同存在差异,影响程度为剂型>材料,多样性表现为固态>液态。     

放牧与舍饲条件下夏洛莱牛肠道微生物多样性及差异分析

【目的】采用高通量测序技术研究放牧与舍饲条件下夏洛莱牛肠道微生物多样性及差异。【方法】选取新疆塔城地区健康的舍饲夏洛莱牛(CB组)和放牧夏洛莱牛(CG组)各5头,分别采集CB、CG组每头夏洛莱牛的直肠粪便,提取微生物总DNA,通过Illumina HiSeq 测序技术,分析10个粪便样品的菌落结构及多样性。【结果】所有样本共检测出1 089个OTUs(CB:1 044、CG:1 087),归属于12门24纲33目57科170属的细菌。在门水平,厚壁菌门和拟杆菌门在2组中均为优势菌门,其次为疣微菌门、放线菌、广古菌门和变形菌门,在科水平的优势菌依次为瘤胃球菌科、理研菌科、毛螺菌科、消化链球菌科、普雷沃氏菌科、克里斯滕森菌科、拟杆菌科等;其中CB组中拟杆菌门、拟杆菌纲、拟杆菌目、理研菌科、消化链球菌科丰度显著高于CG组(P<0.05),CG组中厚壁菌门、瘤胃球菌科的丰度显著高于CB组(P<0.05)。【结论】舍饲夏洛莱牛和放牧夏洛莱牛肠道微生物结构与组成存在显著性差异,放牧夏洛莱牛肠道微生物具有更强的纤维消化的能力。     

耕作深度与翻压绿肥对植烟土壤细菌群落结构及多样性的影响

【目的】研究不同耕作深度与翻压绿肥对植烟土壤细菌群落特征的影响,以期筛选出适宜贵州福泉黄壤烟区的耕作深度与绿肥品种,为该烟区培肥改土及保障优质生态烟叶生产提供理论依据。【方法】以旋耕深度（浅耕与深耕）和翻压绿肥（油菜、光叶紫花苕、黑麦草）后的0~20 cm耕层烟株根际土壤为研究对象,以无绿肥土壤为对照,采用Illumi...