通过GbF3’H基因单独沉默及其与GbCHI和GbDFR基因共沉默研究其在海岛棉中抗枯萎病功能

【目的】通过沉默海岛棉GbF3’H基因及共沉默GbF3’H、GbCHI和Gb DFR基因,研究其在海岛棉抗枯萎病中的作用。【方法】以海岛棉抗病材料06-146为研究对象,GhCLA1基因为阳性对照,空载体为阴性对照,构建海岛棉TRV2-Gb F3’H沉默载体,协同课题组前期构建的TRV2-CHI和TRV2-DFR载体,利用病毒诱导的基因沉默技术(Virus-induced gene silencing,VIGS)分别进行Gb F3’H基因单独沉默以及GbF3’H、GbCHI和Gb DFR这3种基因共沉默试验。通过实时荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real time-polymerase chain reaction,q RT-PCR)分析各处理样品中基因沉默情况;设置室内接种枯萎病菌试验测定病情指数,分析各沉默材料对枯萎病的抗性差异。【结果】q RT-PCR结果显示,海岛棉GbF3’H基因沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量比空载体对照低,Gb F3’H、GbCHI和GbDFR这3种基因共沉默后其在海岛棉根、茎和叶中的表达量均比空载体对照低。病情指数调查结果显示,野生型<空载体对照相似文献   

海岛棉枯萎病抗性与类黄酮代谢途径基因表达量的相关性

枯萎病是危害海岛棉生产的重要因素之一,研究枯萎病抗性分子机制将为培育抗病海岛棉品种、解决枯萎病对海岛棉的危害问题提供坚实的基础。本研究在前期转录组测序的基础上,对海岛棉枯萎病抗性差异表达基因进行分析(Differentially Expressed Gene,DEG);以7个抗病性表现不同的海岛棉品种为材料,利用qRT-PCR方法研究抗病差异表达基因在接种0~40 h的表达量差异,分析基因表达量与病情指数的相关性。结果表明,DEG分析得出类黄酮代谢通路相关基因与海岛棉枯萎病抗性有关。qRT-PCR分析显示抗病材料中类黄酮代谢通路关键基因的表达量显著高于感病材料。在接菌后多个时间点,类黄酮代谢通路中的关键基因TT7、CHI和DFR在抗病材料中的表达量显著或极显著高于感病材料,其中CHI和DFR基因的表达量与病情指数呈显著负相关。综上所述,类黄酮代谢通路相关基因对海岛棉枯萎病抗性均有影响,且CHI、TT7和DFR基因是关键基因。     

海岛棉枯萎病抗性与类黄酮代谢相关基因表达量的相关

枯萎病是危害海岛棉生产的重要因素之一, 研究枯萎病抗性分子机制将为培育抗病海岛棉品种、解决枯萎病对海岛棉的危害问题提供坚实的基础。本研究在前期转录组测序的基础上, 对海岛棉枯萎病抗性差异表达基因进行分析(DEG, Differentially Expressed Gene); 以7个抗病性表现不同的海岛棉品种为材料, 利用qRT-PCR的方法研究抗病差异表达基因在不同接菌时间点的表达量差异, 并分析基因表达量与病情指数的相关性。结果表明, DEG分析得出类黄酮代谢通路相关基因与海岛棉枯萎病抗性有关。qRT-PCR分析显示抗病材料中类黄酮代谢通路关键基因的表达量显著高于感病材料。在接菌后多个时间点, 类黄酮代谢通路中的关键基因TT7、CHI和DFR在抗病材料中的表达量显著或极显著高于感病材料, 其中CHI和DFR基因的表达量与病情指数呈显著负相关。综上所述, 类黄酮代谢通路相关基因对海岛棉枯萎病抗性均有影响, 且CHI、TT7和DFR基因是关键基因。     

TRV病毒介导的基因沉默体系在新疆陆地棉和亚洲棉中的建立

为研究烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)介导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)技术应用的广谱性,以陆地棉(Gossypium hirsutum)CLA1为标记基因,通过构建基因沉默载体,在新陆早33和亚洲棉(Gossypium arboreum)建立了TRV-VIGS体系。半定量PCR分析表明,与对照相比,TRV侵染的新陆早33和亚洲棉中CLA1基因的表达均被有效抑制,真叶表现出明显的白化症状。同时在45份新陆中系列棉花材料中重复该体系,并且通过控制培养温度来检验温度对VIGS的影响,结果表明,当昼/夜温度分别为23℃/21℃和32℃/28℃时,不同品种的新陆中系列棉花均可以维持不同程度的白化表型。证明,TRV介导的VIGS可以用于室内研究新陆中系列棉花和亚洲棉基因功能。     

四倍体棉花GAE基因家族的鉴定及其在棉纤维发育中的表达分析

【目的】通过对陆地棉及海岛棉GAE基因家族进行全基因组分析,为深入研究GAE基因家族在棉纤维发育中的功能提供理论依据。【方法】利用生物信息学分析软件,对GAE基因家族进行全基因组鉴定,根据转录组数据分析在纤维发育过程中的表达规律。【结果】陆地棉GhGAE家族包含21个成员,海岛棉GbGAE家族有22个成员,分为3个亚组,多数Gh GAEs和Gb GAEs基因没有内含子,共分布在12条染色体上。GAE氨基酸序列保守基序有4个,保守性较强,且GAE蛋白均定位于高尔基体膜。根据GAEs在陆地棉、海岛棉纤维发育不同时期的表达变化,将其分为纤维起始期高表达、纤维伸长期高表达、次生壁增厚期高表达、全时期低表达4类模式。其中GhGAE01、GhGAE02、Gh GAE11、Gh GAE12在陆地棉中高水平表达,GbGAE01、Gb GAE02、GbGAE11、Gb GAE12在海岛棉中高水平表达,推测这些基因可能在纤维发育过程中发挥着重要作用。【结论】上述结果为研究GAE基因家族在棉纤维发育中的功能提供了参考依据。     

擎天凤梨花色素合成关键基因CHS、F3'H和DFR的克隆及表达分析

擎天凤梨‘Ostsra’是一种观赏红色苞片为主的高档盆栽花卉。一般认为植物苞片的呈色物质除叶绿素外多来源于花色素,而CHS、F3'H和DFR是在花色素的合成过程中的关键酶。本研究采用采用简并引物及同源克隆法获得了881 bp的CHS基因,编码276个氨基酸的序列,GenBank登录号为KX364270;采用cDNA全长文库构建、EST批量测序及目标单克隆序列测通法,获得了F3'H和DFR基因。F3'H基因长1 176 bp,可编码325个氨基酸序列,GenBank登录号为KX364271;DFR基因长1 209 bp,可编码167个氨基酸的序列,GenBank登录号为KX364272。采用实时定量PCR法检测CHS、F3'H和DFR在‘Ostsra’苞片呈色过程中的表达变化,结果表明,3个基因在苞片变色过程中(绿苞-半红苞-全红苞)都呈现出递增的趋势,即随着苞片颜色的变深,3基因的表达量逐渐增加,全红状态时,表达量最高,而作为对照的绿叶,表达水平都是最低的。     

应用病毒诱导基因沉默技术研究棉花GhAKT1和GhKT2基因的功能

【目的】本研究旨在揭示棉花钾离子(K~+)吸收机制。【方法】以国欣棉3号和中棉所41为材料,应用病毒诱导基因沉默技术研究棉花K~+通道基因GhAKT1和K~+转运体基因GhKT2的功能。【结果】在低水平供K~+(0.1 mmol·L~(-1))和充分供K~+(2.5 mmol·L~(-1))条件下,沉默GhAKT1和GhKT2基因使棉花幼苗的K~+积累量分别降低15%左右和25%以上。此外,沉默GhAKT1和GhKT2基因导致棉花幼苗对K~+的最大吸收速率和亲和能力出现不同程度的下降。药理学试验结果表明,在外界K~+浓度低于250μmol·L~(-1)的条件下,高亲和系统对棉花K~+吸收的贡献大于K~+通道;而且GhAKT1蛋白可能是1个对NH4+比较敏感的组分。【结论】棉花K~+通道蛋白GhAKT1和K~+转运体蛋白GhKT2具有吸收K~+的功能,而且表现出双亲和吸收K~+的特性,可作为改善棉花钾营养的候选基因。     

转GbNPR1基因提高烟草抗病性

病害是造成烟草减产和品质降低的主要因素,而利用生物技术提高烟草抗病性是解决此问题的有效途径,其中包括利用与植物抗病性密切相关的关键因子如病程相关基因非表达子(non-expressor of pathogenesis-related genes1,NPR1)。本研究利用源于海岛棉的Gb NPR1基因,表皮特异性启动子CUT1和组成型启动子35S构建两个植物表达载体35S-Gb NPR1和CUT1-Gb NPR1,经农杆菌介导法分别转化烟草。T0代及T1代转化植株PCR检测证明,目的基因已整合到核基因组中。T1代植株RT-PCR分析表明,Gb NPR1基因在转录水平得以表达。bar试纸条检测为阳性,证明和Gb NPR1连锁的草甘膦基因能够正常转录和翻译表达。将阳性植株进行烟草病菌赤星病、炭疽病和低头黑病等三种病害的病原菌离体接菌实验,研究结果表明:转CUT1-Gb NPR1载体的转基因烟草虽然较转35S-Gb NPR1载体的烟草对三种病菌的抗性稍低,但较野生型烟草相比具有较高抗性。转Gb NPR1基因的烟草能提高对低头黑病和炭疽病的抗性为首次报道。     

TRV病毒介导的基因沉默体系在棉花中的建立及应用

以陆地棉CLA1基因为标记基因,利用烟草脆裂病毒(tobacco rattle virus,TRV)载体建立基于病毒介导的棉花基因沉默体系(virus-induced gene silencing, VIGS)。病毒RNA2的RT-PCR分析证明,棉花子叶接种TRV病毒后,该病毒可高效扩散到受体的根、茎、叶等器官。利用TRV-VIGS体系同时诱导34份不同来源棉花材料CLA1基因沉默,尽管不同材料间的抑制程度有差异,但均可有效抑制CLA1基因的表达,说明该体系在棉花研究中的广谱利用性。GhMAPKKK基因受黄萎病菌诱导表达, 接种后96 h表达量达到高峰。利用TRV-VIGS体系,成功抑制了棉花GhMAPKKK基因的表达,与对照株相比,抑制后的棉花植株接种黄萎病菌后更易感病,说明GhMAPKKK参与了棉花对黄萎病菌的抗性反应。具有广谱性、灵敏性和高通量等特点的棉花TRV-VIGS体系建立将加速棉花功能基因组研究进程。     

陆地棉和海岛棉的黄萎病抗性遗传研究

以3个海岛棉品种和5个陆地棉品种配制的23个正反交组合的四个分离群体(F1、F2、BC1和BC2)为材料,以中等致病力的安阳菌系接种,研究陆地棉和海岛棉黄萎病抗性的遗传规律。结果表明,海岛棉品种间杂交,F2和BC2抗病和感病单株的分离比例均符合3∶1和1∶1,其黄萎病抗性是由一个显性基因控制;陆地棉品种间F2和BC2的抗病和感病单株的分离比例也均符合3∶1和1∶1,其黄萎病抗性也是由一个显性基因控制。用海岛棉抗病品种与陆地棉抗病品种进行种间杂交,其F2和BC2的抗病株均在95%以上,而用海岛棉抗病品种与陆地棉感病品种进行杂交,其F2和BC2抗病株和感病株的分离比例符合3∶1和1∶1,表明海岛棉和陆地棉的黄萎病抗病基因可能位于同一基因位点。     

棉花CBF基因的克隆及其转基因烟草的抗寒性分析

从中棉12 (Gh12)、中棉36 (Gh36)和海岛棉7124 (Gb7124)品种中克隆并鉴定了棉花的CBF基因,该基因编码一个由184个氨基酸组成的蛋白CBF,该蛋白具有CBF转录因子典型的序列标签“PKRRAGRKKFQETRHP”和“FADSAW”。Southern杂交表明,CBF基因在3个棉花品种中均以基因家族的形式存在。围绕海岛棉7124的CBF基因(GbCBF1)开展的逆境表达谱分析表明,GbCBF1基因受低温、干旱、盐和ABA等多种逆境条件的诱导表达。将GbCBF1基因构建到由强启动子35S和弱启动子NOS这2种启动子控制的植物表达载体pCambia2301上并转化烟草NC89,经过筛选及PCR鉴定,共获得26株转基因烟草。对部分T₁代植株进行的PCR和RT-PCR检测表明,GbCBF1基因可以在烟草中正常转录并遗传。分析表明,在低温下,转基因烟草的电解质渗漏率普遍低于野生型烟草,而游离脯氨酸含量和可溶性糖含量均高于野生型烟草,说明转GbCBF1基因提高了烟草的耐寒性。     

海岛棉不同群体枯萎病抗性分析及评价

棉花枯萎病是棉花种植区常见的一种病害,目前在海岛棉中发病严重,它的发生和发展直接影响到棉花的产量和品质。为揭示海岛棉枯萎病田间发病特征,本研究通过对三个海岛棉不同遗传群体(包括由抗病亲本5 917和感病亲本Pimas-7组配的F2:4群体(P1),由143份海岛棉种质资源构建的自然群体(P2)以及由感病亲本新海14和抗病亲本06-146组配的RIL系群体(P3))的枯萎病抗病表型特征进行田间调查,并分析其在不同世代间的主要遗传规律。结果表明:(1)通过对海岛棉枯萎病发病特征进行分级统计,发现三个群体在花铃期的病情指数和病级均成正偏态分布,P1和P3群体在病级和病情指数分布上出现了超亲材料;(2)通过方差分析发现三个不同群体间的病情指数和病级均存在显著差异,其中P2群体在两个抗病性状上值最高,变异系数最小,P3群体在两个抗病性状上值最低,变异系数最大;(3)通过估算遗传力得出的海岛棉枯萎病抗性的广义遗传力在70%左右,为中等遗传力;(4)对搜集到的143份海岛棉种质资源进行聚类,共分为四大类,其中,新疆自育品种抗病性总体较好。本研究通过比较不同海岛棉种质资源的抗病性,筛选得到一批枯萎病抗病性较强的材料,可以为今后进行海岛棉抗病育种奠定基础。     

棉花GhSKIP35基因的克隆与表达分析

以中植棉KV1 SSH文库为基础,从陆地棉中植棉KV1中克隆出来泛素途径SKIP35基因,命名为GhSKIP35。该基因的开放阅读框全长为1863个核苷酸,编码620个氨基酸,含有1个ANK保守结构域。进化分析表明,Gh SKIP35蛋白与甜橙(Citrus sinensis)的SKIP35蛋白相似性最高。q RT-PCR分析显示:在接种大丽轮枝菌V991菌系后初期Gh SKIP35基因表达量激增,12 h便可达到顶峰,24~48 h逐渐下降,推测它在陆地棉抗黄萎病早期防卫反应中起重要作用。利用VIGS(Virus induced gene silencing)技术,在中植棉KV1中成功地沉默Gh SKIP35基因;对沉默棉株接种大丽轮枝菌V991鉴定显示,其病情指数为50.75,而野生型的中植棉KV1和转化空载体棉株的病情指数分别为9.38和11.54。Gh SKIP35基因沉默后,中植棉KV1对黄萎病的抗性丧失,表明Gh SKIP35基因在陆地棉抗黄萎病的过程中起重要作用。     

棉属D基因组3个野生棉种Bet v1基因鉴定及功能分析

【目的】对棉花D基因组中Bet v 1基因家族进行分析,比较其在不同抗性棉种间的表达模式差异,为深入研究Bet v 1基因在棉花抗黄萎病中的作用提供理论依据。【方法】通过生物信息学方法对D基因组中Bet v 1基因进行鉴定。通过雷蒙德氏棉(Gossypium raimondii,D5)、三裂棉(G. trilobum,D8)和瑟伯氏棉(G.thurberi,D1)转录组和实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)分析Bet v 1基因在黄萎病菌处理下的表达模式。利用病毒诱导的基因沉默技术(VIGS)对Bet v 1基因进行功能鉴定。【结果】[棉花D基因组中包含59个成员,其中57个基因带有内含子,分布于8条染色体上,多数为亲水性蛋白并定位于细胞质。]黄萎病菌胁迫条件下3个野生棉种的Bet v 1基因表达量与其抗病水平一致。将不同表达水平的基因分为3组,其中第3组基因响应黄萎病菌侵染并在抗病棉种瑟伯氏棉中高表达,表明该组基因可能与黄萎病胁迫应答反应有关。从中筛选出高水平表达的Bet v 1基因,在陆地棉中沉默相应的同源基因,棉株感病加重,揭示该基因在棉花抵御黄萎病菌侵染过程中起正调控作用。【结论】响应黄萎病菌胁迫的Bet v 1基因在棉花抗黄萎病复杂的生物过程中至关重要。本研究结果为棉花Bet v 1家族基因的深入研究提供依据,为进一步解析棉花Bet v 1基因的功能奠定基础。     

FIP-fve基因沉默载体构建和金针菇的遗传转化

为了探究金针菇FIP-fve基因对金针菇本身的生物学功能,本研究克隆FIP-fve基因正反片段并构建其RNAi载体,并将其转化农杆菌LBA4404,建立以农杆菌介导的金针菇遗传转化体系。双酶切琼脂糖电泳检测结果表明成功构建了FIP-fve基因的RNAi载体:p TCK303-fve(F)-fve(R),并用液氮转化法获得重组农杆菌转化子。金针菇遗传转化以菌丝体为外植体,潮霉素B(Hygromycin B)和头孢霉素(Cephalosporins)使用浓度分别为9μg/m L和600μg/m L。重组农杆菌浓度OD600为0.5,侵染金针菇菌丝体30 min,共培养培养基AS使用浓度为200μg/m L,共培养25℃3 d,抗性筛选10 d。最终通过潮霉素抗性筛选和PCR检测从60个外植体中筛选得到5个金针菇遗传转化子,转化率为8.33%。经过连续培养,对比观测转化子和野生型金针菇,FIP-fve基因沉默的金针菇转化子菌丝的生长在第3天、第6天和第10天明显慢于野生型金针菇菌丝。初步说明FIP-fve基因对金针菇菌丝体时期的生长发育具有一定调节作用,这为研究金针菇FIP-fve以及FIP对真菌本身生物学功能提供一定研究基础和直接证据。     

干旱胁迫下过表达和沉默Z257 snoRNA基因对水稻耐旱性及表型的影响

研究旨在分析过表达和基因沉默水稻Z257 SnoRNA对水稻耐旱性、农艺性状和品质性状的影响,以转基因品系和野生型对照日本晴为研究材料,通过苗期干旱和抽穗期干旱处理的方法,分析Z257SnoRNA的作用方式。结果表明:过表达Z257 SnoRNA的转基因水稻品系GB日本晴的耐旱性要高于野生型对照日本晴和Z257 SnoRNA沉默的转基因水稻品系CM日本晴,因此Z257 SnoRNA基因应与水稻耐旱性相关;幼苗期干旱胁迫后GB日本晴的根系较野生型日本晴更为强壮,CM日本晴根系最弱;抽穗期干旱胁迫后GB日本晴的农艺性状要好于野生型对照日本晴,CM日本晴农艺性状最劣;GB日本晴较野生型对照日本晴和基因沉默品系CM日本晴有更好的品质,而沉默该基因的品系品质指标受影响最大,品质最劣。Z257 snoRNA与水稻耐旱性高度相关,可以减少干旱胁迫对水稻根系、农艺性状和品质性状的影响,因此该基因可以作为耐旱候选基因使用。     

棉花磷胁迫响应基因GhWRKY6克隆及功能分析

【目的】提高棉花在低磷胁迫下的抗性,挖掘棉花磷胁迫相关功能基因。【方法】用生物信息学方法分析Gh WRKY6基因的结构特征和进化关系;构建基因超表达载体转化拟南芥,分析转基因拟南芥在低磷胁迫下的抗性;利用荧光定量PCR(Real-time quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)分析拟南芥中磷信号途径Marker基因表达量的变化。【结果】以陆地棉cDNA为模板克隆得到Gh WRKY6基因,生物信息学分析表明该基因序列含有一个WRKY保守结构域,是WRKY家族转录因子。在低磷胁迫下,转基因拟南芥与野生型相比,种子萌发速度、主根长度、侧根数目、生物量均低于野生型,而在正常生长条件下两者并无差别。qRT-PCR分析表明GhWRKY6能够影响关键的磷转运蛋白基因的表达。【结论】GhWRKY6作为一个负调控因子参与到植物低磷胁迫响应信号途径中。     

水培条件下病毒诱导棉花基因沉默体系的建立及优化

以国欣棉3号为材料,以棉花GhCLA1为指示基因,探讨了生长温度、重悬液浓度、注射时间、品种等对水培棉花pTRV介导的VIGS沉默效率的影响。结果表明在24℃条件下,出苗后3~5 d内注射能得到较高沉默效率,重悬液浓度对沉默效率没有影响;同时以注射pTRV-GFP作为空白对照可以消除插入片段对植株生长的影响,减小对照误差;水培与土培方式相比能更快更早出现沉默表型,缩短试验周期,并能诱导不同品种棉花材料GhCLA1基因沉默;利用水培棉花TRV-VIGS体系,成功抑制了棉花GhCTR1基因的表达,与对照株相比,抑制后的棉花植株出现矮化表型,说明水培棉花TRV-VIGS体系建立在棉花研究中的广谱利用性。     

一种适于PCR检测病毒诱导基因沉默番茄植株的微量DNA提取方法

【研究目的】为了寻找一种适用于病毒诱导的基因沉默番茄叶片PCR检测的快速、简单、成本低的DNA提取方法。【方法】笔者根据PCR反应的要求,用改良的CTAB法,实现了微量番茄叶片基因组DNA的快速提取。【结果】提取基因组DNA所用的组织量虽少,所得的DNA经过电泳检测虽有降解,但足以用于PCR检测,以其作模板扩增中国番茄黄化曲叶病毒诱导的硫黄素酶(Su)基因沉默植株中病毒组分中的DNAmβ和1.7A,片段大小分别为500bp、1300bp。测序结果证明是相应基因的部分片段。【结论】该方法的材料不需要使用液氮,可以单人大批量提取,并在基因沉默的番茄植株中能稳定而准确的规模化PCR检测。     

棉花CML基因家族成员鉴定与功能分析

【目的】类钙调素(Calmodulin-like,CML)蛋白是1种重要的Ca2+传感器,在调节植物应激反应机制中起重要作用。对CML基因家族进行全基因组学分析,以便深入研究CML基因在棉花逆境胁迫下的作用。【方法】利用生物信息学的方法进行了棉花CML家族成员的鉴定。利用转录组数据和反转录聚合酶链式反应分析陆地棉(Gossypium hirsutum L.)CML基因在盐胁迫下的表达模式。利用病毒诱导基因沉默技术对Gh CML44-2基因进行沉默并进行功能验证。【结果】在陆地棉(Gossypium hirsutum L.)、雷蒙德氏棉(G. raimondii Ulbrich)、亚洲棉(G. arboreum L.)中分别获得了154个、74个、78个CML蛋白。进化树和保守基序分析表明,GhCML蛋白分为8个亚类,都含有保守的EF-hand结构域;在盐胁迫下,107个Gh CML基因在叶和根中有显著的差异表达,且在根和叶中的差异表达模式不同。启动子分析表明,这些基因启动子中存在多种不同的胁迫响应元件;利用病毒诱导基因沉默技术成功沉默Gh CML44-2的棉株相较于对照更加不耐盐。【结论】该研究结果有助于了解棉花CML基因家族的进化与功能,为后续研究其功能提供了一定的理论依据。