刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌检测探针的制备及应用

腐皮综合征是近年来养殖刺参发生的严重疾病.发病时,刺参大批死亡,经济损失惨重.以其主要致病原灿烂弧菌(Vibrio splendidus)DNA为模板,PCR扩增出16S-23S核糖体RNA基因间隔区序列,插入pMD19-T,转化大肠杆菌DH5α并测序.根据该间隔区序列,设计引物扩增177 bp的地高辛标记的探针.该探针对灿烂弧菌呈现特异性,而对其它细菌V. Fluvialis,V. Anguillarum,V. Alginolyticus,Aeromonas hydrophila,V. Harveyi,V. Parahaemolyticus,V. Vulnificus均呈阴性.探针对灿烂弧菌DNA的检出限为6.25 pg, 具有较高敏感度.用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交,灿烂弧菌检出率达100%.结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可用于快速检测养殖刺参腐皮综合征的病原灿烂弧菌.用该方法检测刺参腐皮综合征尚属首次,为刺参腐皮综合征的快速诊断和防治提供技术支撑.     

刺参腐皮综合征重要病原灿烂弧菌DNA的探针制备及应用

腐皮综合征是近年来刺参养殖最重要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失。以其主要致病原灿烂弧菌（Vibrio splendidus）DNA为模板,PCR扩增出16s-23s间隔区序列,将该片段克隆进pMD19-T Vector,转化大肠杆菌DH5a,获得重组质粒转化菌并进行测序。根据序列、设计引物,合成177bp的地高辛标记DNA探针。该探针对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而对其它细菌Vibrio fluvialis、Vibrio anguillarum、Vibrio alginolyticus、Aeromonas hydrophila、Vibrio harveyi、Vibrio parahaemolyticus、Vibrio vulnificus的核酸均呈阴性;探针对灿烂弧菌DNA的检出极限为6.25pg, 具有较高敏感度。应用该探针对人工感染以及从青岛、烟台、威海获取的腐皮综合征发病海参和养殖水体进行斑点杂交探针检测,其检出率均为100%。研究结果表明,该探针具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参“腐皮综合征”重要病原灿烂弧菌。该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断、疾病防治和养殖生产提供技术支撑和参考。     

应用PCR方法检测刺参腐皮综合征病原——灿烂弧菌

腐皮综合征是近年来刺参养殖最主要的疾病,导致刺参大批死亡和惨重的经济损失.根据其主要致病原灿烂弧菌(VibrioQQQsplendidus)的16S～23S间隔区序列,设计特异性引物,利用PCR技术,从纯化的V.splendidus DNA中成功地扩增出产物大小为177bp的DNA片断,并对此方法的灵敏度和特异性进行了研究.结果表明,PCR技术对V.splendidus DNA的检测灵敏度为0.5pg,并且对灿烂弧菌的DNA呈现特异性,而与其他细菌V.Fluvialis、V.Anguillarum、V.Alginolyticus、Aeromonas hydrophila、V.Harveyi、V.Parahaemolyticus、V.Vulnificus的DNA均无交叉反应.应用PCR技术对人工感染的以及取自青岛、烟台和威海的腐皮综合征发病海参进行检测,其检出率均为100%.研究结果表明,PCR方法具有良好的特异性和敏感性,可成功用于快速检测养殖刺参腐皮综合征原灿烂弧菌.在国内,该方法应用于刺参腐皮综合征的检测尚属首次,它将为刺参腐皮综合征的快速诊断及防治提供又一新的方法.     

养殖刺参腐皮综合征 2 种致病菌间接荧光抗体快速检测方法

以养殖刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征的2种致病菌:灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为抗原,分别制备兔抗血清。以载玻片为介质,建立了2种病原菌的间接荧光抗体检测技术(IFAT)。交叉反应、阻断试验和吸收试验结果均表明本方法特异性强。对人工感染实验中的养殖水体及发病刺参溃烂组织检测,可以检出水体和患病刺参溃烂组织中的相应病原菌,病原菌被染成明亮的黄绿色,检测灵敏度2.4×104cell/mL。冰冻切片检测结果显示,在刺参肿胀嘴部与溃烂肌肉处有大量染成黄绿色的细菌颗粒。结果表明:采用IFAT可以对刺参腐皮综合征2种致病菌进行准确快速的检测。该方法的建立对刺参腐皮综合征的流行病学调查及快速诊断具有重要意义。     

仿刺参腐皮综合征病原灿烂弧菌RPA-Cas13a检测方法的建立

为预防和控制灿烂弧菌引发的仿刺参腐皮综合征，促进仿刺参养殖业的健康可持续发展，利用LwCas13a中特异性CRISPR RNA(crRNA)与靶RNA结合后可激活Cas13a蛋白对外源RNA分子附属切割活性的特征，结合重组酶介导的聚合酶扩增技术(RPA),建立1种针对灿烂弧菌gyrB基因的快速、灵敏、特异的定量检测方法——RPA-Cas13a。RPA-Cas13a可实现在37℃恒温下、60 min内对灿烂弧菌的快速实时检测。灵敏度测试结果显示，RPA-Cas13a检测限为550拷贝/μL(gyrB),与荧光定量PCR的检测灵敏度水平一致；特异性测试结果表明，RPA-Cas13a对创伤弧菌、哈维氏弧菌、鳗弧菌等其他弧菌及产黑假交替单胞菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌等常见水产动物病原菌均无交叉反应，特异性较强。RPA-Cas13a方法对仿刺参体表黏液(32份)、养殖池塘水体(15份)和表层沉积物(10份)等57份环境样本的阳性检出率为8.77%,与传统荧光定量PCR方法的检出一致性高(Kappa=1.00),无统计学差异(P>0.05)。试验结果表明，灿烂弧菌的RPA-Cas13a...     

福建海区网箱养殖刺参“腐皮综合症”病原分析与鉴定

2011年冬季,福建省宁德市霞浦县海区网箱养殖刺参发生"腐皮综合症",并伴有死亡现象出现。刺参的发病症状表现为:厌食、排脏、身体萎缩、体表局部溃烂乃至大面积溃烂。从患病刺参病灶处分离得到两种优势细菌CS1和CS2。经人工回接感染实验证明两种菌对健康刺参都具有较强的感染性,且感染病参的症状与自然发病刺参的症状相同。通过生理生化试验、16S rDNA序列分析及系统进化树分析,结果表明两株菌分别与灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)相似。菌株CS1与灿烂弧菌的亲缘关系最近,相似率达到99%,菌株CS2与假交替单胞菌的亲缘关系最近,相似率达到95%。菌株CS1可鉴定为灿烂弧菌,菌株CS2可鉴定为假交替单胞菌。另外,在患病刺参呼吸树膜和腔体内发现大量后口虫(Boveria sp.)。所以导致本次刺参"腐皮综合症"的原因可能是致病性细菌和寄生虫共同作用的结果。本文首次揭示了该地区"腐皮综合症"导致养成刺参大规模死亡的致病原因,对刺参病害防治和健康养殖具有重要的指导意义。     

养殖刺参腐皮综合征病原菌的分离与鉴定

2003年春季，山东省青岛地区刺参养殖场暴发了较为严重的传染性疾病一“腐皮综合征”，该病引起的死亡造成约30％的损失。养殖刺参的发病症状表现为：厌食、摇头、肿嘴、排脏、身体萎缩、口部溃烂乃至体表大面积溃疡。从患病个体溃疡部位分离得到一种优势细菌KL-1，KL-1经人工回接感染实验证明对健康刺参具有较强的致病性，且感染病参的症状与自然发病海参的症状相同。通过形态学、生理生化和16S rDNA分子生物学方法对该菌进行的分类鉴定表明，导致养成刺参“腐皮综合征”的致病菌是灿烂弧菌（Vibrio splendidus）。本文首次揭示了该地区“腐皮综合征”导致养成刺参大规模死亡的致病原因，对刺参病害防治和健康养殖具有重要的指导意义。     

几种消毒剂对养殖刺参"腐皮综合征"主要致病菌杀灭试验的研究

刺参“腐皮综合征”（俗称化皮病）是当前养殖刺参的最主要疾病,死亡率可达90%以上,属急性死亡,越冬保苗期幼参和养成期海参均可被感染发病。经研究证实,灿烂弧菌Vibriosplendidus和假交替单胞菌Pseudoalteromonas nigrifaciens是该病的主要致病原。作者通过漂粉精、溴氯海因、PVP-I、过氧化氢、双链季铵盐络合碘和生石灰6种消毒剂对灿烂弧菌和假交替单胞菌的定性杀灭实验发现,上述6种药物对腐皮综合征的病原菌都有明显的杀灭作用。     

海水养殖鱼类弧菌病的研究进展

综述了由鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、灿烂弧菌等弧菌引起的海水养殖鱼类弧菌病的典型症状、病原学、病理、检测技术以及防治等方面的研究进展。笔者对弧菌病的防治方法提出了一些有益的见解,另外对弧菌病的研究方向也进行了探讨和展望。     

夏季保苗期刺参(Apostichopus japonicus)腐皮综合征病原菌的分离鉴定及其致病阈值

2013年夏季山东地区某刺参育苗场处于保苗期的刺参苗种暴发 腐皮综合征疾病,表现为附着力下降、棘刺顶端溃烂、排脏、表皮溃疡和自溶等症状。自患病个体病灶组织分离优势细菌,并利用形态学观察、生理生化测定、回接感染、16S rDNA基因序列分析等方法完成致病原的鉴定。此外,通过对发病前后养殖系统中优势菌丰度的变化,追踪确定了所分离病原菌的致病阈值。结果显示,从患病参苗体表病灶处分离的一株优势菌HP130917A-1,经回接感染证实,该菌株具有较强的致病力,其对刺参苗种的半致死浓度为1.2×106 CFU/ml。生理生化结合分子鉴定表明,该菌株为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)。此外,完成了患病池保苗期间池水和附着基表面微生物菌群结构动态分析,共分离得到了6种主要优势菌,分别为溶藻弧菌、需钠弧菌(Vibrio natriegens)、副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和马胃葡萄球菌(Staphylococcus equorum)。溶藻弧菌一直是养殖系统中优势度最高的种类,且随着附着基在保苗池中时间的延长,其在附着基表面沉积物中的浓度越来越高。到第50天时,浓度达到8.97×106 CFU/cm2。而此时系统中参苗开始暴发腐皮综合征疾病,可将此浓度视为该病原的致病阈值。因此,在夏季保苗过程中应加强养殖系统中弧菌总数的监测,制定适宜的附着基更换频率,建立和优化刺参保苗工艺,以期为刺参苗期疾病防控和优化健康养殖管理提供理论依据和参考。     

仿刺参幼体烂胃病及其致病原鉴定

山东、辽宁两省在仿刺参（Apostichopus japonicus）苗种培育期间的5-7月，耳状幼体易发生一种以胃壁增厚、萎缩、溃烂为主要特征的“烂胃病”。从患烂胃病的耳状幼体中分离到1株细菌LW-1，人工回接感染实验证实其具有较强的致病性，并与自然发病症状相同。通过API半自动化鉴定和常规的生理生化试验的结果表明，LW-1具有弧菌属的特征，其表型特征与灿烂弧菌（Vibrio splendidus）相似。对该菌株16S rRNA基因序列分析和构建系统发生树。结果显示，菌株LW-1与灿烂弧菌的亲缘关系最近，相似率达到99．8％。菌株LW-1可鉴定为灿烂弧菌，并视为耳状幼体烂胃病的致病原之一。通过对多起仿刺参苗期烂胃病的调查研究表明，烂胃病病原也具有多样性和复杂性，并与投喂老化腐败的单胞藻饵料有关。     

养殖刺参“化板症”病原菌的分离与鉴定

本研究对辽宁4家刺参育苗场患“化板症”的稚参进行了病原学分析,从患有“化板症”的稚参体表病灶处分离得到一株优势菌Aj2010072802A90.人工回接感染试验证实,该细菌能使稚参发生厌食、萎缩、降低附着力、溃烂、死亡等现象,具有较强的致病性,为此次“化板病”的病原菌.在此基础上,利用细菌形态观察、生理生化及16S rDNA分子生物学方法对该菌株进行了鉴定,结果显示,该菌为副溶血弧菌Vibrio parahaemol yticus.这是副溶血孤菌导致海参感染的首次报道.此外,本研究针对该病原菌进行了药敏学测试,证实所分离的副溶血弧菌菌株对氟苯尼考等药物高度敏感,相关研究结果将为刺参疾病防控和健康养殖提供了理论依据和技术支撑.     

养殖刺参溃疡病病原学研究

自2002年冬季以来,山东、辽宁等省的养殖刺参几乎每年冬天都大规模爆发溃疡病。本文研究了刺参溃疡病的特征和症状,从病参体表和体内分离出优势菌,经回归感染证实其就是引发本次刺参溃疡病的病原菌。对病原菌进行鉴定发现,该菌革兰氏染色呈阴性,电镜下观察呈短杆状,极端单鞭毛,综合研究该菌在形态、生理生化等方面的特性,确认分离到的病原菌为交替假单胞菌,交替假单胞菌作为养殖刺参的病原菌在国内外属首次报道。     

仿刺参MyD88依赖途径基因的序列比较和表达分析

为探索仿刺参体内免疫调控机制,对TLR信号通路MyD88依赖途径中Toll、MyD88、IRAK4、TRAF6、P105和Rel的氨基酸序列保守结构域进行了比较分析,找到上下游基因之间可能的互作位点。采用实时荧光定量PCR的方法检测仿刺参体腔细胞中这6个基因在灿烂弧菌刺激后4个时间点的表达模式。试验结果显示,Toll在12 h表达小幅上调,在其他时间点都处于被抑制的状态;MyD88和TRAF6的表达模式基本一致,在12 h表达水平最高;IRAK4在12 h表达上调,在48 h恢复到初始状态;P105和Rel是NFκB的两个同源物,具有相似的结构域,并且这两个基因表达模式一致。通过基因序列和表达模式的对比分析发现,仿刺参体内存在一条高度保守的TLR信号通路。在应对灿烂弧菌入侵时,该通路上的6个基因协同合作参与了机体信号转导和免疫应答的过程。     

灿烂弧菌的疏水性和生物被膜形成能力

以仿刺参化皮病病原菌—灿烂弧菌(Vibrio splendidus)AP622为试验菌株,研究了培养材料、培养时间、培养基、葡萄糖浓度对菌株生物被膜形成能力的影响,证实鞭毛和菌毛介导的运动性,同时比较了浮游细菌与形成生物被膜的细菌对抗生素的敏感性,并研究了菌株的疏水性。结果表明,菌株AP622为高疏水性和高生物被膜形成菌株,在聚氯乙烯为培养材料、含葡萄糖浓度为0.5%、LB培养基中形成的生物被膜最多,生物被膜形成周期为24 h。菌株AP622明显表现出鞭毛介导的群集性和Ⅳ型菌毛介导的颤搐等运动力。生物被膜中的菌株AP622对抗生素的抵抗力明显强于浮游细菌,其最小抑菌浓度(MIC)是浮游细菌的32倍。综上所述,菌株AP622具有很强的疏水性和高生物被膜形成能力,判断其具有很强的黏附力,同时具有明显的抗药性。     

刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘环境中优势益生菌筛选及其特性分析

2014年12月-2015年12月,在大连地区刺参(Apostichopus japonicus)大水面养殖池塘进行了春、夏、秋、冬四季有益菌分离筛选,从其水体和底泥中共分离得到66株细菌.以刺参“腐皮综合征”主要病原菌——灿烂弧菌(Vibrio splendidus)和假交替单胞菌(Pseudoalteromonas nigrifaciens)为指示菌进行拮抗作用实验,利用选择培养基对菌株产淀粉酶和蛋白酶的能力进行测定,最后通过安全性实验得到潜在益生菌株YQ-2.结果显示,该菌株对灿烂弧菌和假交替单胞菌有较强的抑制作用,抑菌圈分别达到22 mm和24 mm;对淀粉和蛋白选择培养基水解圈的直径达到22 mm和36mm.安全性实验显示,该菌株无论是在108 CFU/ml浸浴还是投喂108 CFU/g的粉末饲料感染,30 d内供试刺参没有发病和死亡现象,健康程度好,且相对于对照组的体重明显增长,108 CFU/g粉末饲料投喂组的相对增长率达到39.31％.此外,本研究对YQ-2菌株的生理生化指标、16S rDNA序列进行了分析,其同源性与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strain KLP2015相似度达99％,故将该菌株鉴定为枯草芽孢杆菌.该株枯草芽孢杆菌在大水面刺参池塘四季水体中数量为140-280 CFU/ml,高于其他菌株;同时,该菌株在水体中还具有较高的优势度,优势度分别为4.2％、3.5％、2.6％、4.6％,冬、春季节的优势度明显高于夏、秋季节;它属于土著分离菌株,对引起刺参腐皮综合征的2株病原菌具有较强的抑制作用,这对刺参大水面生态养殖具有较大的应用潜力.     

刺参(Apostichopus japonicus)保苗期“肠炎病”及其治疗方法

对2014年3月山东省蓬莱某刺参(Apostichopus japonicus)保苗场患“肠炎病”的刺参进行了临床症状和组织病理学观察以及病原菌分离与鉴定,利用氟苯尼考为治疗药品,以脏壁比、增重率和特定生长率为评判指标,探讨了3种不同用药方式(口服、药浴、口服+药浴)对刺参保苗期“肠炎病”的治疗效果.结果显示,刺参“肠炎病”症状表现为体色发黑,附着能力弱,摄食和活动能力差,解剖后可见肠道内食物不连续,肠腔内有大量黄白色粘液或浓状物质,肠道壁变脆、韧性差且易断裂,显微镜下观察到肠道存在大量细菌;组织病理学显示,患病刺参肠道绒毛膜散乱、粘膜层溃散,结缔组织散乱,且与肌肉层分离较明显.自刺参肠道处分离出优势度最高的细菌In-1菌株,人工感染实验证实,该菌为刺参“肠炎病”致病菌,该致病菌主要来源于饲料藻粉.利用细菌形态观察、生理生化和分子生物学方法(16S rDNA和gyrB)鉴定该菌株为哈维氏弧菌(Vibrioharveyi).该菌株对头孢三嗪、阿奇霉素、强力霉素和氟苯尼考等12种药物高度敏感.不同用药方式的治疗效果显示,使用氟苯尼考药浴可获得最佳治疗效果,刺参经药浴治疗后增重率达(24.23±0.41)％,特定生长率达(0.77±0.01)％/d.本研究可为刺参疾病防控和健康养殖提供理论依据和技术参考.