猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及oppA基因遗传进化分析

【目的】了解福建省猪场猪多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）的流行及oppA基因遗传进化情况。【方法】本研究采用细菌分离培养、生化试验、16S rRNA PCR扩增测序、PCR荚膜分型、oppA基因克隆及相似性分析、动物回归试验等方法对分离菌株进行鉴定和分析。【结果】本研究共分离到10株菌,分离菌在血平板上形成淡灰白色、湿润光滑、奶油露珠状菌落;分离菌株能酵解蔗糖、果糖、麦芽糖和甘露醇,不能分解葡萄糖、枸橼酸盐、乳糖、硫化氢等,与多杀性巴氏杆菌生化特性基本一致;分离菌株16S rRNA序列与GenBank中登录的多杀性巴氏杆菌相似性达99.9%以上,10株分离菌均为多杀性巴氏杆菌;PCR荚膜分型显示,6株分离菌为荚膜A型,4株为荚膜D型;基于oppA基因的遗传进化树显示,10株分离菌均位于同一分支内;动物回归试验结果显示,在24 h内攻毒小鼠死亡率较高（21/30）,分离菌有较强的致病力。【结论】福建省猪场猪多杀性巴氏杆菌流行菌株的荚膜血清型主要是A和D型,且大部分菌株都来源于共同的祖先,本研究结果丰富了猪多杀性巴氏杆菌的流行病学资料,并为该病的防控奠定基础。     

肉雏鹅源多杀性巴氏杆菌分离鉴定与致病性试验

为了鉴定引起肉雏鹅死亡的病原,无菌采集病死肉雏鹅心血、肺脏、肝脏等病料组织中分离到1株病原菌,通过细菌培养特性、形态学观察、生化试验、Kmt2基因序列测序等方法进行鉴定,分离菌株被鉴定为多杀性巴氏杆菌。采用PCR方法、人工感染致病性试验、K-B药敏纸片法分别对分离菌株进行血清型鉴定、致病性检测及耐药性分析。结果显示,多杀性巴氏杆菌血清型为A型,对14日龄肉雏鹅具有很强的致病性,半数致死量(LD_(50))为5.86×10~6 CFU/mL;分离菌株对对头孢曲松、头孢噻呋、恩诺沙星等6种药物高度敏感;对其他药物有不同的程度耐药性。     

鹅源巴氏杆菌的分离鉴定及体外抑菌试验

为了鉴定引起大白鹅死亡的病原,对两只病死的大白鹅进行临床剖检与无菌采集肝脏和心脏进行细菌分离培养。试验通过临床剖检、分离培养、培养特性鉴定、生化试验和16S rRNA PCR等方法进行鉴定,用琼脂扩散法进行药敏试验和抑菌试验,用腹腔注射法进行动物回归试验。结果显示从两只病死鹅的肝和心中分别分离得到4株革兰氏阴性短杆菌(分别标记为BE-X-1、BE-X-2、BE-G-1、BE-G-2);其生化特性分解葡萄糖、蔗糖等产酸不产气,不分解乳糖;分离菌均在1400 bp处出现目的条带,16S r RNA基因序列与多杀性巴氏杆菌同源性最高;药敏试验结果显示分离菌对头孢曲松等药物敏感,对克林霉素等低敏甚至耐受;鸡唾液乳杆菌、猪小肠乳杆菌对分离菌有较好的抑菌效果;试验动物攻毒12~24 h内死亡。分离菌均为多杀性巴氏杆菌,对头孢曲松等药物高敏,具有致病性且致病性较强,试验为鹅巴氏杆菌病的防治提供依据。     

猪源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其荚膜血清型鉴定

从病死母猪肺脏中分离到一株革兰氏阴性小杆菌,用生理生化鉴定、药敏试验、致病性试验和PCR鉴定方法对分离菌株进行鉴定,并用多杀性巴氏杆菌荚膜分型引物对分离株的荚膜血清型进行鉴定。结果表明:本菌为猪多杀性巴氏杆菌,对多种抗生素高度敏感,对小白鼠有强致病性;PCR扩增16SrDNA基因获得1415bp片段,分离株的16SrDNA核苷酸序列与多杀性巴氏杆菌(AY078999)的同源性为99%,因此该分离菌株被鉴定为致病性巴氏杆菌,命名为YN20110122株;本菌分离株为荚膜A型血清型多杀性巴氏杆菌。     

鸭源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为鉴定临床疑似鸭多杀性巴氏杆菌感染肉鸭的病原菌，本试验通过细菌分离培养、菌体形态观察、细菌生化鉴定、16S rRNA基因测序分析、细菌种特异性鉴定、荚膜分型鉴定和动物回归试验进行鉴定，并通过药敏试验和耐药基因检测进行耐药性分析。结果显示，从患病鸭肝脏组织分离到的细菌在鲜血琼脂培养基中呈现表面光滑凸起、灰白色菌落，为革兰氏阴性短小杆菌，瑞氏染色呈两极浓染；生化鉴定结果显示，分离菌能发酵葡萄糖、蔗糖和甘露醇，硫化氢、氧化酶和吲哚等试验阳性；16S rRNA基因序列系统进化树分析显示，该分离菌与多杀性巴氏杆菌聚为一支，同源性 > 99%；细菌种特异性鉴定结果与多杀性巴氏杆菌相符；荚膜分型鉴定结果仅扩增到约为1 050 bp的目的基因片段，与荚膜血清A型相符；动物回归试验显示，该分离菌有较强的致病性；药敏试验结果显示，该分离菌对羧苄西林、氨苄西林、复方新诺明和四环素等12种药物耐药；经耐药基因PCR检测显示，该分离菌携带Sul1、Sul3、tet（X）和Intl1 4种耐药基因，与药敏表型相符。本试验成功分离到1株鸭源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌，为鸭多杀性巴氏杆菌病的防治提供参考依据。     

云南猪源A型多杀性巴氏杆菌 PMJC-1株的分离鉴定

为探明2022年2月玉溪市江川区某规模猪场大批保育猪发病死亡原因，对采集病料进行了细菌分离，从肺门淋巴结分离得到一株菌落表面光滑、湿润、半透明圆形菌株。分离菌株经生化试剂条鉴定为多杀性巴氏杆菌，分离菌株的16S rRNA序列与NCBI GenBank中公布的多杀性巴氏杆菌PM8-6株的同一性达到99%以上，将分离菌株命名为PMJC-1株。荚膜分型结果显示该菌株为荚膜A型多杀性巴氏杆菌，毒力基因检测结果显示该菌含有黏附素、超氧化物歧化酶等6种毒力基因。分离菌株药敏试验表明，其仅对利福平、头孢哌酮、阿莫西林、呋喃妥因、头孢噻吩、大观霉素6种药物敏感，对其余18种药物均耐药。动物致病性试验结果显示该菌株对昆明小鼠具有较强致病性，8只实验组昆明小鼠在接种后72 h内发病死亡5只，其余3只发病后耐过康复。本研究结果可为生猪养殖过程中A型多杀性巴氏杆菌病的防治提供参考。     

兔源多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

为了对疑似感染巴氏杆菌的病死兔进行病原的分离、鉴定并分析其耐药情况，本试验对送检的病死兔进行剖检，结合传统分离培养及16S rRNA和荚膜抗原A(capA)基因的PCR扩增等鉴定病原菌，PCR方法扩增其23个毒力基因，最后进行药敏试验。结果显示，分离菌在血琼脂培养基的菌落特征为光滑、湿润、半透明、灰白色、圆形、露珠状，染色镜检可观察到革兰阴性、两端染色较深的红色短杆菌。PCR扩增及测序结果显示，该分离菌株的16S rRNA和capA基因与多杀性巴氏杆菌Q菌株(GenBank登录号：CP033597)同源性分别为99.86%和100%。23个毒力基因中仅pfhA、oma87、fur、pmHAS基因检测出目的条带，其余19个毒力基因均未检出。该分离菌株对环丙沙星、氧氟沙星、头孢拉定、氨苄西林、卡那霉素、阿米卡星、庆大霉素、红霉素和多黏菌素B共9种药物敏感，对四环素、复方新诺明和克林霉素等耐药。结果表明本试验从病死兔中分离鉴定出1株荚膜血清A型的多杀性巴氏杆菌，可选用环丙沙星和红霉素等进行治疗。该结果可为临床巴氏杆菌病的治疗提供一定的理论依据。     

雁鸭源荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

为鉴定一株从雁鸭脏器内分离到的革兰氏阴性细菌,本研究对该菌进行分离培养、细菌16S rRNA序列比对、动物试验和药物敏感性试验。结果表明该分离菌与多杀性巴氏杆菌(P.mutocida)(AF224297)同源性达99.88%,毒力强,能够致死家兔、小鼠和鸡,对氧氟沙星等药物敏感。分离菌的荚膜抗原血清型特异性基因PCR产物与荚膜血清A型P.mutocida hyaD-hyaC基因同源性达99.9%,确定该菌株为荚膜血清A型P.mutocida。本研究首次从雁鸭体内分离到A型P.mutocida。     

牛荚膜血清A型巴氏杆菌病的分子流行病学调查

本研究针对多杀性巴氏杆菌(Pm)特异性基因kmt1,进化保守基因16S rRNA基因,以及荚膜血清型A、B、D、E和F型对应的荚膜生物合成基因hayD-hayC、bcbD、dcbF、ecbJ和fcbD,设计特异性PCR扩增引物,采用PCR方法扩增相应基因和进行序列测定,并对分离菌株进行分子鉴定和同源性分析。结果显示,来自不同地区的分离菌株均含有Pm种特异性基因kmt1、A型荚膜生物合成基因hayD-hayC和16S rRNA基因。不同地区的分离株,kmt1基因的同源性为100%;A型荚膜生物合成基因hayD-hayC同源性大于99.9%;与国外牛源分离株的hayD-hayC基因的同源性大于98%;不同地区分离株的16S rRNA基因的同源性为100%,而与英国牛源分离株Pm338的16S rRNA基因的同源性高达99.93%。这些结果表明,在我国6个省市流行的牛出血性败血症由同一来源的荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌所致,与英国牛源A型分离株Pm338具有共同的进化来源。     

鸡源巴氏杆菌GZ-TZ2017株的分离及其16S rRNA序列分析

为了探明贵州某肉鸡养殖场突发疾病病因,试验通过解剖、细菌分离、染色镜检、药敏试验、生化试验、16S rRNA的PCR扩增及序列分析等方法对病原进行分析。结果表明:从病鸡内脏中分离得到1株革兰氏阴性、两极浓染的球杆菌,将其命名为GZ-TZ2017;该菌株的培养特性、菌体形态、生化试验特征均与已报道的巴氏杆菌相似;GZ-TZ2017菌株对米诺环素、氧氟沙星和诺氟沙星等抗生素较为敏感,对头孢拉啶、苯唑西林、卡那霉素、青霉素等抗生素耐药;16S rRNA PCR扩增得到大小为1 400 bp左右的目的片段,分离菌GZ-TZ2017与各地分离的多杀性巴氏杆菌的同源性极高,均在99.0%以上;GZ-TZ2017与多杀性巴氏杆菌属细菌属于一个分支,和重庆分离株PM-LK(GenBank登录号为KX579746)、安徽滁州分离株CZ-6(GenBank登录号为KY673151)在同一小分支上,属于禽巴氏杆菌。说明该肉鸡场鸡群感染了禽巴氏杆菌。     

16S rRNA基因测序法鉴定猪多杀性巴氏杆菌的研究

对66株猪多杀性巴氏杆菌的鉴定结果表明,PCR是一种快速、特异、灵敏的病原检测方法。应用能够扩增大多数原核生物16S rRNA基因的通用引物,对猪多杀性巴氏杆菌疫苗株(EO630)和野外分离株的16S基因rRNA进行PCR扩增,以期为分子水平上准确地鉴别猪巴氏杆菌提供依据。     

7株牛源A型巴氏杆菌的分离鉴定及耐药性分析

对2014年沈阳地区患有呼吸系统疾病的育肥牛场进行病原分离,得到7株分离菌,对其进行培养形态及染色观察、病理组织切片观察、动物致病性观察及16S序列分析,初步鉴定为牛多杀性巴氏杆菌(Pm)。利用Pm种特异性引物及荚膜血清特异性引物进行PCR扩增,均得到目的基因条带。对分离菌进行药敏试验的结果显示,5株分离菌株已对阿米卡星、新诺明产生较强耐药性;7株分离菌均对氟苯尼考、恩诺沙星、四环素及氨苄西林敏感。由此确定,分离菌株均为牛荚膜A型巴氏杆菌,且已具有一定耐药性。     

多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其系统进化分析

海南某养殖场的黑山羊出现体温升高、咳嗽、呼吸困难、偶尔伴有腹泻症状。为了诊断,采集病死羊肺脏组织,进行细菌的分离培养。对分离得到的细菌进行形态学观察、生化反应鉴定、细菌16S rRNA测序、特异性引物PCR鉴定、小鼠攻毒试验以及系统进化分析。结果确定该患病黑山羊感染了D型多杀性巴氏杆菌,并确定该菌对甲氧苄啶-磺胺甲噁唑、左氧氟沙星、四环素、庆大霉素、阿莫西林敏感。系统进化分析发现,该株多杀性巴氏杆菌与河北、湖北、重庆等地分离菌株的亲缘关系较近。本试验为海南黑山羊流行性疾病诊断提供了重要的资料。     

牛源荚膜血清型A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及其种特异性基因的序列分析

从病死牛组织中分离到4株致病菌,编号分别为P1、P2、P3、P4。经菌落形态学观察、培养特性、生化反应和小鼠毒力试验,初步鉴定为多杀性巴氏杆菌。参考多杀性巴氏杆菌16S rRNA和种特异性kmt1基因以及荚膜血清型基因A(capA)、B(capB)、D(capD)、E(capE)和F(capF)合成引物,利用多重PCR扩增16S rRNA、kmt1和荚膜血清型基因,对PCR产物测序并进行同源性分析。结果显示,P1～P4都扩增出了16S rRNA、kmt1和荚膜血清型A型基因的特异性目的条带;P1～P4的16S rRNA、kmt1、A型基因序列与Genbank数据库中的多杀性巴氏杆菌相应序列具有高度同源性(99.0%);P2、P3、P4间的16S rRNA基因同源性较高(99.0%),而P1与其它3株(P2～P4)同源性较低,P1～P4间的kmt1基因、荚膜血清型A型的同源性较高(99.0%)。说明本次分的4株病原菌P1～P4均为荚膜血清型A型多杀性巴氏杆菌。     

PCR检测方法在多杀性巴氏杆菌定种中的应用

为修订行业标准《猪巴氏杆菌病诊断技术》（NY/T 564-2002）,改进多杀性巴氏杆菌定种方法,采用16S rDNA基因序列分析法对中国兽医微生 物菌种保藏管理中心（CVCC）保藏的63株猪源多杀性巴氏杆菌进行复核鉴定。63株猪源多杀性巴氏杆菌中有60株菌种与原鉴定结果一致。建立多杀性巴 氏杆菌基于kmtΙ基因的PCR定种方法,对经16S rDNA PCR方法确认为多杀性巴氏杆菌的60株菌进行定种。结果表明,60株菌均扩增出了预期片段,基于 kmtΙ基因的PCR定种方法与16S rDNA PCR方法试验结果相一致。研究结果显示,可将基于kmtΙ基因的PCR定种方法增添至行业标准中,作为原有生化鉴 定方法的补充进行多杀性巴氏杆菌的定种。     

1株致禽霍乱多杀性巴氏杆菌的病原学与分子生物学鉴定

为确定湖南某鸡场鸡群突然发病死亡的原因,对病料进行细菌分离鉴定,对获得的分离菌株G-2进行了病原学和分子生物学的系统鉴定。通过16S rDNA鉴定和Biolog鉴定,表明该病原菌为多杀性巴氏杆菌杀禽亚种;采用荚膜多重PCR分型、脂多糖多重PCR分型和多位点序列分型对其基因型进行了鉴定,结果显示该菌株为荚膜A型、脂多糖L1型、ST129型。利用SPF鸡进行动物回归试验,结果证实该菌株能引起SPF鸡典型的禽霍乱症状,肌肉注射7 CFU活菌可致死78日龄SPF鸡,10 CFU活菌可致死114日龄SPF鸡。结合临床症状和病理变化,表明引起鸡群死亡的病原为多杀性巴氏杆菌。     

牛源马巴氏杆菌的分离鉴定

为了解引起牛肺炎的主要病原,试验从患有肺炎的牛支气管中分离获得一株巴氏杆菌,并对其进行生化鉴定、16S rRNA测序、特异性PCR鉴定及药敏试验。结果表明:分离菌株与马巴氏杆菌(Pasteurella caballi)的生化特性一致;16S rRNA序列与Pasteurella caballi参考菌株ATCC49197的同源性为100%;特异性PCR鉴定为Pasteurella caballi;分离菌株对诺氟沙星、头孢噻吩、四环素等多种抗生素敏感。说明分离菌株为Pasteurella caballi,该细菌同样可以感染牛。     

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱对羊源多杀性巴氏杆菌的快速鉴定

本试验通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)对临床分离的1株羊源多杀性巴氏杆菌进行了快速鉴定,取得了与VITEK2 Compact传统生化方法和16S rRNA测序方法一致的结果。MALDI-TOF MS对分离菌株的鉴定分数为2.371,达到了种水平的鉴定。从分离到纯菌落到获得有效的鉴定结果,MALDI-TOF MS仅需要约30 min,而VITEK2需要约4 h, 16S rRNA测序方法需要至少2 d。因此,MALDI-TOF MS可以实现对临床分离的多杀性巴氏杆菌菌株的快速、准确鉴定,对进一步改善动物巴氏杆菌病的临床诊治具有重要意义。     

新疆石河子规模化牛场多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

为了确定石河子地区某规模化牛场出现呼吸困难、咳嗽、病牛消瘦甚至死亡的病因,本研究以病牛病变组织为研究对象,采用常规细菌分离鉴定和细菌16SrRNA序列分析来鉴定菌种,以及多杀性巴氏杆菌种特异性基因Kmt-1和各个荚膜血清型特异性基因(hyaD-hyaC、bcbD、dcbF、ecbJ、fcbD)PCR扩增来确定细菌的血清型,同时应用纸片扩散法对分离细菌进行药物敏感性试验和小鼠感染试验。结果表明,从病变的肺组织中分离到1株菌落为灰白色、露珠状、不溶血,染色为革兰阴性球杆状细菌,生化鉴定结果符合巴氏杆菌特征,同时16SrRNA序列分析与NCBI上已公布的多杀性巴氏杆菌16SrRNA序列同源性在99%以上;对多杀性巴氏杆菌特异性基因Kmt-1以及各血清型特异性基因PCR扩增只扩增到Kmt-1和hyaD-hyaC特异性基因片段;分离菌株对链霉素、庆大霉素、卡那霉素耐药,对其他30种药物敏感,同时感染小鼠全部死亡。结果显示从病牛体内分离到1株毒力较强的血清A型多杀性巴氏杆菌。     

10日龄肉鸭混合感染新型鸭肝炎病毒和多杀性巴氏杆菌的病原学研究

对1例疑似鸭肝炎病毒和多杀性巴氏杆菌混合感染的10日龄肉鸭采用常规的病毒、细菌鉴定方法和RT-PCR、PCR方法分别进行病毒、细菌的分离与鉴定。病毒鉴定为新型鸭肝炎病毒,细菌鉴定为荚膜血清A型多杀性巴氏杆菌多杀亚种。细菌对SPF鸡的毒力试验结果显示,分离的巴氏杆菌与强毒标准株C48-1毒力相近,为强毒株。细菌对10日龄肉鸭的致病性回归试验结果表明,一定数量的该株巴氏杆菌可导致10日龄雏鸭的感染死亡。结果表明,该批肉鸭为新型鸭肝炎病毒和A型多杀性巴氏杆菌混合感染。这是国内首例从感染鸭肝炎病毒10日龄雏鸭肝脏中分离到多杀性巴氏杆菌。